脾寒草生物活性成分的提取和探究

伍勇 王志明 薛飛龍

摘 要：文章以采自四川涼山州的脾寒草為原料，通過不同工藝對脾寒草生物活性成分進行提取，探究脾寒草生物活性成分，并對其活性成分進行定性與定量研究，以為脾寒草資源的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。研究的主要內(nèi)容與結(jié)果如下：①采用外標法，通過HPLC對脾寒草粗提物進行初步定性，結(jié)果表明，組分Ⅰ為桃葉珊瑚苷。②以桃葉珊瑚苷提取率為最終的考量指標，探討提取工藝對生物活性成分提取的影響。實驗結(jié)論是，最佳方法是酶輔助提取法，工藝條件為乙醇濃度80%、料液比1∶10（g∶ml）、提取溫度40℃、酶法提取時間為60min，總桃葉珊瑚苷提取量可達3.654mg/g。

關(guān)鍵詞：脾寒草；桃葉珊瑚苷；抗氧化活性；高效液相色

脾寒草學(xué)名直立婆婆納（Veronica arvensis L.），玄參科婆婆納屬植物，全體具細軟毛，莖直立，或下部略偃伏，高10～30cm，一年或二年生草本，原產(chǎn)中國西藏、云南西北部，在四川省涼山州境內(nèi)也有分布，在民間醫(yī)療中，其被選作傷風流感引起的頭疼發(fā)熱治療藥物，亦用作日常飲品，保健用。而有關(guān)脾寒草的研究報道極少，據(jù)相關(guān)文獻研究，直立婆婆納同屬的許多種類，全草藥用，具有多種藥效?！吨袊幹矆D鑒》中寫到脾寒草主治瘧疾，而在涼山州民間，彝族醫(yī)藥里也用作為補品，用以養(yǎng)肝護肝。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者對婆婆納屬植物的藥理學(xué)研究報道不斷增多，發(fā)現(xiàn)其在抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗微生物等方面均有良好的活性。根據(jù)趙一等人的研究，用直立婆婆納的干全草制成流浸膏，初步確證有抗瘧作用。近幾年國內(nèi)外學(xué)者對婆婆納屬植物的藥理學(xué)研究報道不斷增多，對婆婆納屬植物的生物活性成分的探究越來越廣泛和深入，但就脾寒草的生物活性成分研究仍然存在大量的空白。因此，開展脾寒草的理論研究，可以填補其研究空白，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

國內(nèi)對婆婆納屬植物的化學(xué)成分研究主要是對輪葉婆婆納、長果婆婆納、毛果婆婆納的研究，針對婆婆納屬藥用植物的化學(xué)成分研究報道主要集中在苯乙醇苷類化合物，環(huán)烯醚萜苷類化合物，黃酮類化合物以及有機酸。有關(guān)植物活性成分提取的工藝主要回流提取、超聲波提取、酶輔助提取。回流提取以乙醇和甲醇作為提取環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)最常用的兩種有機溶劑，最后將提取液進行過濾、濃縮；超聲波輔助提取法是對環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)進行提取的另一種新型的提取法，其利用超聲波對環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)進行提取，原理是超聲波具有空化、粉碎和攪拌作用，破壞植物藥材的細胞，加速溶劑的運動，使溶劑更容易滲透到細胞中，從而讓環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)溶于提取溶液中，最后分離出活性成分；酶輔助提取法是指在提取環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)的過程中，向其中加入活性酶，引起細胞中相關(guān)底物發(fā)生轉(zhuǎn)糖反應(yīng)和酶解反應(yīng)，提高環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)得率的新興技術(shù)。

