云南甘蔗病毒性病害的分子鑒定

馮小艷 沈林波 趙婷婷 熊國如 王俊剛 楊本鵬 王文治 馮翠蓮 張樹珍

摘要：【目的】了解5種常見甘蔗病毒性病害在云南的發(fā)生情況，明確其病原病毒的種類和分布，為制定云南地區(qū)甘蔗病毒性病害的防治策略提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷肞CR和RT-PCR對采集自云南保山、臨滄和德宏3個甘蔗種植區(qū)的113份樣品進(jìn)行甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus， SCMV）、高粱花葉病毒（Sorghum mosaic virus， SrMV）、甘蔗線條花葉病毒（Sugarcane streak mosaic virus， SCSMV）、甘蔗黃葉病毒（Sugarcane yellow leaf virus， SCYLV）和甘蔗桿狀病毒（Sugarcane bacilliform virus， SCBV）的分子鑒定?！窘Y(jié)果】113份甘蔗樣品中有89份檢出病毒，病毒檢出率為78.8%，檢出的病毒種類有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，檢出率分別為5.3%、11.5%、20.4%和70.8%，未檢出SCMV。30份樣品存在病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，復(fù)合侵染率為26.5%，其中有27份樣品為2種病毒復(fù)合侵染，占23.9%，3份樣品發(fā)生3種病毒復(fù)合侵染，占2.7%;未發(fā)現(xiàn)4種或5種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】目前云南地區(qū)甘蔗病毒性病害由SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV引起，其中SCBV廣泛分布，SrMV、SCSMV和SCYLV具有一定程度的分布;病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象明顯，以2種病毒復(fù)合侵染為主。

關(guān)鍵詞： 甘蔗;病毒性病害;分子鑒定;云南

中圖分類號： S435.661? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2198-06

Molecular identification of virus diseases

in sugarcane in Yunnan

FENG Xiao-yan， SHEN Lin-bo， ZHAO Ting-ting， XIONG Guo-ru， WANG Jun-gang，YANG Ben-peng， WANG Wen-zhi， FENG Cui-lian， ZHANG Shu-zhen*

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Haikou? 571101， China）

Abstract：【Objective】The occurrence of five common sugarcane virus diseases and the species and distribution of their pathogenic viruses in Yunnan were studied to provide theoretical basis for the development of control strategies for sugarcane virus diseases in Yunnan. 【Method】A total of 113 sugarcane samples collected from three sugarcane growing areas（Baoshan， Lincang and Dehong） in Yunnan were detected the molecular identification of five viruses， namely， Sugarcane mosaic virus（SCMV）， Sorghum mosaic virus（SrMV）， Sugarcane streak mosaic virus（SCSMV）， Sugarcane yellow leaf virus（SCYLV） and Sugarcane bacilliform virus（SCBV）， via PCR and RT-PCR methods. 【Result】A total of 89 out of the 113 sugarcane samples were detected viruses positive with a detection rate of 78.8%. The detected virus species were SrMV， SCSMV， SCYLV and SCBV， and the detection rates were 5.3%， 11.5%， 20.4% and 70.8% respectively. SCMV was not detected in all samples. Thirty samples were co-infected with different viruses， and the co-infection rate was 26.5%. Among them， twenty-seven samples were co-infected with two viruses， accounting for 23.9%， and three samples were co-infected with three viruses， accounting for 2.7%. No samples were co-infected with four or five viruses. 【Conclusion】The sugarcane virus diseases are caused by SrMV， SCSMV， SCYLV and SCBV in Yunnan. SCBV widely distributes in Yunnan， and SrMV， SCSMV and SCYLV also distribute in some parts of Yunnan. Co-infection with several viruses， especially two viruses， is common in sugarcane in Yunnan.

