氣相色譜法分析啤酒中5種高級(jí)醇的方法研究

（長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130033）

啤酒作為一種低酒精度的飲品，因其具有良好的風(fēng)味、豐富營(yíng)養(yǎng)及良好的口感而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但是，啤酒存在著飲后出現(xiàn)頭痛、頭暈的現(xiàn)象，造成該現(xiàn)象的主要原因是由于啤酒中高級(jí)醇所導(dǎo)致[1－2]。啤酒中高級(jí)醇主要包含正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等[3]，它由原料中糖代謝通過(guò)丙酮酸的合成以及發(fā)酵過(guò)程中氨基酸降解代謝而形成[4－5]。高級(jí)醇是啤酒重要風(fēng)味成分之一，適量的高級(jí)醇能促進(jìn)酒類具有豐滿的香味和口味，并增加酒的協(xié)調(diào)性。若啤酒中不含或少含高級(jí)醇，會(huì)使酒味淡薄，酒體不豐滿。然而高級(jí)醇過(guò)量存在不單是酒主要異雜味的來(lái)源之一[6－9]，而且也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，常常會(huì)使人產(chǎn)生頭痛、惡心、嘔吐等，對(duì)人體的眼、鼻也有刺激作用，其毒性隨著分子量的增大而增加[10－13]。鑒于高級(jí)醇在啤酒中的重要性質(zhì)，測(cè)定啤酒中高級(jí)醇的組成和含量，對(duì)提高啤酒的質(zhì)量和風(fēng)味有很重要的意義。

目前，國(guó)外對(duì)啤酒中高級(jí)醇含量的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)比較成熟[14－16]，隨著消費(fèi)者要求的提高，我國(guó)一些啤酒生產(chǎn)企業(yè)和研究部門開始注意啤酒中各組分的變化，對(duì)高級(jí)醇在啤酒中的作用有了初步的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為啤酒中高級(jí)醇的適宜范圍在 50 μg/mL～100 μg/mL[17－19]，過(guò)低影響口感與風(fēng)味，過(guò)高易引起頭暈。目前測(cè)定高級(jí)醇含量的方法有頂空進(jìn)樣－氣質(zhì)聯(lián)用[20－21]、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用[22－23]等，但由于設(shè)備昂貴，測(cè)樣成本高，實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備條件的限制，不能用來(lái)進(jìn)行大批量檢測(cè)。分光光度法也可測(cè)定啤酒中各種醇的含量，但是測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確度不夠、可能產(chǎn)生系統(tǒng)誤差和選擇性不高[24－25]。本試驗(yàn)擬采用頂空固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用 （headspacesolid phase microextraction－gas chromatography，HS－SPME/GC）分析技術(shù)，采用實(shí)驗(yàn)室一般都有的氣相色譜儀，并通過(guò)頂空固相微萃取的條件優(yōu)化，嘗試建立一種快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的檢測(cè)啤酒中5種高級(jí)醇的方法，為其方法的可推廣性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

正丙醇（99.9%）、正丁醇（99.9%）、異丁醇（99.9%）、正戊醇（99.9%）、異戊醇（99.9%）標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司。

6820氣相色譜儀：美國(guó)Agilent公司，配有氫火焰離子化檢測(cè)器；Oasis固相萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜條件

進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，保持3 min，然后以10℃/min升至240℃，保持5 min，最后以15℃/min升至270℃，保持10 min；進(jìn)樣方式：分流比10∶1；載氣：高純氮?dú)?；空氣?00 mL/min；氫氣：30 mL/min；流速為0.8 mL/min。

1.2.2 萃取條件的優(yōu)化

將萃取頭插入氣相色譜（gas chromatography，GC）進(jìn)樣口中，于250℃老化2h。稱取2mL樣品超聲5 min趕去啤酒中的氣泡后，置于10 mL頂空進(jìn)樣瓶瓶中，插入萃取頭，于不同的萃取溫度下頂空萃取一段時(shí)間，于250℃解析5.0 min。分別比較不同的萃取頭、萃取溫度以及萃取時(shí)間對(duì)樣品中高級(jí)醇成分萃取效果的影響。

1.3 樣品分析

將啤酒樣品按氣相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。采用保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)添加法定性，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)比較了 HP－5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、TG－35MS（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）這3款不同的色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TG－WAXMS色譜柱進(jìn)行5種高級(jí)醇的分析色譜圖效果較好，能夠很好的分離各高級(jí)醇，并且具有良好的靈敏度，能夠滿足檢測(cè)的需要。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別設(shè)置不同的柱初始溫度（40、50、60、70℃）、分流比（5∶1、10∶1、20∶1、40∶1）以及載氣流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min），考察其對(duì)被測(cè)5種組分分離度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 5種高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5 kinds of higher alcohol standard products

結(jié)果表明：當(dāng)柱初始溫度為60℃，分流比為10∶1，載氣流速為0.8 mL/min時(shí)，5種高級(jí)醇的分離效果較好，具有較高的準(zhǔn)確度。

2.3 固相微萃取頭的選擇

由于不同材質(zhì)的固相微萃取頭對(duì)啤酒中高級(jí)醇的萃取效果不同，因此不同類型的固相微萃取頭的選擇會(huì)影響到目標(biāo)物的萃取效果。本試驗(yàn)選擇并比較了4種較常見(jiàn)的固相微萃取頭的萃取效果：85 μm聚丙烯酸酯 （polyacrylate，PA）、100 μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsil－oxane，PDMS）、65 μm 聚二甲基硅氧烷（PDMS）/二乙烯苯（divinylbenzene，DVB）以及 50/30 μm 二乙烯苯（DVB）/聚乙二醇（Carbowax）/聚二甲基硅氧烷（PDMS），萃取效果的比較見(jiàn)圖2。