通過查閱脾寒草同屬種植物的研究資料，結(jié)合崔紅梅、張仁波、田亮、張彥文、高坤等人的研究報道表明其活性成分主要有：黃酮類物質(zhì)（丹參酮Ⅰ（Ⅶ））、隱丹參酮（Ⅳ）、二氫丹參酮Ⅰ（Ⅵ）、1，2-去氫隱丹參酮（Ⅰ）、丹參酮ⅡA（Ⅷ），有機酸類物質(zhì)（3-甲氧基-4-羥基苯甲酸、3，4-二甲氧基苯甲酸3，4-二甲氧基桂皮酸、3-O-乙酰齊墩果酸、異阿魏酸和3-羥基-4-甲氧基苯甲酸），苯乙醇苷類（胡蘿卜苷Ⅱ、D-甘露醇、β-谷甾醇），環(huán)烯醚萜苷類（6-Overatroylcatalposide、6-Oisovanilloylcatalpole、catalposide、verproside、amphicoside，桃葉珊瑚苷）。因此推測脾寒草中含有的活性成分可能有黃酮類、苯乙醇苷類、有機酸、環(huán)烯醚萜苷類。

根據(jù)Chang，H-Moo等人對肝損傷治療藥物的研究，發(fā)現(xiàn)婆婆納屬的多種植物，普遍存在桃葉珊瑚苷，據(jù)此推測脾寒草生物活性成分中可能含有桃葉珊瑚苷。桃葉珊瑚苷（aucubin，AU），化學(xué)名為β-D-吡喃葡萄糖苷，是一種植物的次生代謝產(chǎn)物，是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物。它能夠有效地促進干細胞再生，并且能夠明顯地抑制乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制，桃葉珊瑚苷的苷元及其有效多聚體是一種抗菌素。桃葉珊瑚苷具有保肝、護肝、降壓、利小便、鎮(zhèn)痛、清濕熱、抗腫瘤等多種活性成分。桃葉珊瑚苷是某些成藥的質(zhì)量指標，又是傳統(tǒng)中藥杜仲、車前草、地黃的主要活性成分。

關(guān)于桃葉珊瑚苷的生物活性報道較多，由于桃葉珊瑚苷極性大，分子小極性大，所以可以用乙醇、甲醇、水等極性溶劑進行提取，但是提取的溫度、時間、方法等對提取效率依舊有明顯影響。藥物的藥用活性成分除了藥物本身的性質(zhì)決定，還與其不同的提取工藝有關(guān)，介于對其脾寒草的生物活性成分的提取和分析的研究空白，參照其他中藥材的提取工藝流程，選擇了三種提取工藝對其生物活性成分進行提取和分析。對比不同工藝條件下桃葉珊瑚苷等生物活性成分含量以及成分分析，并對比不同提取產(chǎn)物的抗氧化活性，探究脾寒草的生物活性成分，彌補脾寒草的研究空白，選擇合理的提取工藝，為脾寒草的研究提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.試驗材料

實驗所用藥材為彝族藥材脾寒草，于2017年采集于四川省涼山州，整株用于藥用，部分從當?shù)孛耖g診所直接購買，在實驗中心陰干備用。

2.主要試劑

主要有桃葉珊瑚苷標準品（色譜純，叮當時代醫(yī)藥科技有限公司），甲醇（分析純），乙腈（色譜純），DPPH（分析純），纖維素酶（化夏試劑有限公司），果膠酶（上海瑞勇生物科技有限公司）。

3.主要儀器設(shè)備

主要有超聲波清洗機（潔康超聲波清洗機PS-D40A），島津高效液相色譜儀（島津LC3000，單元泵LC-20AT，檢測器SPD-20A，柱溫箱CTO-10AS，自動進樣器SIL-20A），干燥箱（GZX-DH202-1-BS-II，上海賀德實驗設(shè)備有限公司），電子天平（FA2004分析電子天平，上海良平儀器儀表有限公司）。

4.實驗方法

（1）提取方法。超聲波提取法：精密稱定取脾寒草藥材粉末1g（過三號篩），加入10%乙醇10mL，稱定總的質(zhì)量，利用超聲處理60min（功率250W，溫度40℃），冷卻至室溫；用10%乙醇補足減失的質(zhì)量，混合均勻后，利用布氏漏斗過濾，得100mg/ml的脾寒草供試品溶液。

