阿爾茨海默病與維生素D受體基因遺傳變異的關(guān)聯(lián)分析

史曜維， 莊曉偉， 朱 磊， 王稀琛， 劉 寒

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)，又稱老年性癡呆，是一種不可逆的中樞神經(jīng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降、精神癥狀和行為障礙、日常生活能力的逐漸下降[1]。AD發(fā)病隱匿，病程長且預(yù)后較差，目前已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的第3位危害人類健康的重要慢性非傳染性疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球范圍內(nèi)已有超過3500多萬的AD患者[2]，并且這個數(shù)字還會以每3 s增加1名的速度上升。中國人口老齡化日益嚴(yán)重，AD已成我國人民健康的巨大挑戰(zhàn)。AD可能是一組異質(zhì)性疾病，在多種因素(包括環(huán)境因素、遺傳因素以及社會心理因素)的作用下才發(fā)病。多項臨床實驗研究報道了AD患者體內(nèi)普遍存在維生素D缺乏的現(xiàn)象[3，4]。此外，基礎(chǔ)研究亦發(fā)現(xiàn)維生素D在AD的病理過程中發(fā)揮重要作用，然而，其具體機制尚不清楚。維生素D與維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)結(jié)合而發(fā)揮作用。國外已有關(guān)于VDR基因遺傳多態(tài)與AD發(fā)病關(guān)聯(lián)研究的探索。Gezen-Ak等[5]在高加索人群中首次發(fā)現(xiàn)了VDR基因ApaI位點多態(tài)性與AD的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。目前，在我國漢族人群中尚未開展AD與維生素D受體基因遺傳變異的關(guān)聯(lián)分析。為此，本研究結(jié)合國外已有的研究進(jìn)展，采用基于醫(yī)院的病例對照研究，探討AD與維生素D受體基因遺傳變異的關(guān)聯(lián)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 AD組：隨機選取于2013年1月-2017年12月在上海市靜安區(qū)精神衛(wèi)生中心門診收治且診斷為AD患者263例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均符合NINCDS/ADRDA的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡18～70歲；(3)自愿作為研究對象，保證完成研究過程。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他非AD癡呆患者；(2)年齡在18歲以下或70歲以上；(3)有腦創(chuàng)傷、腦損害病史，或正在服用抗精神病藥物。所有研究均為無血緣關(guān)系的人群，且排除孕婦、哺乳婦女者。健康對照組：選自本單位同時期參加體檢的健康人群591例，按照年齡、性別等因素與AD組相匹配。本研究獲得了本單位倫理委員會的批準(zhǔn)，且嚴(yán)格遵守倫理學(xué)的各項規(guī)定。

1.2 調(diào)查方法 參照相關(guān)文獻(xiàn)自行設(shè)計《AD調(diào)查表》進(jìn)行現(xiàn)場詢問調(diào)查，在研究對象知情同意的前體下由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查人員對研究對象進(jìn)行詢問調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括基本情況(年齡、性別、吸煙、飲酒等);既往疾病史(慢性疾病史、傳染病史、其他疾病史等)。

