尼羅羅非魚Lck多克隆抗體的制備及鑒定

張永德 林勇 馮鵬霏 陳忠 杜雪松 黃姻 潘傳燕 羅洪林

摘要：【目的】制備及鑒定尼羅羅非魚淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（Lck）多克隆抗體，為深入研究羅非魚Lck蛋白功能及其免疫機制打下基礎?！痉椒ā坎捎脽o縫克隆技術構建重組質粒pET-B2m-Lck，然后轉入大腸桿菌B21（DH3）中進行誘導表達;經(jīng)Ni-NTA樹脂層析柱純化后，以純化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制備Lck多克隆抗體，并采用Western blotting和ELISA檢測多克隆抗體的特異性和免疫效價?！窘Y果】尼羅羅非魚Lck蛋白的親水性均值（GRAVY）為-0.454，屬于親水性蛋白，具有較豐富且分布均勻的潛在抗原表位位點，無典型的跨膜區(qū)。經(jīng)原核載體誘導表達獲得的融合蛋白分子量約67.0 kD，主要以包涵體形式存在。免疫日本大耳白兔后可獲得效價為1∶256000的Lck多克隆抗體，且該多克隆抗體能特異性識別Lck蛋白。經(jīng)Protein G親和層析柱純化的抗體濃度在10 mg/mL以上，純度約95%，抗體純化效果良好?！窘Y論】經(jīng)原核載體誘導表達獲得的尼羅羅非魚Lck融合蛋白具有良好的免疫原性，其免疫日本大耳白兔后獲得的多克隆抗體具有高效價和特異性，可用于細菌感染羅非魚后機體免疫機制的研究。

關鍵詞： 尼羅羅非魚;淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（Lck）;原核表達;包涵體;多克隆抗體

中圖分類號： S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2304-07

Preparation and identification of Lck polyclonal

antibody in Nile tilapia

ZHANG Yong-de， LIN Yong， FENG Peng-fei， CHEN Zhong， DU Xue-song，

HUANG Yin， PAN Chuan-yan，? LUO Hong-lin*

（Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and

Healthy Aquaculture， Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】Preparation and identification of Nile tilapia lymphocyte-specific protein tyrosine kinase（Lck） polyclonal antibodies were carried out to lay a foundation for further research on the function and immune mechanism of Lck protein in tilapia. 【Method】The recombinant plasmid pET-B2m-Lck was constructed with seamless cloning technology， and then was transferred into Escherichia coli strain B21（DH3） for expression induction. After purification by Ni-NTA chromatography column， Lck polyclonal antibody was prepared by immunizing Japanese big ear rabbits with purified fusion protein， and the specificity and immunity titer of polyclonal antibody were detected by Western blotting and ELISA. 【Result】The average hydrophilicity（GRAVY） of Nile tilapia Lck protein was -0.454， which was a hydrophilic protein. Lck protein had rich and well-distributed potential epitope site with no typical transmembrane region. The fusion protein obtained by the expression induction of the prokaryotic vector had a molecular weight of about 67.0 kD， and mainly existed in the form of inclusion body. After immunizing Japanese big ear rabbits， a Lck polyclonal antibody with a titer of 1∶256000 was obtained， which could specifically recognize the Lck protein. The concentration of the antibody purified by Protein G affinity chromatography column was above 10 mg/mL， the purity was about 95%， and the antibody was well purified. 【Conclusion】The Lck fusion protein of Nile tilapia obtained by prokaryotic expression induction has good immunogenicity， and the polyclonal antibody obtained after immunity to big ear rabbit has high efficiency and specificity， which can be used in the study of the organism immune mechanism after bacterial infection of tilapia.

