農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白楊遺傳優(yōu)化體系研究

王蓓蓓 張 炎 金博文 王澤偉 李亦軒 趙 健 張金鳳

(北京林業(yè)大學(xué)林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局樹(shù)木花卉育種與生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

楊樹(shù) (Populus) 具有分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是造林綠化和再生生物物質(zhì)能源植株[1]。同時(shí)，具有基因組小、容易繁殖、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是林木基因工程中的理想模式樹(shù)種[2-3]。自1987年白楊派 (Leuce) 轉(zhuǎn)基因成功以來(lái)，農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens) 介導(dǎo)的楊樹(shù)，尤其是白楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究取得了較大進(jìn)展。研究表明，菌株、外植體的種類(lèi)、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、乙酰丁香酮 (AS) 濃度、菌液OD600值、暗培養(yǎng)時(shí)間等因素均可影響轉(zhuǎn)化率[4-9]。歐美雜種山楊 (Populustremula×Populustremuloides) 是歐洲山楊和美洲山楊的雜交種，因具有抗寒性強(qiáng)、耐貧瘠等特點(diǎn)，成為我國(guó)北方山地造林的優(yōu)良樹(shù)種[10-11]，且其樹(shù)形高大，樹(shù)干通直，材質(zhì)細(xì)密潔白，是造紙和建房木材等工業(yè)用材的優(yōu)質(zhì)原料[12]。在白楊轉(zhuǎn)基因研究中，歐美雜種山楊被應(yīng)用較早[13-14]，其中歐美雜種山楊353無(wú)性系離體再生體系已建立[15]，并被應(yīng)用于轉(zhuǎn)FT1基因促進(jìn)其早期開(kāi)花的研究[16]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物技術(shù)及商業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，其外源基因逃逸所帶來(lái)的安全性問(wèn)題一直受到公眾的普遍關(guān)注。目前，借助外源基因刪除系統(tǒng)、葉綠體轉(zhuǎn)化法、雄性不育法、終止子法、染色體組特異性選擇[17]等技術(shù)有望解決這一問(wèn)題。但葉綠體轉(zhuǎn)化法可適用的植物種類(lèi)有限，且遺傳穩(wěn)定性差，易于發(fā)生基因沉默[18-19]；雄性不育法雖阻斷了外源基因從花粉的逃逸[20]，但種子中仍含有外源基因;終止子法雖解決了轉(zhuǎn)基因植物外源基因通過(guò)種子傳播的問(wèn)題，但存在種子敗育的問(wèn)題，不能用于播種，迫使種植者高價(jià)購(gòu)買(mǎi)種子，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[21]。因此，這些技術(shù)的自身局限性使得其不能從根本上解決轉(zhuǎn)基因植株帶來(lái)的安全性問(wèn)題。而由Luo等[22]提出的外源基因刪除系統(tǒng)，具有徹底、特異、高效清除的特點(diǎn)，被認(rèn)為是解決轉(zhuǎn)基因植株外源基因逃逸問(wèn)題的最有效方法。其利用器官發(fā)育特異啟動(dòng)子與識(shí)別特異酶切位點(diǎn)的重組酶基因結(jié)合，將特異性器官中的外源基因刪除，而其他器官由于沒(méi)有啟動(dòng)這一套刪除系統(tǒng)依然保留所有的轉(zhuǎn)入基因，繼續(xù)發(fā)揮轉(zhuǎn)入基因帶來(lái)的優(yōu)良性狀。目前對(duì)于外源基因刪除系統(tǒng)的研究大多集中于草本植物[23]，對(duì)于木本植物研究較少，且轉(zhuǎn)化率較低[24-26]。因此在木本植物中研究外源基因刪除系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化并提高其轉(zhuǎn)化率，對(duì)于其在樹(shù)木上的應(yīng)用及后期性狀表達(dá)的檢測(cè)具有重要意義，為解決轉(zhuǎn)基因樹(shù)木外源基因逃逸問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)以白楊353無(wú)性系為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pAB5啟動(dòng)子誘導(dǎo)的外源基因刪除系統(tǒng)轉(zhuǎn)入其中，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化體系中的菌液OD600值、侵染時(shí)間、AS濃度、分化培養(yǎng)基中卡那霉素 (Kan) 和頭孢霉素 (Cef) 濃度，進(jìn)行試驗(yàn)，旨在得出轉(zhuǎn)化率較高的優(yōu)化體系，同時(shí)研究生根篩選時(shí)Kan和Cef濃度對(duì)抗性芽生根的影響，為快速評(píng)價(jià)楊樹(shù)轉(zhuǎn)化外源基因刪除系統(tǒng)的有效性研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1植株材料

