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    雞IRF7原核表達(dá)及多克隆抗體制備

    2018-09-10 01:31:40許默儒邵紅霞葉建強秦愛建
    中國動物傳染病學(xué)報 2018年4期
    關(guān)鍵詞:真核原核條帶

    朱 敏,王 琳,許默儒,錢 琨,3,4,邵紅霞,4,葉建強,4,秦愛建,3,4,5

    (1.揚州大學(xué) 省部共建教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室,揚州 225009;2.揚州大學(xué) 江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室,揚州 225009;3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室,揚州 225009;4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控

    協(xié)同創(chuàng)新中心,揚州 225009;5.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室,揚州 225009)

    干擾素是一類具有抵抗病毒感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤等多種功能的細(xì)胞因子,是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。干擾素包括兩類:Ⅰ型干擾素(IFN-α、IFN-β)和Ⅱ型干擾素(IFN-γ),Ⅰ型干擾素由多種細(xì)胞在病毒感染時產(chǎn)生,Ⅱ型干擾素由T細(xì)胞和天然殺傷性細(xì)胞產(chǎn)生[2]。

    干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)是在I型IFN基因的轉(zhuǎn)錄激活中起著重要作用的IRF家族成員,在誘導(dǎo)和激活抗病毒因子、誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、激活免疫細(xì)胞、炎癥反應(yīng)、凋亡、分化等方面發(fā)揮著重要的作用[3-5]。IRF7的N端是具有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,C端包含多個調(diào)控結(jié)構(gòu)域:信號反應(yīng)結(jié)構(gòu)域、組成性激活結(jié)構(gòu)域、病毒激活結(jié)構(gòu)域、抑制結(jié)構(gòu)域[6,7]。在大多數(shù)細(xì)胞類型中,IRF7的表達(dá)水平都非常低[8]。IRF7主要在免疫系統(tǒng)中表達(dá),如淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等,即IRF7是一種特異于淋巴組織的因子[9]。IRF7存在于細(xì)胞漿中,其表達(dá)不是組成型的,IRF7的活性主要通過蛋白水平調(diào)節(jié),IFN、LPS或病毒感染處理細(xì)胞后可誘導(dǎo)IRF7的表達(dá)[7]。研究雞IFN信號通路,離不開對IRF7作用的深入研究,但是由于目前尚無雞源IRF7抗體,給研究雞IFN信號通路帶來巨大瓶頸。

    本研究從雞淋巴細(xì)胞中獲得IRF7基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體,將原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物作為免疫原免疫小鼠,并用本實驗室保存的真核質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG進(jìn)行鑒定,成功獲得雞IRF7多抗,為進(jìn)一步研究IRF7在誘導(dǎo)IFN信號通路中的作用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 載體細(xì)胞和實驗動物 原核表達(dá)載體pCOLDTF、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rIgG、pcDNA3.1-chIRF7-rIgG、大腸桿菌BL21(DE3)和DF1細(xì)胞均由本實驗室保存;pcDNA3.1-rIgG由本實驗室構(gòu)建,該質(zhì)粒是在真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中插入了兔IgG,具體兔IgG序列參考吳曉平[10]論文;BALB/c小鼠由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

    1.1.2 試劑 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa公司;總RNA小量制備試劑盒購自AxyPrep公司;膠回收試劑盒購自QIAGEN公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Kpn I、EcoR I購于賽默飛世爾科技公司;轉(zhuǎn)染試劑Trans-IT1購于Mirus公司;FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG全分子抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG全分子抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG全分子抗體、HISTOPAQUE-1083均購于Sigma公司;RIPA Buffer細(xì)胞裂解液購自Cell Signaling Technology公司;質(zhì)粒小提試劑盒、抗HIS標(biāo)簽鼠單克隆抗體、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購于北京康為世紀(jì)公司。

    1.2 方法

    1.2.1 雞淋巴細(xì)胞cDNA的獲得 采取2月齡SPF雞抗凝血3 mL,用PBS 1:1稀釋,將其緩慢加入到6 mL HISTOPAQUE-1083淋巴細(xì)胞分離液中,500×g離心20 min,將中間層白色絮狀物淋巴細(xì)胞吸出。根據(jù)AxyPrep總RNA小量制備試劑盒操作說明提取雞淋巴細(xì)胞總RNA,并用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得雞淋巴細(xì)胞cDNA。

    1.2.2 雞IRF7基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中公布的雞IRF7基因的序列,利用DNAStar設(shè)計合成引物。上游引物:5'-CGGGGTACCATGGCAGCACTGGA CAGCG-3' (引入KpnⅠ酶切位點),下游引物:5'-CCGGAATTCGTCTGTCTGCATGTGGTATTG CTC-3'(引入EcoRⅠ酶切位點),以雞淋巴細(xì)胞cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存,PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收純化目的條帶,-20℃儲存。

