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    呼倫貝爾市首例羊源莢膜D群多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

    2018-09-10 01:31:38烏云塔娜格根塔娜劉連發(fā)田宗民蘇日古格賈長生王冠玉趙忠武
    關(guān)鍵詞:殺性莢膜病料

    王 巍,烏云塔娜,格根塔娜,劉連發(fā),田宗民,邱 凱,蘇日古格,賈長生,王冠玉,趙忠武

    (1.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市獸醫(yī)科學(xué)研究所,呼倫貝爾 021000;2.新巴爾虎右旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,新巴爾虎右旗 021300;3.海拉爾區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,海拉爾 021000)

    多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)感染能夠引起動(dòng)物多種疾病,包括牛出血性敗血癥、羊地方性流行性肺炎、豬萎縮性鼻炎、禽霍亂等,并可以引起人類疾病[1,2]。Pm呈世界性分布,對(duì)動(dòng)物的致病率和死亡率均較高。根據(jù)莢膜抗原和脂多糖的不同,可將多殺性巴氏桿菌(Pm)分為5個(gè)血清群(A、B、D、E、F)和16個(gè)血清型(1~16)。我國有A、B、D 3個(gè)血清群,其中豬以5∶A型、6∶B型為主,牛羊以6∶B型最多,家禽以5∶A最多[3]。Pm不同莢膜血清型菌株之間交叉保護(hù)率較低,且各菌株在流行病學(xué)、毒力、生物學(xué)特征等方面的差異顯著[4],因此準(zhǔn)確快速地鑒定莢膜血清型以及找到地方性流行株的敏感藥物是預(yù)防和控制巴氏桿菌病的關(guān)鍵。

    羊巴氏桿菌病又稱羊鼻疽、羊出血性敗血癥,常呈地方流行,多發(fā)生于春、秋季節(jié)[5,6]。內(nèi)蒙古呼倫貝爾是我國養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)地區(qū)之一,隨著羊養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,全市羊巴氏桿菌病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究以呼倫貝爾市地區(qū)鄂溫克旗兩個(gè)羊場出現(xiàn)的體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、頸向前伸、咳嗽、腹瀉、鼻孔有出血甚至死亡的病羊?yàn)檠芯繉?duì)象,采集病變組織,利用細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)鑒定技術(shù)[7,8]和Townsend等[9]建立的多殺性巴氏桿菌定種的PCR鑒定方法,鑒定多殺性巴氏桿菌及其莢膜血清型,并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)找到針對(duì)流行株的敏感藥物,為本地區(qū)羊呼吸道疾病病原種類的確定、研制針對(duì)性疫苗以及診斷技術(shù)的研究提供依據(jù)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 病料來源 2份羊肺組織病料均采集自呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗,編號(hào)EY1,EY2。

    1.1.1 臨床癥狀 EY1為2017年5月送檢的病死種公羊。其來源的羊場已死亡7只羊,部分病羊主要表現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、頸向前伸、咳嗽、腹瀉、鼻孔有出血、眼結(jié)膜潮紅、有的頸部發(fā)生水腫,病程為2~5 d。個(gè)別羊突然發(fā)病,全身寒戰(zhàn)、虛弱、呼吸困難并伴有抽搐等癥狀,數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。EY2為2017年7月送檢病死羊,其來源的羊場已死亡30只左右,病羊主要表現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、腹瀉、口中有白沫,用驅(qū)蟲、退燒藥等均無效。

    1.1.2 剖檢變化 通過對(duì)送檢病羊進(jìn)行剖檢,EY1呈急性死亡,器官病變不明顯。EY2可見胸腔內(nèi)有黃色積液,肺淤血、充血、水腫、有小出血點(diǎn)和肝變,脾臟腫大且邊緣不齊,胃腸道有出血性炎癥;心臟蒼白、質(zhì)地柔軟。