將雜種白楊353無(wú)性系無(wú)菌苗培養(yǎng)于 (25 ± 2) ℃，光照為16 h/d條件下的組培室中，無(wú)菌苗繼代和擴(kuò)繁后得到的葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。

1.1.2菌株與載體

本研究所用農(nóng)桿菌菌株為GV3100，植物表達(dá)載體為pBIN19。外源基因刪除系統(tǒng)載體結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 pAB5誘導(dǎo)的外源基因刪除系統(tǒng)Fig.1 The GM-gene deletor system induced by the pAB5 promoter

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1侵 染

在無(wú)菌條件下取生長(zhǎng)良好的無(wú)菌苗第1～3片葉片，剪成0.5 cm × 1.0 cm的葉盤(pán)，近軸端向下放在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 0.01 mg/L TDZ) 中預(yù)培養(yǎng)3 d后，浸入菌液OD600值為0.6～1.2的菌液中侵染6～12 min并輕輕振蕩；取出葉盤(pán)，用無(wú)菌濾紙吸干；將葉盤(pán)轉(zhuǎn)入含有100～400 mol/L AS的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)；3 d后放在20～35 mg/L Kan和300～450 mg/L Cef的培養(yǎng)基上篩選3～4周，每10 d換1次培養(yǎng)基；抗性芽高于1.5 cm時(shí)，將抗性芽轉(zhuǎn)入篩選生根培養(yǎng)基 (1/2 MS + 0.2 mg/L IBA + 0.2 mg/L NAA) 中培養(yǎng)，生根篩選培養(yǎng)基中Kan濃度為20、25 mg/L，Cef濃度為200 mg/L。

以上培養(yǎng)基中添加3%蔗糖，5 g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8；侵染后葉盤(pán)在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照為16 h/d，溫度 (25 ± 2) ℃。

1.2.2GUS染色檢測(cè)

取篩選生根抗性353無(wú)性系的葉片，放入2 mL離心管中進(jìn)行染色。采用Gallagher[27]方法進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。用95%乙醇洗去葉片表面的浮色，以未轉(zhuǎn)化的353無(wú)性系葉片作為對(duì)照。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

用優(yōu)化體系得到的抗性生根植株進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，采用CTAB法提取353無(wú)性系葉片基因組DNA，以質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的353無(wú)性系基因組DNA為陰性對(duì)照。GUS基因特異性引物5′-GCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGG-3′,5′-CAGGAGCAAGGTGAGATGACAGG AGAT-3′,PCR

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

以O(shè)D600值、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)基中AS濃度、分化培養(yǎng)基中Kan和Cef的濃度為因素，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平，采用L16(45) 正交設(shè)計(jì) (表1) 優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的353無(wú)性系遺傳轉(zhuǎn)化體系。共16個(gè)處理，每個(gè)處理檢測(cè)30個(gè)葉盤(pán)，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后，按公式 (1) 計(jì)算再生抗性芽的葉盤(pán)數(shù)，采用Kan抗性芽葉盤(pán)數(shù)的百分率作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化效果的指標(biāo)。極差值R=(k(最大值)-k(最小值))，Kx表示在Tx條件下獲得的葉盤(pán)分化率的總和，kx表示在Tx條件下葉盤(pán)分化率的平均值。

1.3.2生根培養(yǎng)基抗生素濃度的優(yōu)化設(shè)計(jì)

將得到的353無(wú)性系抗性芽放入分別含有20 mg/L Kan、200 mg/L Cef和25 mg/L Kan、200 mg/L Cef的生根培養(yǎng)基中，15 d后觀察抗性芽在不同濃度Kan和Cef組合的生根情況，并統(tǒng)計(jì)生根率，每次試驗(yàn)隨機(jī)選取抗性芽30個(gè)，重復(fù)3次，按公式 (2) 計(jì)算生根率。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 17對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行方差和極差的分析，Duncan檢驗(yàn)分析樣本間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉盤(pán)分化率優(yōu)化的結(jié)果分析