Key words： sugarcane; virus disease; molecular identification; Yunnan

0 引言

【研究意義】甘蔗（Saccharum spp.）是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅是食糖的主要來源，還可用于生產(chǎn)燃料乙醇（Tew and Cobill， 2008; Zhou et al.， 2016）。甘蔗在生長過程中會受到多種病原體尤其是病毒的侵染，長期無性繁殖留種使得病毒在甘蔗種質(zhì)中不斷積累，從而導(dǎo)致甘蔗品種退化、長勢變差、產(chǎn)量和糖分降低，對甘蔗產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅（王明強(qiáng)等， 2010;徐正銀等， 2014）。云南是我國重要的甘蔗產(chǎn)區(qū)，蔗糖產(chǎn)業(yè)是該地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和邊疆脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)（黃應(yīng)昆等， 2007）。因此，了解云南地區(qū)甘蔗病毒性病害的發(fā)生情況，對該地區(qū)甘蔗病毒性病害的防治及云南乃至全國甘蔗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展均具有重要的指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】甘蔗花葉病是一種全球性甘蔗病害，在各大甘蔗種植國家和地區(qū)普遍發(fā)生。甘蔗感染花葉病后會導(dǎo)致種苗的萌芽率降低、長勢變差、產(chǎn)量減少10%～40%（黃應(yīng)昆等， 2007）。引起甘蔗花葉病的主要病原包括甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）、高粱花葉病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）和甘蔗線條花葉病毒（Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV）。甘蔗黃葉病亦是一種全球性甘蔗病害，由甘蔗黃葉病毒（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）引起。甘蔗感染SCYLV后即使未表現(xiàn)發(fā)病癥狀，其產(chǎn)量也會受到一定影響，發(fā)病嚴(yán)重時產(chǎn)量損失可高達(dá)50%（Lehrer et al.， 2008;Elsayed et al.， 2015）。甘蔗桿狀病是近年新流行的一種甘蔗病毒性病害，由甘蔗桿狀病毒（Sugarcane bacilliform virus，SCBV）引起，可導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)下降（李文鳳等， 2010;徐正銀等， 2015）。甘蔗花葉病、黃葉病和桿狀病是威脅我國甘蔗生產(chǎn)的主要病毒性病害，目前在云南地區(qū)已有這3種病害發(fā)生。李文鳳等（2009）采用組織斑點(diǎn)免疫技術(shù)對采自云南省的表現(xiàn)癥狀或無癥的甘蔗樣品進(jìn)行SCYLV檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30份樣品中有27份檢出SCYLV。李文鳳等（2010）采用PCR在云南甘蔗樣品中檢測到SCBV，對檢測到的SCBV云南分離物部分序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中已登錄的澳大利亞和摩洛哥分離物對應(yīng)核苷酸序列相似性分別為73.2%～74.0%和66.7%～68.4%，表明SCBV基因組具有高度變異性。Wang等（2012）采用RT-PCR對66份云南甘蔗樣品進(jìn)行SCYLV檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28份樣品呈陽性，檢出率為42.4%;基因型分析結(jié)果顯示，28份陽性樣品所感染的SCYLV均為BRA基因型。賀振（2014）采用RT-PCR對云南甘蔗花葉病樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)引起該地區(qū)甘蔗花葉病的病原有SCMV、SrMV和SCSMV，其中SrMV是主要病原;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)馗收岵《緩?fù)合侵染現(xiàn)象明顯，多為SrMV與SCMV或與SCSMV復(fù)合侵染，零星存在SCMV與SCSMV復(fù)合侵染。周婭（2014）在云南甘蔗花葉病樣品中也檢出SCMV、SrMV和SCSMV 3種病毒，其中SrMV為主要病原。單紅麗等（2016）對云南甘蔗花葉病樣品的RT-PCR檢測結(jié)果顯示，SCSMV為主要病原，檢出率為58.0%，SrMV次之，為49.4%，SCMV最低，為11.1%;存在病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，以SrMV與SCSMV復(fù)合侵染最常見?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來關(guān)于云南地區(qū)甘蔗病毒性病害發(fā)生情況的報道較多，但這些報道均只針對一種病毒性病害，主要是甘蔗花葉病或甘蔗黃葉病，而對近年大規(guī)模流行的甘蔗桿狀病的發(fā)生情況報道較少，未見多種病毒性病害綜合發(fā)生情況的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用PCR或RT-PCR對云南甘蔗樣品進(jìn)行SCMV、SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV等5種甘蔗病毒分子鑒定，了解云南地區(qū)甘蔗花葉病、黃葉病和桿狀病等常見甘蔗病毒性病害的綜合發(fā)生情況，掌握其病原病毒種類和分布，為云南地區(qū)甘蔗病毒性病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2017年8—9月分別從云南保山、臨滄和德宏3個甘蔗種植區(qū)采集顯癥或不顯癥的甘蔗葉片樣品36、30和47份，合計113份。以本課題組前期采自田間并經(jīng)PCR或RT-PCR鑒定染病的甘蔗葉片為陽性對照，滅菌雙蒸水為空白對照。

1. 2 總RNA提取及cDNA合成

樣品總RNA按照E.Z.N.A.R Plant RNA Kit（mega Bio-tek， USA）說明進(jìn)行提取，提取的總RNA質(zhì)量通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析。總RNA未經(jīng)消化DNA直接用于合成cDNA，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific， UK）進(jìn)行合成，其中以Random Hexamer primer為引物，6.0 μL總RNA為模板。

1. 3 PCR及RT-PCR擴(kuò)增

PCR及RT-PCR擴(kuò)增所用特異引物見表1，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴(kuò)增體系20.0 μL：模板0.5 μL，正、反引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Taq Plus MasterMix（Biosharp，CN）10.0 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，相應(yīng)退火溫度（表1）30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析。