1.3 實驗方法 經(jīng)知情同意后，抽取研究對象EDTA抗凝靜脈血5 ml，并在24 h內(nèi)4000轉(zhuǎn)離心10 min，將靜脈血分離成血清層、白細(xì)胞層和紅細(xì)胞層，分裝于1.5 ml凍存管，置-20 ℃貯存。血清25(OH)D3水平的檢測采用ELISA法，試劑盒購自上海斯凱科技有限公司。所有實驗的具體操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。從NCBI、HapMap等數(shù)據(jù)庫中尋找和確認(rèn)VDR基因的SNPs位點，選擇在中國人群具有較高頻率(MAF≥ 5%)，再結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)報道[5～7]，最終確定了FokI和ApaI兩個位點。運用ABI公司設(shè)計的TaqMan-MGB熒光探針實時定量PCR法檢測FokI和ApaI位點基因型，F(xiàn)okI位點野生純合型為FF，雜合型為Ff，突變純合型為ff，ApaI位點野生純合型為AA，雜合型為Aa，突變純合型為aa。探針和引物均委托上?？七~生物技術(shù)公司設(shè)計。反應(yīng)在ABI 7900 PCR儀中進(jìn)行，采用SDS 2.3軟件讀取檢測數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用EpiData 3.10、SAS 9.1.3、SPSS 17.0和PHASE 2.0軟件對調(diào)查和實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，健康對照和AD組中性別、吸煙、飲酒分布情況采用卡方檢驗，年齡分布差異采用t檢驗，血清25(OH)D3水平分布不符合正態(tài)分布，故采用秩和檢驗方法。VDR基因位點在人群中分采用多因素Logistic回歸分析。本研究的檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，當(dāng)P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的一般情況 本研究共納入263例AD患者和591例健康對照者。兩組人群在性別和年齡分布上無統(tǒng)計學(xué)差異(P值分別為0.58和0.28)。血清25(OH)D3水平在兩組間的分布差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(見表1)。

2.2 VDR基因SNPs位點多態(tài)性與AD遺傳易感性的關(guān)系 多因素Logistic回歸分析顯示：在調(diào)整年齡、性別等因素后，與FF基因型相比，F(xiàn)okI位點的Ff可以顯著增加個體AD的發(fā)病風(fēng)險(調(diào)整OR=1.65，95%CI=1.18～2.32)；我們并沒有發(fā)現(xiàn)ApaI位點多態(tài)性與AD的發(fā)病風(fēng)險存在顯著關(guān)聯(lián)。顯性模型顯示：與FF基因型相比，F(xiàn)okI位點的變異基因型Ff/ff可以顯著增加AD的發(fā)病風(fēng)險(調(diào)整OR=1.61，95%CI=1.16～2.21)，而ApaI位點Aa/aa基因型與AA相比，并未發(fā)現(xiàn)該基因型與AD發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)(調(diào)整OR=1.17，95%CI=0.87～1.57)(見表2)。

2.3 單倍型分析 FokI和ApaI兩個位點組成的單倍型共有4中形式，即FA、Fa、Af、af。研究結(jié)果顯示與fa單倍型相比，F(xiàn)a單倍型在AD組的分布顯著低于健康對照組(調(diào)整OR=0.66，95%CI=0.51～0.85)(見表3)。

2.4 VDR基因FokI位點基因型分布與血清25(OH)D3水平的關(guān)系 采用方差分析方法，分析VDR基因FokI位點基因型分布與血清25(OH)D3水平的關(guān)系。結(jié)果顯示，在AD組和健康對照組中，F(xiàn)okI位點不同基因型分組中血清25(OH)D3水平有統(tǒng)計學(xué)差異(F=3.15，P=0.04)(見表4)。

表1 AD組與健康對照組之間一般情況的比較

注：*25(OH)D3在AD組合健康對照組中的分布存在統(tǒng)計學(xué)差異

表2 VDR基因多態(tài)性與AD遺傳易感性的關(guān)系

注：調(diào)整因素分別為年齡、性別、吸煙和飲酒。*基因型在AD組合健康對照組中的分布存在統(tǒng)計學(xué)差異

表3 VDR基因SNP位點單倍型分析與AD發(fā)病的關(guān)聯(lián)

注：調(diào)整因素分別為年齡、性別、吸煙和飲酒。*單倍型在AD組合健康對照組中的分布存在統(tǒng)計學(xué)差異

表4 兩組人群中FokI不同基因型血清25(OH)D3水平分布差異

注：*在AD組和健康對照組中，F(xiàn)okI位點不同基因型分組中血清25(OH)D3水平有統(tǒng)計學(xué)差異

3 討 論

目前，關(guān)于AD的發(fā)病機制還處于研究階段，但遺傳因素已被證實在AD的發(fā)病過程中起到重要作用。其中，載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因、補體受體1(complement receptor 1,CR1)基因已相繼被證實與AD的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)[6，7]。隨后，全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)、Meta分析等研究也發(fā)現(xiàn)和驗證了一系列基因遺傳變異與AD的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。迄今為止，僅有少數(shù)國外研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性可能與AD發(fā)病存在關(guān)聯(lián)[8，9]。本研究首次在漢族人群中探討了VDR的2個多態(tài)性位點(FokI和ApaI)與AD發(fā)病的關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)FokI位點多態(tài)性可能與AD的發(fā)病發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。