圖2 4種萃取頭的萃取效果比較Fig.2 Extraction efficiencies of four solid phase microextraction fibers

由圖2可知，不同類型的固相微萃取頭對(duì)啤酒樣品中5種高級(jí)醇萃取效果有很大影響。萃取頭的萃取效果主要受萃取頭涂層極性與表面積的影響。非極性涂層可有效萃取非極性化合物，極性涂層可有效萃取極性化合物。PA、PDMS對(duì)非極性化合物萃取效果較好，而Carbowax和DVB更適用于偏極性化合物的萃取。所以本實(shí)驗(yàn)選擇的4種萃取頭中，100 μm PDMS偏非極性的固相微萃取頭對(duì)5種高級(jí)醇的萃取效果更 好，其次是 85 μm PA、50/30 μm DVB/Carbowax/PDMS 和 65 μm PDMS/DVB。因此選取 100 μm PDMS萃取頭作為此次啤酒中高級(jí)醇萃取試驗(yàn)的萃取頭。

2.4 萃取溫度的選擇

溫度對(duì)固相微萃取頭的萃取效果有雙重影響，溫度升高時(shí)，有利于高級(jí)醇的擴(kuò)散，縮短了萃取的時(shí)間，但是溫度的升高也會(huì)使目標(biāo)物在萃取頭的涂層中分配系數(shù)降低，導(dǎo)致吸附量減小，影響萃取頭的靈敏度。在萃取時(shí)間為60 min時(shí)，分別比較了100 μm PDMS萃取頭在40、50、60、70℃下對(duì)上述5種高級(jí)醇的萃取效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 萃取溫度對(duì)高級(jí)醇組分吸附的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the adsorption of higher alcohol components

結(jié)果如圖3所示，50℃條件下的萃取頭對(duì)高級(jí)醇的吸附量最大，說(shuō)明在此溫度下的萃取效果最佳。萃取溫度在40℃時(shí)，較低溫度會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物揮發(fā)的速度較慢或不完全揮發(fā)；而溫度至60℃以上時(shí)，萃取頭對(duì)高級(jí)醇的吸附量均有不同程度的減小，可能是由于目標(biāo)物隨著溫度升高在萃取頭涂層中吸附量下降所致。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇將50℃作為試驗(yàn)固相微萃取頭的萃取溫度。

2.5 萃取時(shí)間的選擇

比較分析不同萃取的時(shí)間對(duì)5種高級(jí)醇萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)高級(jí)醇組分吸附的影響Fig.4 Effect of extraction time on the adsorption of higher alcohol components

結(jié)果如圖4，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取頭對(duì)高級(jí)醇的吸附量明顯增加；當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)40 min后，萃取頭對(duì)高級(jí)醇的吸附量均有不同程度下。因此，選擇40 min作為試驗(yàn)固相微萃取頭的萃取時(shí)間。

2.6 啤酒中5種高級(jí)醇的定量分析

試驗(yàn)配制了濃度為 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL 的系列5種高級(jí)醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5種高級(jí)醇的線性關(guān)系都符合標(biāo)準(zhǔn)，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種高級(jí)醇的出峰時(shí)間、方程曲線、關(guān)聯(lián)系數(shù)、檢出限、定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 5 kinds of higher alcohol

試驗(yàn)結(jié)果表明，5種高級(jí)醇在0.1 mg/mL～5.0 mg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999），并得到5種目標(biāo)組分的檢出限0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2.69%～4.22%。

2.7 加標(biāo)回收與相對(duì)偏差試驗(yàn)

分別添加0.2、1.0、2.0 mg/mL等3個(gè)梯度濃度的高級(jí)醇混合溶液到啤酒樣品中，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率及方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method

由表2可見(jiàn)，5種組分的3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為89.6%～95.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.4%～5.3%，表明本試驗(yàn)所建立的方法能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度，可以用于啤酒樣品中高級(jí)醇的分析檢測(cè)。

2.8 樣品中目標(biāo)物的測(cè)定

按照上面確定的測(cè)定方法，對(duì)5種市售啤酒進(jìn)行氣相色譜分析外標(biāo)法定量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 啤酒樣品測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of beers

從表3可以看出，5種啤酒成品高級(jí)醇含量均未超過(guò)其風(fēng)味閾值，各組分含量適中，賦予了啤酒芳香的口味和酒體的醇厚感，圖5為其中一款樣品分析高級(jí)醇的氣相色譜圖。

圖5 啤酒樣品中高級(jí)醇的色譜圖Fig.5 Chromatograms of higher alcohols in beer samples

3 結(jié)論

本文建立了HS－SPME/GC分析啤酒中5種高級(jí)醇的方法。針對(duì)樣品中5種組分的極性性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選擇100 μm PDMS固相微萃取頭，50℃頂空萃取40 min。5種高級(jí)醇的分離采用TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱，在 0.1 mg/mL～5.0 mg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999），5種目標(biāo)組分的檢出限范圍為0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，加標(biāo)回收率范圍為89.6%～95.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～4.3%。通過(guò)GC對(duì)4種啤酒樣品中的高級(jí)醇含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均未超過(guò)其風(fēng)味閾值，各組分含量適中，賦予了啤酒芳香的口味和酒體的醇厚感。本試驗(yàn)建立的方法，可對(duì)啤酒中高級(jí)醇進(jìn)行分析和測(cè)定，有助于提高檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的分析此類樣品的效率，在實(shí)驗(yàn)室的推廣可行性較高，旨在為啤酒行業(yè)的質(zhì)量改進(jìn)提供試驗(yàn)依據(jù)。