    1.2 試劑 酵母提取粉、胰蛋白胨均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;革蘭氏染色液、瑞士染色液購自南京建成科技有限公司;DNA Marker2000、HotMaster Taq DNA Polymerase、細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)室鏡檢 取新鮮無菌病死羊肺組織進(jìn)行涂片、干燥、固定,用革蘭氏染色法和瑞士染色法染色鏡檢,觀察形態(tài)特征。

    1.4 細(xì)菌培養(yǎng) 取新鮮無菌病料劃線接種于LB血瓊脂平板固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落生長情況,并將疑似菌落進(jìn)行染色鏡檢。同時(shí)取新鮮無菌病料劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基。

    1.5 細(xì)菌DNA提取 挑取LB血瓊脂平板上單個(gè)菌落,接種于5%胎牛血清LB液體培養(yǎng)基中,37℃ 200r/min,震蕩孵育18~24 h;取2 mL培養(yǎng)菌液 2500×g離心10 min,棄上清;采用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

    1.6 Pm雙重PCR鑒定 參考Townsend等[9]合成的Pm種特異性基因KMT1引物以及A 群、B群、D群、E群、F群的莢膜血清型特異性基因引物(表1),引物由北京華大基因生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將提取的肺組織基因組 DNA 作為 PCR 擴(kuò)增的模板,先用鑒定巴氏桿菌引物KMT1擴(kuò)增待檢樣品,然后利用鑒定其莢膜血清型引物capA、capB、capD、capE、capF進(jìn)行雙重PCR,擴(kuò)增目標(biāo)序列。兩輪PCR反應(yīng)體系及條件一樣,采用50 μL反應(yīng)體系:其中上下游引物各2 μL,10×PCR Buffer 5μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL,ddH2O 34.5 μL,Taq DNA Polymerase(5 U/μL)含MgCl20.5 μL,DNA模板2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。

    表1 巴氏桿菌特異引物序列Table 1 The Pm primers

    1.7 序列測定和進(jìn)化樹分析 陽性樣品送吉林庫美生物技術(shù)有限公司測序鑒定,結(jié)果與GenBank發(fā)表的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行比對(duì)分析。搜索GenBank中已提交多殺性巴氏桿菌序列,應(yīng)用BioEdit軟件與樣品序列比較,MEGA5.0軟件繪制進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析。

    1.8 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)參照國家檢驗(yàn)操作規(guī)程采用紙片瓊脂擴(kuò)散法,又稱圓通平板法[10]。把經(jīng)過24 h純培養(yǎng)的分離到的巴氏桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行10倍稀釋,并在鮮血瓊脂平板上進(jìn)行接種,按照0.2 mL對(duì)每個(gè)平板進(jìn)行接種,并涂抹均勻。在保持紙片間的適當(dāng)距離的基礎(chǔ)上,用經(jīng)過消毒后的無菌鑷子把各藥敏片按順序平鋪于培養(yǎng)基表面,放置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。藥物選擇參照呼倫貝爾市羊病常用藥物及文獻(xiàn)[11-13],判定方法參照杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn),觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑。

    2 結(jié)果

    2.1 菌株形態(tài)特征和生長特性 病料革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓、兩極著色的陰性短桿菌;瑞士染色無鞭毛及芽孢,莢膜顯著。病料分離菌株在血平板上生長良好,呈清亮、淡灰白色、閃光的露珠狀,濕潤黏稠樣,菌落周圍不溶血。在普通LB瓊脂培養(yǎng)基上生長貧瘠,在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長。

    圖1 分離菌株血平板培養(yǎng)及革蘭氏、瑞氏染色結(jié)果Fig.1 Results of isolated bacterial Gram stain and Wright’s stain

    2.2 雙重PCR鑒定結(jié)果 Pm種特異性基因KMT1引物擴(kuò)增出460 bp片段(圖A),用Pm 種特異性基因KMT1引物分別和A 群、B群、D群、E群、F群的莢膜血清型特異性基因引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,只有KMT1和D群引物擴(kuò)增出近460 bp和648 bp的2條特異性條帶,而KMT1和A群、KMT1和B群、KMT1和E群、KMT1和F群都只擴(kuò)增出1條460 bp的特異性條帶(圖B)。