1. 4 擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析

按照AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit（Axygen， US）說明對部分PCR或RT-PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。采用NCBI的BLAST功能對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR或RT-PCR檢測結(jié)果

用SCMV特異性引物對樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，僅陽性對照擴(kuò)增得到906 bp左右的目的條帶，所有樣品均無目的條帶產(chǎn)生。用SrMV特異性引物對樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示部分樣品擴(kuò)增得到828 bp左右的目的條帶;對陽性樣品的擴(kuò)增序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與來自云南、廣西和海南等地SrMV分離物的相應(yīng)核苷酸序列同源性高達(dá)98%～99%，表明其確為SrMV的基因片段序列。用SCSMV特異性引物對樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示部分樣品擴(kuò)增得到939 bp左右的目的條帶;對陽性樣品擴(kuò)增序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與來自我國云南、海南及泰國等地SCSMV分離物的相應(yīng)核苷酸序列同源性高達(dá)98%～99%，確定其為SCSMV的基因片段序列。用SCYLV特異性引物對樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示部分樣品擴(kuò)增得到588 bp左右的目的條帶;對陽性樣品擴(kuò)增序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與來自云南、廣東、海南和福建等地的SCYLV分離物的相應(yīng)核苷酸序列同源性高達(dá)98%～99%，確定其為SCYLV的基因片段序列。用SCBV特異性引物對樣品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示部分樣品擴(kuò)增得到589 bp左右的目的條帶;對陽性樣品擴(kuò)增序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與來自我國云南及印度等地的SCBV分離物的相應(yīng)核苷酸序列同源性高達(dá)90%～99%，確定其為SCBV的基因片段序列（圖1）。

2. 2 云南甘蔗病毒種類分析

檢測結(jié)果（表2）顯示，113份甘蔗樣品中有89份檢出病毒，病毒檢出率為78.8%，檢出的病毒種類有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，未檢出SCMV。其中，有6份樣品檢出SrMV，檢出率為5.3%;13份樣品檢出SCSMV，檢出率為11.5%;23份樣品檢出SCYLV，檢出率為20.4%;80份樣品檢出SCBV，檢出率為70.8%。

在云南不同地區(qū)采集的甘蔗樣品檢出的病毒種類和檢出率也不同。在保山采集的36份樣品中有30份檢出病毒，病毒檢出率為83.3%，檢出的病毒種類有SCSMV、SCYLV和SCBV，未檢出SCMV和SrMV;其中，檢出SCSMV樣品4份，占11.1%，SCYLV樣品8份，占22.2%，SCBV樣品28份，占77.8%。在臨滄采集的30份樣品中有26份檢出病毒，病毒檢出率為86.7%，檢出的病毒種類有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，未檢出SCMV;其中，檢出SrMV樣品4份，占13.3%，SCSMV樣品7份，占23.3%，SCYLV樣品8份，占26.7%，SCBV樣品21份，占70.0%。在德宏采集的47份樣品中有33份檢出病毒，病毒檢出率為70.2%，檢出的病毒種類有SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV，未檢出SCMV;其中，檢出SrMV和SCSMV樣品各2份，各占4.3%，SCYLV樣品7份，占14.9%，SCBV樣品31份，占66.0%（表2）。

2. 3 云南甘蔗病毒復(fù)合侵染情況

由表3可知，113份樣品中有24份未檢出病毒，59份檢出1種病毒，30份檢出2種或3種病毒，即發(fā)生病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為26.5%。發(fā)生病毒復(fù)合侵染的樣品中有27份為2種病毒復(fù)合侵染，占23.9%，主要是SCYLV和SCBV復(fù)合侵染;3份發(fā)生3種病毒復(fù)合侵染，占2.7%，主要是SrMV、SCSMV和SCBV復(fù)合侵染。未發(fā)現(xiàn)4種或5種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

不同地區(qū)采集的甘蔗樣品病毒復(fù)合侵染情況略有不同。保山采集的36份樣品中，6份未檢出病毒，21份檢出1種病毒，9份檢出2種或3種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為25.0%;9份復(fù)合侵染的樣品中有8份受2種病毒復(fù)合侵染，占22.2%，主要是SCYLV與SCBV復(fù)合侵染，1份受3種病毒復(fù)合侵染，占2.8%，為SCSMV、SCYLV與SCBV復(fù)合侵染。臨滄采集的30份樣品中，4份未檢出病毒，13份檢出1種病毒，其余的13份檢出2種或3種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為43.3%;13份復(fù)合侵染的樣品中有12份受2種病毒復(fù)合侵染，占40.0%，主要是SCYLV與SCBV復(fù)合侵染，1份受3種病毒復(fù)合侵染，占3.3%，為SrMV、SCSMV與SCBV復(fù)合侵染。德宏采集的47份樣品中，14份未檢出病毒，25份檢出1種病毒，8份檢出2種或3種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為17.0%;8份復(fù)合侵染的樣品中有7份受2種病毒復(fù)合侵染，占14.9%，主要是SCYLV與SCBV復(fù)合侵染，1份受3種病毒復(fù)合侵染，占2.1%，為SrMV、SCSMV與SCBV復(fù)合侵染。