維生素D除了可調(diào)節(jié)血清鈣水平外，還參與機體抗氧化水平、減輕抗氧化水平、清除自由基以及保護(hù)神經(jīng)元等反應(yīng)[10]。因此，機體血清維生素D水平可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展等過程。此外，維生素D與膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成和表達(dá)也有關(guān)，這更加提示維生素D可能對退行性神經(jīng)病變有一定的應(yīng)用價值。多項研究發(fā)現(xiàn)，AD患者血清維生素D水平普遍低于健康人群[3，4]。本研亦發(fā)現(xiàn)AD患者血清維生素D水平低于健康對照者，表明機體血清維生素D水平確與AD的發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)，且AD患者普遍存在缺乏維生素D的現(xiàn)象，這對AD臨床診斷具有一定的指導(dǎo)意義。

VDR作為一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子在腦組織中廣泛表達(dá)，主要與維生素D形成維生素D-VDR的復(fù)合物，后者與存在于靶基因序列上的反應(yīng)元件(vitamin D response element,VDRE)結(jié)合反應(yīng)物，從而改變靶基因mRNA的水平[11]。VDR可能通過調(diào)節(jié)維生素D生物學(xué)功能間接影響AD的發(fā)病，而VDR的表達(dá)受控于VDR基因多態(tài)性。VDR基因可表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，其基因多態(tài)性直接影響著維生素D與其受體結(jié)合的親和性[12]，從而可能影響著AD的發(fā)病、進(jìn)展以及預(yù)后。Gezen-Ak等[5]首次開展了VDR基因變異與AD發(fā)病關(guān)聯(lián)的研究，發(fā)現(xiàn)了ApaI位點多態(tài)性可能與AD的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。隨后，Khorram Khorshid HR等[8]繼續(xù)在晚期AD患者中檢測VDR基因其他位點基因型的分布情況，未發(fā)現(xiàn)FokI、TaqI、BsmI等位點與AD的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。這一研究結(jié)果與本次研究結(jié)果完全相反。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)FokI位點的Ff可以顯著增加個體AD的發(fā)病風(fēng)險，其變異基因型Ff/ff亦可顯著增加VD的發(fā)病風(fēng)險。然而，未發(fā)現(xiàn)ApaI位點多態(tài)性與AD的發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。與Gezen-Ak等研究結(jié)果不一致的原因可能是由于基因在不同人群中分布差異導(dǎo)致。Khorram等[13]在伊朗人群中也未發(fā)現(xiàn)ApaI位點多態(tài)性與AD的發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)，這一結(jié)果與本研究一致，可能也是由于伊朗人群與漢族人群同為亞洲人群。在單倍型研究中，我們亦發(fā)現(xiàn)，與fa單倍型相比，F(xiàn)a單倍型在AD患者中的分布顯著低于健康對照組，由此可見，F(xiàn)okI位點多態(tài)性在VDR基因變異中發(fā)揮著重要作用，且這種作用在一定條件下起到主導(dǎo)作用。

綜上，VDR基因變異對VD遺傳易感性可能有不可忽視的作用，其可影響VD發(fā)生、發(fā)展的臨床結(jié)局。本研究在該領(lǐng)域尚屬首次，也存在一些不足，如樣本量不夠多、研究對象全部來自醫(yī)院，存在選擇偏移等。因此，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，在其他人群中進(jìn)行驗證。除此之外，環(huán)境相關(guān)的因素與遺傳因素聯(lián)合作用對VD致病機制中的影響值得深入探索。