葉盤(pán)分化30 d后觀察其分化狀況，在16個(gè)處理中，T6分化芽最多，且長(zhǎng)勢(shì)比較健壯，其次是T5、T7、T2，而其他處理還未見(jiàn)分化 (圖2)。其中T5、T6、T7中菌液OD600值均為0.8，T2菌液OD600值為0.6，表明菌液OD600值對(duì)抗性芽的產(chǎn)生有較大的影響。T1～T16獲得的葉盤(pán)分化率分別為0、20%、6.67%、0、60%、66.67%、56.67%、6.67%、20%、3.33%、13.33%、6.67%、3.33%、0、0、0。

由表2可知，葉盤(pán)分化率為0～66.67%。353無(wú)性系遺傳優(yōu)化體系為預(yù)培養(yǎng)3 d，菌液OD600值0.8，侵染時(shí)間8 min， AS濃度200 μmol/L，共培養(yǎng)時(shí)間3 d，篩選培養(yǎng)基中加入35 mg/L Kan，350 mg/L Cef。轉(zhuǎn)化率隨著菌液OD600值增加表現(xiàn)為先增加后降低，在菌液OD600值為0.8時(shí)，葉盤(pán)分化率達(dá)到最大；隨著侵染時(shí)間的增加，也顯示出先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)侵染時(shí)間為8 min時(shí)，遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳；隨AS的濃度改變，轉(zhuǎn)化率整體趨勢(shì)也為先增后減，在200 μmol/L時(shí)獲得轉(zhuǎn)化率最高；隨著Kan濃度的增加轉(zhuǎn)化率整體趨勢(shì)是隨著提高，在最高濃度35 mg/L時(shí)獲得轉(zhuǎn)化率最高；隨著Cef濃度的增加，轉(zhuǎn)化率先提高后降低，在濃度為350 mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高。

圖2 30 d時(shí)葉盤(pán)分化狀況Fig.2 Leaf disc differentiation at 30 days

表2 L16(45) 正交表設(shè)計(jì)及極差分析Table 2 L16(45) orthogonal tests and range analysis

在極差分析中，極差R值的大小反應(yīng)了每個(gè)因素對(duì)于試驗(yàn)的影響程度，R值越大，說(shuō)明該因素對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果影響越明顯。從表3的極差計(jì)算結(jié)果可以看出，5個(gè)因素的R值為菌液OD600值 > 篩選培養(yǎng)基中Cef的濃度 > 侵染時(shí)間 > 共培養(yǎng)基中AS濃度 > 篩選培養(yǎng)基中Kan的濃度，因此對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的影響從大到小排列為菌液OD600值、篩選培養(yǎng)基中Cef的濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)基中AS濃度、篩選培養(yǎng)基中Kan的濃度。

極差分析不能估計(jì)試驗(yàn)誤差，因此無(wú)法分析試驗(yàn)的精度。為了判斷5個(gè)因素對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的影響是否顯著，本研究對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，這5個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響都達(dá)到顯著水平，其中F值大小順序?yàn)榫篛D600值 > 篩選培養(yǎng)基中Cef的濃度 > 共培養(yǎng)基中AS濃度 > 篩選培養(yǎng)基中Kan的濃度 > 侵染時(shí)間，表明獲得的葉盤(pán)分化率的差異在用4種不同菌液OD600值時(shí)差異最大，其次是在篩選培養(yǎng)基中4種Cef濃度之間的差異，共培養(yǎng)基中4種不同AS濃度獲得的抗性芽葉盤(pán)率差異相對(duì)減少，利用篩選培養(yǎng)基中4種不同Kan濃度獲得的葉盤(pán)分化率差異更小，用4種不同侵染時(shí)間獲得的轉(zhuǎn)化率差異最小。

表3 正交試驗(yàn)各因素方差分析Table 3 Variance analysis for each factor of orthogonal tests

采用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系，預(yù)培養(yǎng)3 d，OD600值0.8，侵染時(shí)間8 min，AS濃度200 μmol/L，共培養(yǎng)時(shí)間3 d，篩選培養(yǎng)基中加入35 mg/L Kan，350 mg/L Cef，轉(zhuǎn)化353無(wú)性系，得到分化芽，并統(tǒng)計(jì)獲得葉盤(pán)分化率為80.00%?？剐匝扛叨葹?.5～2 cm時(shí)，接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根篩選。