Key words：Nile tilapia; lymphocyte-specific protein tyrosine kinase（Lck）; prokaryotic expression; inclusion body; polyclonal antibody

0 引言

【研究意義】淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，Lck）是Src蛋白激酶家族的成員之一，在胸腺細胞發(fā)育的各階段均有表達（鄧英輝等，2006）。Lck包含N-端膜錨定區(qū)（SH4結構域）、獨特的結構域、Src-同源3（SH3）結構域、SH2結構域、催化激酶結構域和C-端尾端（Ngoenkam et al.，2018），在T淋巴細胞抗原受體（TCR）介導的信號轉運過程中發(fā)揮關鍵作用。TCR與抗原肽結合可引起Lck與T淋巴細胞共同與CD4+和CD8+相互作用，進而通過激活白細胞介素-2（IL-2）誘導T淋巴細胞增殖和分化（Palacios and Weiss，2004;Salmond et al.，2009;Smith-Garvin et al.，2009），最終引起酪氨酸激酶Zap-70的募集與激活（Kane et al.，2000）。激活的Zap-70分子自磷酸化并為其他信號分子如膜銜接蛋白LAT（用于激活T淋巴細胞的接頭）提供停靠位點，后者又募集并激活其他蛋白以啟動蛋白激酶C和MAP激酶途徑，該途徑是T淋巴細胞增殖、分化及其效應功能的基礎（Sommers et al.，2004）。羅非魚是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，但近年來鏈球菌病等細菌性疾病給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，嚴重阻礙其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展（黎小正等，2013;Li et al.，2015;羅偉等，2018）。由于目前對病原入侵羅非魚后其免疫反應的認識非常有限，且有關Lck在羅非魚免疫系統(tǒng)中的作用尚不清楚。因此，構建羅非魚Lck表達載體并進行誘導表達及多克隆抗體制備，對進一步了解Lck的功能乃至魚類免疫具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前已克隆鑒定出Lck基因的硬骨魚類有日本河豚（Takifugu rubripes）（Brenner et al.，2002）、斑馬魚（Danio rerio）（Langenau et al.，2004）、日本銀鯽（Carassius auratus langsdorfii）（Araki et al.，2007）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Chen et al.，2007）、虹鱒魚（Oncor-hynchus mykiss）（Laing et al.，2007）、大西洋比目魚（Hippoglossus hippoglossus）（?verg?rd et al.，2010）、鮭魚（Salmo salar）（Leong et al.，2010）、日本鰻（Anguilla japonica）（Kawabe et al.，2012）、羅非魚（Oreochromis niloticus）（Gan et al.，2015）和紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）（Huang et al.，2016）等，但針對硬骨魚Lck的研究主要集中在基因克隆及其組織表達分布上，雖然有研究顯示在T淋巴細胞有絲分裂原（PHA和PMA）的刺激下Lck基因表達增強（Laing et al.，2007），但對Lck在抗細菌侵襲免疫應答中的作用了解非常有限?！颈狙芯壳腥朦c】盡管目前已有針對尼羅羅非魚Lck基因進行克隆與表達分析的研究（Gan et al.，2015），但Lck在羅非魚免疫反應中的具體作用尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】對尼羅羅非魚Lck基因進行原核表達，并通過免疫日本大耳白兔制備抗羅非魚Lck特異性多克隆抗體，以期為深入研究羅非魚Lck蛋白功能及其免疫機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

重組質粒pET-B2m（由pET-28a改造獲得）、表達宿主大腸桿菌B21（DH3）購自武漢金開瑞生物工程有限公司，T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I購自美國Fermentas公司，IPTG購自德國Merck公司，弗式完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司，PVDF膜購自美國Thermo Fisher公司，羊抗兔-HRP抗體購自美國Jackson公司，DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，親和層析柱料購自美國GE Healthcare公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 蛋白質結構分析及抗原性預測 采用在線分析工具ExPASy中的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預測Lck蛋白的親/疏水性，TMHMM server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對Lck蛋白序列進行跨膜區(qū)預測;使用Protean中的Jameson-Wolf方法對Lck蛋白的抗原指數(shù)等進行預測分析。

1. 2. 2 目的基因擴增 根據(jù)尼羅羅非魚Lck基因序列（NCBI登錄號KM058084），利用Primer Premier 5.0設計PCR擴增引物，上游引物P1：5'-ATGGGTTG

TAATTGCGGTTGTAATTGC-3'，下游引物P2：5'-T

TCTTGATACTGACGTTTCTTGATACTGACGT-3'。以合成的尼羅羅非魚Lck基因序列為模板進行PCR擴增，擴增程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行28個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行切膠回收。

1. 2. 3 原核表達質粒構建 以BamHⅠ和SalⅠ雙酶切pET-B2m載體，采用無縫克隆技術構建重組質粒pET-B2m-Lck，然后轉入大腸桿菌B21（DH3）;篩選陽性克隆，提取質粒后進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果采用DNASTAR MegAlign進行比對分析。