    1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將pCOLD-TF原核表達(dá)載體和IRF7目的片段經(jīng)EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切,將載體和目的片段分別進(jìn)行膠回收后按1:3的比例用T4 DNA連接酶連接過夜,將過夜后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21,轉(zhuǎn)化后的BL21涂布含氨芐青霉素的LB平板,置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,挑取單菌落培養(yǎng),按質(zhì)粒小提試劑盒操作說明提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定的陽性質(zhì)粒送南京華大基因技術(shù)有限公司測序,將測序正確的質(zhì)粒命名為pCOLD-TF-chIRF7。

    1.2.4 IRF7重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot鑒定 取含pCOLD-TF-chIRF7重組質(zhì)粒和空載體的BL21陽性菌1:100分別接種于含氨芐抗性的2YT培養(yǎng)基中,225 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD值約為0.6~0.8時,加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L,150 r/min、16℃誘導(dǎo)20 h。收集菌體加入PBS進(jìn)行超聲破碎,5000×g 離心15 min,各取100 ng上清和沉淀蛋白樣品,加ddH2O定容至20 μL,并各加入5 μL的5×SDS Loading Buffer煮沸5 min后冰浴2 min進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,分析目的蛋白的表達(dá)情況。Western blot試驗:首先采用5%的濃縮膠和12%的分離膠,按實驗室常規(guī)程序進(jìn)行SDS-PAGE分析。然后將分離膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上。轉(zhuǎn)印后硝酸纖維膜用5%的脫脂乳37℃封閉3 h,一抗為抗HIS標(biāo)簽鼠單克隆抗體,37℃孵育1 h ,PBST洗3次,二抗為HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L),37℃孵育1 h,PBST洗4次,ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色后觀察結(jié)果。試驗同時設(shè)計空載體菌對照。

    1.2.5 小鼠免疫 將SDS-PAGE膠中的目的蛋白(大小約107 kDa處)條帶切下并脫色,抽真空隔后加入PBS,腹腔注射5 w齡的雄性BALB/c小鼠,10 d免疫1次,第3次免疫后7 d采集小鼠尾靜脈血清進(jìn)行激光共聚焦和Western blot試驗。

    1.2.6 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞 將處于對數(shù)生長期的DF1細(xì)胞用胰酶消化,接種于24孔細(xì)胞板中,放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞板70%~90%,將質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG、pcDNA3.1-rIgG分別轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染過程按照轉(zhuǎn)染試劑Trans-IT1說明書操作。

    1.2.7 激光共聚焦分析 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞48 h后,用3%的多聚甲醛固定20 min,0.25%Triton X-100室溫作用5 min,2%BSA室溫封閉30 min,然后用原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物免疫的鼠血清(1:100)37℃孵育45 min,PBS清洗4次,再用FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1:200)37℃避光孵育40 min,PBS清洗5次,最后經(jīng)DAPI染細(xì)胞核10 min,PBS清洗1次,設(shè)陽性、陰性對照,在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

    1.2.8 Western blot分析 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-IgG轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞48 h,用PBS清洗1次細(xì)胞,用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下,4℃、500×g離心5 min,用RIPA Buffer重懸細(xì)胞沉淀,同時加入蛋白酶抑制劑。置于冰上充分裂解30 min,裂解后1500×g離心10 min,收集上清。取20 μL裂解蛋白上清加入5×SDS Loading Buffer煮沸5 min后冰浴2 min進(jìn)行Western blot分析。一抗為原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物免疫的鼠血清(1:100),37℃孵育1 h ,PBS洗3次,二抗為HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L),37℃孵育1 h,PBS洗4次,ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色后觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 雞IRF7的PCR擴(kuò)增結(jié)果 按上述方法,將雞淋巴細(xì)胞進(jìn)行RNA提取,通過反轉(zhuǎn)錄,然后PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果在1473 bp左右處有特異性條帶(見圖1),大小與預(yù)期相符合。

    2.2 成功構(gòu)建chIRF7原核表達(dá)載體 將PCR產(chǎn)物直接克隆至pCOLD-TF,構(gòu)建pCOLD-TF-chIRF7重組質(zhì)粒,雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,在5770 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶,為pCOLD-TF載體。在1473 bp處出現(xiàn)一條特異性目的條帶(見圖2),大小與預(yù)期相符合,測序結(jié)果證實原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

    圖1 IRF7基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of IRF7 gene by PCR

    圖2 pCOLD-TF-chIRF7雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Restriction enzyme analysis