2.2 生根優(yōu)化的結(jié)果分析

由圖3可知，在25 mg/L Kan，200 mg/L Cef中根的生長(zhǎng)比較緩慢且側(cè)根少，生根率達(dá)到53.33%，在20 mg/L Kan，200 mg/L Cef中根生長(zhǎng)健壯且側(cè)根比較多根生長(zhǎng)，生根率達(dá)到73.33%。對(duì)未生根的抗性芽進(jìn)行GUS染色和PCR檢測(cè)，GUS未變藍(lán)色且PCR無(wú)條帶，說(shuō)明未生根抗性芽為假陽(yáng)性抗生素濃度的增加使假陽(yáng)性抗性芽的數(shù)量減少，后期只需對(duì)生根的抗性芽進(jìn)行檢測(cè)?？剐匝吭诤?5 mg/L Kan的生根培養(yǎng)基中生根緩慢，但楊樹(shù)的生長(zhǎng)狀況與未轉(zhuǎn)基因植株的沒(méi)有差異，與添加20 mg/L的Kan的篩選作用相比，其明顯減少了后期的GUS染色和PCR檢測(cè)的工作量，因此利用25 mg/L Kan對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株的篩選效果更好。

a. 25 mg/L Kan、200 mg/L Cef生根培養(yǎng)基中抗性芽生根狀況；b. 20 mg/L Kan、200 mg/L Cef生根培養(yǎng)基中抗性芽生根狀況。

在25 mg/L Kan和200 mg/L Cef的生根篩選培養(yǎng)基中，隨機(jī)選取20株生根植株的葉片進(jìn)行GUS染色，獲得8株植株葉片呈藍(lán)色，未轉(zhuǎn)化植株葉片未變藍(lán)，其中1～6為GUS陽(yáng)性植株葉片，7為未轉(zhuǎn)化植株葉片 (圖4)。初步證明7株植株為陽(yáng)性植株。

1～6. GUS 陽(yáng)性 ‘353無(wú)性系’；7. 未轉(zhuǎn)基因 ‘353無(wú)性系’。

2.4 轉(zhuǎn)基因353無(wú)性系的PCR檢測(cè)

對(duì)抗性植株葉片進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別以陽(yáng)性質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)化的353無(wú)性系作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖5。共檢測(cè)到具有特異性條帶的陽(yáng)性植株7株，未轉(zhuǎn)化植株無(wú)條帶， M為Marker2000，1～7為轉(zhuǎn)基因植株，8為質(zhì)粒，9為未轉(zhuǎn)化植株，證明pAB5啟動(dòng)子誘導(dǎo)的刪除系統(tǒng)已經(jīng)整合到353無(wú)性系基因中。

M. Maker 2000; 1～7；轉(zhuǎn)基因植株；8. 質(zhì)粒；9.未轉(zhuǎn)基因植株。

3 結(jié)論與討論

高效轉(zhuǎn)化體系是獲得大量轉(zhuǎn)基因植株的前提。合適的菌液OD600值是獲得抗性芽的前提，后期的抑菌抗生素濃度是葉盤(pán)正常分化的必要條件，侵染時(shí)間和菌液OD600值的相互協(xié)調(diào)作用是獲得抗性芽同時(shí)又能在后期抑制菌生長(zhǎng)的保證，AS濃度的適宜提高葉盤(pán)分化抗性芽的數(shù)量，Kan濃度的確定是篩選抗性芽、減少后期檢測(cè)工作量的前提。每個(gè)因素對(duì)于葉盤(pán)轉(zhuǎn)化率的提高都是必不可少的。本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了白楊轉(zhuǎn)化優(yōu)化體系，利用優(yōu)化體系進(jìn)行353無(wú)性系的分化，得到葉盤(pán)分化率為80.00%，生根篩選時(shí)生根率達(dá)到53.33%，這比賈小明等[28]以白楊353轉(zhuǎn)化FT1基因獲得29.84%卡那霉素抗性植株再生率明顯提高；PCR檢測(cè)后得到7株陽(yáng)性植株，而賈婕等[17]以白楊353和717為材料僅獲得2株陽(yáng)性植株。