1. 2. 4 目的蛋白小量表達 將測序正確的重組質粒轉入大腸桿菌B21（DH3），取30.0 μL過夜培養(yǎng)菌液接入3.0 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6。取部分菌液作為對照組，剩余菌液加入IPTG誘導劑至終濃度0.5 mmol/L，對照菌液與誘導菌液繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h;取1.0 mL菌體經(jīng)12000×g離心30 s，收獲沉淀，用100.0 μL的1% SDS進行重懸，混勻。12000×g離心10 min，收集上清液進行SDS-PAGE檢測分析。

1. 2. 5 目的蛋白表達與破菌檢測 取2.0 mL過夜培養(yǎng)菌液加入到2000.0 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約等于0.6;加入IPTG誘導劑至終濃度0.5 mmol/L，30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h。收集發(fā)酵液，6000×g離心10 min，收集菌體懸浮于40.0 mL預冷的NTA-0緩沖液中，冰浴超聲波破碎細菌，4 ℃下20000×g離心30 min，收集上清液及沉淀。取少量樣品進行SDS-PAGE檢測分析。

1. 2. 6 包涵體蛋白純化 將收集的沉淀加入到Ni-NTA樹脂層析柱中，收集穿柱液體。以10倍柱床體積的NTA-0、NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500 Buffer進行洗脫，收集各洗脫峰，取少量洗脫液進行SDS-PAGE檢測分析。純度達到要求的組分置于透析袋中，4 ℃下以1×PBS進行透析，最后4 ℃超濾濃縮透析產(chǎn)物。

1. 2. 7 多克隆抗體制備和鑒定 將純化的融合蛋白與等容積弗氏完全佐劑乳化后，按500 ?g/只的劑量免疫2只日本大耳白兔，皮下多點注射。每只兔子免疫5～6次，每次免疫間隔14 d，并檢測免疫效價，待抗體表達恒定后，采血分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 8 免疫效價ELISA檢測 以Lck融合蛋白為抗原（2 μg/mL），按100 μL/孔加入到96孔板中進行抗原包被，4 ℃過夜;以2%卵清蛋白（OVA）于室溫封閉30 min，將待檢血清按1∶2000、1∶4000、1∶8000進行二倍梯度稀釋至1∶8192000，然后各取100.0 μL加入96孔板，以空白血清為陰性對照。37 ℃溫育1 h后，加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶5000），100.0 ?L/孔，37 ℃溫育45 min;洗滌后加入TMB顯色液（100.0 μL）顯色20 min，以酶標儀測定OD450。陽性反應的最大稀釋度即為待測樣品效價。

1. 2. 9 Western blotting檢測 分別取25和10 ng純化融合蛋白進行SDS-PAGE檢測分析，200 mA濕法轉PVDF膜，然后在37 ℃下以封閉液封閉2 h。加入兔抗血清（稀釋度體積比1∶1000），37 ℃下?lián)u床孵育1 h。經(jīng)洗滌后加入羊抗兔-HRP二抗（1∶10000倍體積稀釋），37 ℃孵育1 h，取等體積的ECL試劑A液、B液混合滴于PVDF膜正面，于暗室反應2 min，取出膠片立即浸入顯影液中顯色1 min，浸入定影液中定影1 min，晾干，標定Marker后，拍照分析Lck抗血清的特異性。

1. 2. 10 抗體純化 采用Protein G親和層析柱進行抗體純化。將收集的抗血清與等體積2×PBS混合后上樣，用10倍柱體積以上的PBS進行洗滌，至流出液無蛋白檢出，加入2倍柱體積的0.1 mol/L檸檬酸（pH 2.7）洗脫，收集洗脫產(chǎn)物，測定OD280估算抗體濃度;以1 mol/L Tris調節(jié)洗脫產(chǎn)物pH至中性，采用10 kD超濾管將樣品濃縮至所需體積，純化濃縮后的抗體經(jīng)稀釋后進行SDS-PAGE檢測分析，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與分析