3 討論

本研究利用PCR和RT-PCR對云南地區(qū)甘蔗樣品進(jìn)行SCMV、SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV等5種甘蔗病毒分子鑒定，結(jié)果顯示，SCMV在所有樣品中均未檢出，檢出率為0，其余4種病毒在云南地區(qū)的檢出率分別為5.3%、11.5%、20.4%和70.8%。檢測結(jié)果顯示在引起甘蔗花葉病的3種病原中，SCSMV的檢出率最高。賀振（2014）、周婭（2014）的研究結(jié)果均表明SrMV是云南地區(qū)甘蔗花葉病的主要病原;單紅麗等（2016）的研究結(jié)果則顯示在云南地區(qū)甘蔗花葉病樣品中SCSMV的檢出率高于SrMV和SCMV。本研究結(jié)果與單紅麗等（2016）的研究結(jié)果一致，說明SCSMV已取代SrMV成為云南地區(qū)甘蔗花葉病的主要病原。據(jù)報道，引起云南地區(qū)甘蔗花葉病的3種病原中，SCMV的檢出率最低，且其很少與SCSMV共同侵染甘蔗（賀振， 2014; 周婭， 2014;單紅麗等， 2016）。本研究在云南地區(qū)所有甘蔗樣品中均未檢測到SCMV，推測SCMV與SCSMV存在競爭關(guān)系，SCSMV作為云南地區(qū)甘蔗花葉病的主要病原，可能嚴(yán)重抑制了SCMV對甘蔗的侵染。SCYLV在云南保山、臨滄和德宏3個蔗區(qū)的檢出率為14.9%～26.7%，說明SCYLV在云南地區(qū)具有一定程度的分布。SCBV在云南3個蔗區(qū)的檢出率均在70.0%左右，說明SCBV在云南地區(qū)廣泛分布。甘蔗受SCBV侵染后盡管癥狀表現(xiàn)不穩(wěn)定，有時甚至出現(xiàn)隱性侵染，但其產(chǎn)量和品質(zhì)仍會有所下降（李文鳳等，2010）。因此，在甘蔗生產(chǎn)過程中務(wù)必要重視SCBV的防治工作。

對云南地區(qū)甘蔗樣品的病毒復(fù)合侵染情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，113份樣品中有30份存在病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，復(fù)合侵染率為26.5%，其中2種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象明顯，主要為SCYLV與SCBV復(fù)合侵染，3種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象零星發(fā)生，主要是SrMV、SCSMV與SCBV復(fù)合侵染，不存在4種或5種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。病毒復(fù)合侵染甘蔗的現(xiàn)象在我國各蔗區(qū)常有發(fā)生，如SCMV與SrMV復(fù)合侵染在江西（蔣軍喜等，2009）、云南（賀振，2014）、廣西（周豐靜等，2015）等蔗區(qū)曾發(fā)生，SrMV與SCSMV復(fù)合侵染在云南等蔗區(qū)曾發(fā)生（賀振，2014），SrMV與SCYLV復(fù)合侵染在海南等蔗區(qū)曾發(fā)生（熊國如等，2011），SCMV、SrMV與SCYLV復(fù)合侵染在廣西等蔗區(qū)曾發(fā)生（徐正銀等，2014）。病毒復(fù)合侵染甘蔗的現(xiàn)象普遍存在，但在復(fù)合侵染過程中病毒間的關(guān)系如何、是否存在協(xié)同作用等問題尚不清楚，有待進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果反映了甘蔗花葉病、黃葉病和桿狀病等重要甘蔗病毒性病害在云南地區(qū)的發(fā)生情況，為合理制定云南地區(qū)甘蔗病毒性病害的防治策略提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

目前云南地區(qū)甘蔗病毒性病害由SrMV、SCSMV、SCYLV和SCBV侵染引起;SCBV在云南地區(qū)廣泛分布，SCYLV在云南地區(qū)有一定程度的分布;SrMV和SCSMV是引起云南地區(qū)甘蔗花葉病的2種病原，且以SCSMV為主;2種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象明顯，主要為SCYLV與SCBV復(fù)合侵染，3種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象零星發(fā)生，主要是SrMV、SCSMV與SCBV復(fù)合侵染，未發(fā)現(xiàn)4種或5種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

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