    圖2 培養(yǎng)Pm的PCR(A)以及血清型鑒定(B)結(jié)果Fig.2 Results of PCR(A) and serotype identification of isolated Pm

    2.3 測序結(jié)果比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析 本研究擴(kuò)增的特異性基因KMT1的序列與Genbank中巴氏桿菌印度株(登錄號(hào):KY825087)同源性高達(dá)100%,與KX348143、KX449351、CP023305同源性高達(dá)99%,可以判斷分離培養(yǎng)菌為多殺性巴氏桿菌;擴(kuò)增的莢膜血清型特異性基因序列與GenBank中巴氏桿菌AF439804、AF302465、CP003313同源性高達(dá)99%,可以判斷分離培養(yǎng)菌為多殺性巴氏桿菌莢膜血清D群。

    2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)如表2,分離菌株對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素耐藥,對(duì)諾氟沙星、卡那霉素、環(huán)丙沙星等藥物均不敏感。

    3 討論

    圖3 培養(yǎng)菌株KMT1基因遺傳進(jìn)化分析Fig.3 KMT1 gene phylogeny analysis of isolated strains

    多殺性巴氏桿菌可以引起多種動(dòng)物和人類疾病,是一種人畜共患病原。在國內(nèi)多殺性巴氏桿菌是引起綿羊及山羊呼吸道疾病的常見病原,由于廣泛存在于羊的各個(gè)生長階段,經(jīng)常導(dǎo)致羊生長性能降低甚至死亡,給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大損失,尤其近年來養(yǎng)羊業(yè)呈快速集約化發(fā)展,國內(nèi)外引種不斷加大,各地區(qū)羊只頻繁調(diào)動(dòng)流通,巴氏桿菌病暴發(fā)也與日俱增。因此定期進(jìn)行預(yù)防接種,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該病的特異性免疫力才是防控巴氏桿菌病發(fā)生最有效最直接的方法,但由于多殺性巴氏桿菌存在A、B、D、E、F共5個(gè)莢膜血清群,各血清型之間大多無交叉免疫原性,某型菌株疫苗只對(duì)同型有較好的保護(hù)作用,致使在臨床上預(yù)防Pm的傳統(tǒng)疫苗效果不佳[14-15],因此調(diào)查研究本地區(qū)流行的莢膜血清型、研制針對(duì)羊某型Pm的疫苗對(duì)防治羊呼吸道疾病,減少經(jīng)濟(jì)損失十分迫切。

    本研究正是利用雙重PCR方法對(duì)Pm進(jìn)行莢膜血清型鑒定,通過結(jié)果分析表明2株羊源Pm均為莢膜血清D群。經(jīng)序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化樹分析,EY1、EY2與印度分離株同源性高達(dá)100%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對(duì)氯霉素、氟氧沙星、哌拉西林等藥物敏感,對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素已耐藥,對(duì)諾氟沙星、卡那霉素、環(huán)丙沙星等藥物已不敏感。筆者通過走訪得知有關(guān)羊呼吸系統(tǒng)疾病的抗感染失敗的現(xiàn)象已屢見不鮮,多數(shù)病例對(duì)常用抗菌藥物表現(xiàn)抗性,呈反復(fù)發(fā)病,最終導(dǎo)致治療失敗,死亡率增加,這與羊場長期大劑量的使用抗生素治療不無關(guān)系。本研究臨床分離的D群Pm不僅為研制相應(yīng)的疫苗及科學(xué)防治巴氏桿菌病提供依據(jù),同時(shí)對(duì)Pm疾病暴發(fā)的流行病學(xué)監(jiān)測和基因多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。但限于收集的細(xì)菌株有限,有待對(duì)呼倫貝爾地區(qū)Pm進(jìn)一步監(jiān)測流調(diào),找到本地區(qū)流行的莢膜血清型,為有效防控該地區(qū)羊巴氏桿菌病提供科學(xué)依據(jù),進(jìn)而提高養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

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