2. 1 Lck蛋白親/疏水性及跨膜區(qū)分析結果

Lck基因編碼蛋白由501個氨基酸組成，親/疏水性預測結果顯示，Lck蛋白平均疏水性為-0.454，序列中含有較多的親水性氨基酸，親水性區(qū)段主要為第4～24、26～44、46～54、66～95、99～107、116～132、161～186、197～209、215～248、256～266、248～294、311～319、322～330、348～360、382～397、432～461、469～483和492～501位氨基酸（圖1），序列親水性較強。疏水性氨基酸[丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）和纈氨酸（Val）]分別占編碼氨基酸的5.19%、2.40%、5.99%、8.38%、3.19%、3.59%和5.39%?？缒^(qū)分析結果顯示，Lck蛋白無典型的跨膜區(qū)，501個氨基酸均位于細胞膜表面，降低了跨膜區(qū)疏水性氨基酸對蛋白折疊的影響，易于表達和純化。

2. 2 Lck蛋白抗原性分析結果

采用Protean中的Jameson-Wolf方法預測Lck蛋白抗原指數(shù)，了解其可能存在的抗原表位位點。由圖2可看出，Lck蛋白全長序列中具有較豐富且分布均勻的潛在抗原表位位點，其中抗原指數(shù)較高的區(qū)段為第1～14、16～38、44～53、65～92、125～132、146～158、160～173、175～184、203～211、213～228、230～251、256～270、323～331、381～396、429～443、445～462、470～480和492～501位氨基酸。這些位點除抗原指數(shù)較高外，多數(shù)還具備較強的親水性，因此采用Lck蛋白制備抗體具有較強的可行性。

2. 3 Lck表達載體的構建及鑒定結果

以pET-B2m-Lck質粒為模板擴增Lck基因，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得一條約1500 bp的目的條帶（圖3），與預期結果相符。經(jīng)測序及序列比對分析，確定Lck基因（1503 bp）已正確插入pET-B2m載體中，載體構建成功。

2. 4 目的蛋白小量誘導表達情況

以重組質粒pET-B2m-Lck轉化大腸桿菌B21（DH3），經(jīng)IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE檢測分析，結果如圖4所示，在約67.0 kD處出現(xiàn)一條明顯的表達條帶。

2. 5 融合蛋白表達與鑒定結果

對融合蛋白進行大量誘導表達，經(jīng)菌液裂解及SDS-PAGE檢測分析，發(fā)現(xiàn)其上清液與沉淀均在67.0 kD附近出現(xiàn)一條蛋白條帶，但沉淀中的蛋白含量明顯高于上清液中的含量（圖5），表明融合蛋白主要以包涵體形式表達。

2. 6 融合蛋白的提取與純化結果

大腸桿菌B21（DH3）表達的Lck融合蛋白主要以包涵體存在。重組表達細菌經(jīng)IPTG誘導、超聲波裂解、離心沉淀和重懸后，加入Ni-NTA樹脂層析柱中進行純化，純化產(chǎn)物10倍稀釋后，經(jīng)SDS-PAGE檢測分析，結果顯示在67.0 kD處有一條清晰的條帶（圖6）。

2. 7 Lck融合蛋白血清抗體的免疫效價

抗原采用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液分別包被，以ELISA分別檢測Lck融合蛋白免疫日本大耳白兔的抗體效價，結果發(fā)現(xiàn)多克隆抗體的效價為1∶256000（圖7），表明誘導表達獲得的Lck融合蛋白可誘導日本大耳白兔產(chǎn)生良好的免疫反應，且抗體效價較高。

2. 8 Western blotting檢測結果

純化Lck融合蛋白的Western blotting檢測結果見圖8。25和10 ng融合蛋白在67.0 kD處均出現(xiàn)一條能與陽性血清反應的清晰蛋白條帶，且以25 ng融合蛋白的條帶更清晰，而免疫前陰性血清對照組在相應位置未見任何條帶，說明Lck多克隆抗體具有較高的特異性。

2. 9 抗體純化結果

收集到的抗血清采用Protein G親和層析柱進行兩次純化，經(jīng)4倍稀釋后進行SDS-PAGE檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)在50.0和25.0 kD附近各出現(xiàn)一條清晰條帶（圖9），其大小與抗體重鏈及輕鏈的大小相吻合。經(jīng)Protein G親和層析柱純化的抗體濃度在10 mg/mL以上，純度約95%，抗體純化效果良好。