    2.3 chIRF7融合蛋白的表達(dá)及鑒定結(jié)果 將IPTG誘導(dǎo)的重組菌體超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot試驗,SDS-PAGE結(jié)果顯示,與對照組空載體相比,pCOLD-TF-chIRF7重組表達(dá)菌上清和沉淀中均出現(xiàn)目的條帶,大小約為107 kDa。而對照組上清和沉淀在107 kDa處均未出現(xiàn)目的條帶,而只在52 kDa處出現(xiàn)特異性空載體His標(biāo)簽蛋白(見圖3)。Western blot結(jié)果顯示,pCOLD-TF-chIRF7原核表達(dá)蛋白均能與抗His標(biāo)簽抗體反應(yīng),且在107 kDa處出現(xiàn)特異性條帶,而對照組上清和沉淀出現(xiàn)52 kDa標(biāo)簽蛋白條帶(見圖4)。pCOLD-TF-chIRF7原核表達(dá)蛋白主要在破碎菌體上清中表達(dá)。

    圖3 pCOLD-TF-chIRF7誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Expression of pCOLD-TF-chIRF7 induced by IPT G

    圖4 pCOLD-TF-chIRF7 重組蛋白Western blot鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of pCOLD-TF-chIRF7 recombinant protein by Western blot

    2.4 激光共聚焦證明抗chIRF7抗體可以識別真核細(xì)胞中chIRF7表達(dá)產(chǎn)物 利用真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞,進(jìn)行激光共聚焦實驗,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-rIgG的DF1細(xì)胞,用原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物制備的陽性鼠抗chIRF7血清(1:100)檢測DF1細(xì)胞無綠色熒光。而轉(zhuǎn)染pcDNA-chIRF7-rIgG的DF1細(xì)胞,F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(陽性對照)和原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物制備的鼠抗chIRF7血清(1:100)可以識別DF1細(xì)胞中的chIRF7,出現(xiàn)明顯的綠色熒光,用陰性鼠血清對照檢測,結(jié)果細(xì)胞無綠色熒光(見圖5)。結(jié)果表明用原核表達(dá)的chIRF7產(chǎn)物,可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗雞IRF7多克隆抗體。

    圖5 多克隆抗體與真核表達(dá)蛋白反應(yīng)的激光共聚焦鑒定Fig.5 Reaction analysis of polyclonal antibody and prokaryotic expressed protein by Confocal Laser

    2.5 Western blot鑒定 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-chIRF7-rIgG的DF1細(xì)胞裂解產(chǎn)物,用原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物制備的鼠血清進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-chIRF7-rIgG的細(xì)胞裂解產(chǎn)物在分子量約為79 kDa處呈現(xiàn)特異性條帶(見圖6),大小與預(yù)期相符合,鼠血清與真核表達(dá)的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),進(jìn)一步證明用原核表達(dá)的chIRF7產(chǎn)物,誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了抗雞IRF7多克隆抗體。

    圖6 真核表達(dá)蛋白與多克隆抗體反應(yīng)的Western blot鑒定Fig.6 Reaction analysis of polyclonal antibody and prokaryotic expressed protein by Western blot

    3 討論

    IRFs是一類結(jié)構(gòu)特征相對保守、對IFN基因表達(dá)起調(diào)控作用的多功能轉(zhuǎn)錄因子,能夠參與天然免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)控[11]。機(jī)體通過相關(guān)分子模式識別受體識別來自不同病原體的病原相關(guān)分子模式,將信號傳遞給下游接頭分子,引起一系列的級聯(lián)反應(yīng),激活信號通路中的IRFs,最終產(chǎn)生細(xì)胞因子、IFN、炎癥因子,誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答[5]。

    目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個IRFs成員,IRF7是IRFs家族的重要成員,在病毒感染后誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生過程中起著重要作用。有報道稱,用病毒感染敲除IRF7基因的小鼠,誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN的能力明顯減弱,由此可見,IRF7在病毒感染誘導(dǎo)IFN生成的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,是宿主抵御病毒感染和機(jī)體免疫防御反應(yīng)中的一個重要因子[12-14]。IRF7在腫瘤方面也有參與,能抑制腫瘤細(xì)胞生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。近年來對IRF7在IFN信號途徑中的作用研究取得了較大進(jìn)展,但有關(guān)雞IRF7對IFN產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制、胞內(nèi)病毒識別途徑、如何激活I(lǐng)RF7等方面的研究少有報道,存在瓶頸的關(guān)鍵問題就是因為實驗工具的缺乏。

    本研究利用分離雞淋巴細(xì)胞并獲得其cDNA,從中擴(kuò)增IRF7基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體pCOLD-TF-chIRF7,將原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物免疫小鼠制備雞IRF7多克隆抗體,通過不同方法分析鑒定,結(jié)果成功獲得抗雞IRF7多克隆抗體,為進(jìn)一步完善IRF7在干擾素通路的具體形態(tài)和了解IRF7的生物學(xué)功能提供了生物材料。

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