轉(zhuǎn)化率的提高可能與菌液OD600值及侵染時(shí)間有關(guān)。在轉(zhuǎn)化雜交楊 (山楊 × 新疆楊) (P.davidia-

na×P.bollena) 時(shí)，菌液OD600值為0.8，侵染時(shí)間為20 min時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，增加或者降低菌液OD600值轉(zhuǎn)化率均降低，延長(zhǎng)或縮短侵染時(shí)間也使轉(zhuǎn)化率降低[8]。以南林895楊 (P.deltoides×P.euramer-

icana) 為材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)菌液OD600值為0.7，侵染時(shí)間為120 min時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，增加或者降低菌液OD600值均降低了轉(zhuǎn)化率[9]。主要因?yàn)檗r(nóng)桿菌菌液OD600值和侵染時(shí)間直接影響T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率，菌液OD600值過(guò)大或侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使外植體褐化，菌液OD600值過(guò)小或侵染時(shí)間過(guò)短使農(nóng)桿菌吸附到外植體表面的菌液過(guò)少?gòu)亩档土宿D(zhuǎn)化率[29]。本研究中優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系中菌液OD600值為0.8，侵染時(shí)間為8 min時(shí)葉盤(pán)分化率最高，與賈小明等[28]中的菌液OD600值為0.5，侵染時(shí)間為60 min相比，菌液OD600值增加而侵染時(shí)間降低，而王斌[24]的侵染時(shí)間僅為5 min，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)增加侵染時(shí)間會(huì)增加轉(zhuǎn)化率，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則降低了轉(zhuǎn)化率。

AS濃度也可對(duì)轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生影響。AS是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化楊樹(shù)中常用的有效Vir基因誘導(dǎo)物，其活化了Vir區(qū)基因從而增加了T-DNA的轉(zhuǎn)移。在以雜交楊NC5331 (P.nigravar.betulifolia×P.trichocarpa) 為材料的遺傳轉(zhuǎn)化中，加入AS可使轉(zhuǎn)化率增加，且在25 μmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率最高[30]。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雜交山楊pcg (P.canescens×P.grandidentata) 時(shí)，在菌液和分化培養(yǎng)基中添加AS能提高抗性芽葉盤(pán)的百分率，且隨著AS濃度的增加抗性芽葉盤(pán)的百分率升高[31]。本研究中AS濃度為200 μmol/L時(shí)葉盤(pán)分化率最高，這與Confalonieri等[32]的研究結(jié)果一致。

培養(yǎng)基中抗生素種類(lèi)及濃度也會(huì)影響轉(zhuǎn)化率?？股啬苡行У囊种啤⑺兰?xì)菌，防止其影響植株的再生和正常生長(zhǎng)，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，Kan多作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的選擇抗生素[33]。Kan雖能篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，但濃度過(guò)大時(shí)會(huì)抑制愈傷組織和分化芽的形成，濃度過(guò)小則會(huì)產(chǎn)生假抗性芽和嵌合體[31-32,34-35]。同時(shí)，分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基所用的Kan濃度不同，通常生根培養(yǎng)基中的濃度會(huì)低于分化培養(yǎng)中的濃度[36-37]。本實(shí)驗(yàn)分化培養(yǎng)基中的Kan濃度為35 mg/L時(shí)葉盤(pán)分化率最大，生根培養(yǎng)基中的Kan為25 mg/L。同時(shí)，抑菌抗生素在農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化中能有效抑制農(nóng)桿菌繁殖，但也對(duì)植物細(xì)胞具有傷害作用[33]，因此適合的抑菌抗生素濃度對(duì)于提高轉(zhuǎn)化率非常必要。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因中因菌株不同，抑菌抗生素也不同。本實(shí)驗(yàn)選擇Cef為抑菌抗生素，其濃度為350 mg/L時(shí)，抗性芽葉盤(pán)的百分率最高，而生根培養(yǎng)基中選擇200 mg/L Cef為篩選濃度。Kan的作用是篩選抗性芽，但具有抑制葉盤(pán)分化的作用，本實(shí)驗(yàn)中得到的優(yōu)化體系Kan濃度為最大濃度，以后的實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)增加其濃度探索得到葉盤(pán)分化率更高且對(duì)葉盤(pán)分化抑制作用較小的濃度。

生根時(shí)進(jìn)行篩選的作用是抑制或者殺死非轉(zhuǎn)化不定芽，避免產(chǎn)生大量的非轉(zhuǎn)化植株，從而減少后期檢測(cè)的工作量[38]。本研究中抗性芽在含有25 mg/L Kan、200 mg/L Cef生根培養(yǎng)基中生根率達(dá)到53.33%，且更具有篩選作用。但在龍萃等[33]的研究中用了50 mg/L Kan作為生根篩選的最終濃度，筆者仍然需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和研究。

致謝：感謝美國(guó)康涅迪格大學(xué)的李義教授為本實(shí)驗(yàn)提供的雜交353楊和pBIN19載體。