3 討論

Lck在介導T淋巴細胞免疫反應中起關鍵作用，在T淋巴細胞發(fā)育和功能分化的各階段幾乎都有Lck參與，但目前針對魚類Lck的相關功能研究甚少。Gan等（2015）克隆了尼羅羅非魚Lck基因，并證實該基因編碼501個氨基酸，蛋白理論分子量57.25 kD，理論等電點5.07;Taylor等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，克隆性T淋巴細胞系可特異性表達Lck和CD2，而Lck可與斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中的CD2、CD4-1和CD4-2 T淋巴細胞共同受體結合;Liu等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，Lck/Hck/Fgr介導的TBK1酪氨酸磷酸化對斑馬魚抗病毒免疫性具有負調節(jié)作用。本研究結果表明，尼羅羅非魚Lck蛋白的親水性均值（GRAVY）為-0.454，屬于親水性蛋白，具有較豐富且分布均勻的潛在抗原表位位點，無典型的跨膜區(qū);采用無縫克隆技術構建重組質粒pET-B2m-Lck，經(jīng)原核誘導表達獲得的融合蛋白分子量約67.0 kD，但該蛋白的理論分子量應為57.25 kD，可能與其在大腸桿菌中的修飾過程及加入His-Tag有關。

本研究中，IPTG誘導表達獲得的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測分析發(fā)現(xiàn)，其上清液和沉淀均在67.0 kD處出現(xiàn)一條蛋白條帶，但沉淀中的蛋白含量明顯高于上清液中的含量，說明誘導表達的Lck融合蛋白存在可溶性及不溶性兩種形式，但主要以不溶性的包涵體形式存在。在大腸桿菌表達期間，融合蛋白通常需要折疊調節(jié)劑如分子伴侶蛋白的幫助。在高效表達系統(tǒng)中，蛋白聚集的速度一般比正確折疊的速度快，分子伴侶蛋白易被迅速用完（Baneyx and Mujacic，2004），因此這些蛋白聚集后即形成不溶性的包涵體。由于融合蛋白聚集被認為是一個亟待解決的問題而非研究目標（Rinas et al.，2017），導致包涵體形成的生理和生物學特性一直被忽視。包涵體的形成一般認為與原核載體系統(tǒng)的高效表達有關（Carrió et al.，2000），而細菌胞漿環(huán)境條件的降低（Singh and Panda，2005）、擁擠的環(huán)境（Magno et al.，2010）及缺乏真核伴侶和翻譯后機制（Carrió et al.，2000）有助于包涵體的形成。此外，蛋白乙?；瘯?nèi)源性大腸桿菌蛋白的聚集、產(chǎn)量、溶解度及融合蛋白的生物活性產(chǎn)生影響，如賴氨酸乙?；黾訒龠M形成穩(wěn)定的蛋白質聚集體（Kuczyńska-Wi?nik et al.，2016）。由于靶蛋白更容易從細菌裂解物中的可溶性部分純化，因此包涵體的形成通常被認為是大腸桿菌表達系統(tǒng)的缺點（Clark，2001），而改變表達菌生長條件（生長溫度、誘導劑濃度和誘導時間）有助于減少包涵體的形成，增加可溶性蛋白含量。

日本大耳白兔以耳大、血管清晰而著稱，是制備抗體的最適動物模型。其性情溫順，體型適中，便于實驗操作;每次可收集高達10～50 mL的血液量或120～200 mL的總血液量，免疫后可產(chǎn)生足量的高親和力抗血清。因此，本研究以純化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制備Lck多克隆抗體，Western blotting和ELISA檢測結果顯示，制備的Lck多克隆抗體具有較高的特異性與免疫效價，也說明日本大耳白兔是制備多克隆抗體的理想動物模型。本研究結論不僅為尼羅羅非魚Lck蛋白功能及作用機制的研究提供了依據(jù)，還為解釋Lck在魚類免疫反應和細胞增殖等過程中的作用打下了基礎。

4 結論

經(jīng)原核載體誘導表達獲得的尼羅羅非魚Lck融合蛋白具有良好的免疫原性，其免疫日本世紀大耳白兔后獲得的多克隆抗體具有高效價和特異性，可用于細菌感染羅非魚后機體免疫機制的研究。

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