（2）抗氧化性檢測方法。DPPH自由基清除力測定原理是，DPPH在有機溶劑中呈紫色，且在517nm處有較大吸收，當加入抗氧化劑一部分自由基被清除掉，使該波長被吸收，通過吸光值的大小來判斷物質(zhì)的抗氧化活性高低。

參照唐建波等分析刺梨多糖抗氧化性的測定方法，采用DPPH自由基清除作用測定脾寒草供試品的抗氧化性。量取100mg/ml的供試品溶液2ml，加水定容至10ml，配成質(zhì)量濃度為20mg/ml樣品，再以該質(zhì)量濃度稀釋成所需的濃度。于棕色容量瓶中，以無水乙醇作為溶劑配制0.16mmol/LDPPH溶液。

取3mlDPPH溶液，等體積加入待測樣品稀釋液，25℃水浴15min后，517nm波長下測得試樣吸光度（Ai），以蒸餾水代替樣品測得空白吸光度（Ao），以無水乙醇代替DPPH溶液測得樣品本底吸光度（Aj），以抗壞血酸作陽性對照，按下式計算清除率： K（%）=[Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。

（3）高效液相色譜檢測。脾寒草提取溶液首先進行紫外分光光度法，進行全波長掃描確定最大吸峰值，其次進行高效液相檢測，采用外標法，對脾寒草供試品進行高效液相色譜分析，稱取桃葉珊瑚苷對照品5mg，置于25mL棕色量瓶中，加入無水乙醇24ml，冷卻后，用無水乙醇定容，得到0.2mg/mL桃葉珊瑚苷對照品儲備溶液，藥品用過0.45?m微孔濾膜，4℃保存待用。

液相色譜條件，參照標準∶流動相為乙腈∶水（5∶95），檢測波長為190nm；結(jié)合崔紅梅等分析毛果婆婆納中桃葉珊瑚苷的方法，采用流動相為乙腈∶水（5∶95），流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，350nm，進樣量體積設(shè)置為20μL。

二、結(jié)果與分析

1.抗氧化活性分析

本研究測定了100mg/ml的脾寒草供試品的DPPH自由基清除能力，脾寒草供試品對DPPH自由基清除作用的半清除濃度IC50為3.2531mg/ml，表明脾寒草供試品有良好的抗氧化活性。隨著脾寒草提取液的濃度上升，抗氧化活性急劇上升，當質(zhì)量濃度達到10mg/ml時清除率就達到了79.65%。

2.脾寒草供試品高效液相色譜分析

（1）檢測波長選擇。脾寒草供試品溶液全波長（190～700nm），掃描結(jié)果是，在190nm處對照品桃葉珊瑚苷有最大吸收，經(jīng)光譜等高線分析優(yōu)化檢測條件，選擇210nm，350nm為檢測波長，雜質(zhì)干擾更少。

（2）高效液相色譜分析。為進一步驗證，采用高效液相色譜對桃葉珊瑚苷標準品進行定性分析，其結(jié)果顯示，組分桃葉珊瑚苷出峰時間為4.501min，脾寒草供試品經(jīng)高效液相色譜洗脫的結(jié)果，再在相同的高效液相色譜條件下進行定性分析，通過組分保留時間的對比，可以看出相同高效液相色譜條件下，組分Ⅰ保留時間為4.461，這與主峰的出峰時間基本一致，因此，初步判定組分Ⅰ為桃葉珊瑚苷。

3.不同工藝樣品高效液相色譜檢測結(jié)果

將制備的九種樣品溶液按上述色譜條件進樣分析，進樣量20μL，記錄色譜圖，外標法計算桃葉珊瑚苷的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果如下：

脾寒草桃葉珊瑚苷的含量與提取率如下表：

參考文獻：

[1]田 亮，周金云.婆婆納屬植物的研究進展[J].中藥材，2004（1）.

[2]張仁波，竇全麗.國內(nèi)婆婆納屬藥用植物研究進展[J].科技資訊，2009（31）.