正交試驗優(yōu)化復方補骨脂酊提取工藝

簡曉莉，劉志承，李曙光，張尚斌，陳香鈴

(深圳市中醫(yī)院，深圳 518033)

白癜風是一種皮膚或黏膜色素減退或脫失的常見疾病，臨床主要表現(xiàn)為皮膚或黏膜一片或數(shù)片白斑，初起邊界不清，后逐漸增多、擴大，甚至蔓延至全身，病程較長，遷延難愈，很少有自行消退者。目前白癜風的發(fā)病原因尚不清楚，中醫(yī)認為白癜風屬“白駁風”范疇，又有“白癜”、“白處”、“白毋奏”等中醫(yī)病名[1]。一般認為內(nèi)因主要為七情內(nèi)傷、肝氣郁結(jié)、久病耗氣或氣滯血瘀、精虧血少、肝腎不足，內(nèi)外相因，終至氣血失和、血不養(yǎng)膚而發(fā)為本病[2]。本院在長期的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，復方補骨脂酊在治療白癜風疾病中具有很好的效果，臨床上常用于治療白癜風及各種白斑、斑禿、脫發(fā)。但應用過程中存在攜帶及使用不便、容易污染衣物等問題，限制了該藥在臨床上的廣泛應用。因此擬將復方補骨脂酊進行劑型改革，本研究通過正交試驗，優(yōu)選復方補骨脂酊的最佳提取工藝，為其劑型改革提供研究資料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(CTO-10AS vp 柱溫箱、LCsolution 工作站)，日本島津公司; Agilent TC- C18色譜柱(250 mm×4．6 mm，5 μm); AUW220D型電子天平 (十萬分之一)，日本島津公司；0.45 μm 微孔濾膜(PTFE)，Thermo；電熱恒溫干燥箱(GZX-DH.500-BS -Ⅱ)，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 試藥 補骨脂素、異補骨脂素對照品(批號分別為110739-201416和110738-201313，中國藥品生物制品檢定研究院);乙腈(色譜純，德國默克公司)；甲醇為分析純，乙醇為藥用級別，水為超純水; 補骨脂(批號180225)、白芷(批號171231)、紅花(批號180306)、丹參(批號171117)飲片經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室劉紀青主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中國藥典》(一部)有關(guān)規(guī)定，均由毫州市永剛飲片廠有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 補骨脂素和異補骨脂素含量的測定

2.1.1 色譜條件 Agilent TC- C18色譜柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水，梯度洗脫：0～35 min，甲醇為 22%→40%；流速: 1 ml/min，檢測波長246 nm，柱溫: 35 ℃，進樣體積10 μl。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取補骨脂素和異補骨脂素對照品適量，加甲醇配制成濃度為 0．212和0．213 mg/ml的對照品混合溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 補骨脂、白芷、紅花、丹參各15 g，加乙醇浸漬，濾過，加乙醇定容至500 ml，為復方補骨脂酊儲備液。精密量取儲備藥液1 ml，置5 ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，制成供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液的制備 按復方補骨脂酊的處方去除補骨脂后其余味藥，按復方補骨脂酊制備方法，制備缺補骨脂陰性對照品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。補骨脂素與異補骨脂素峰分離良好，陰性樣品無干擾。見圖1。

1.補骨脂素 2.異補骨脂素

2.1.4 線性關(guān)系考查 分別吸取補骨脂素和異補骨脂素混合對照品溶液(濃度為0．212和0．213 mg/ml)0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75和1.25 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成補骨脂素濃度分別為2.650、5.300、7.950、10.600、13.250、15.900和26.500 μg/ml,異補骨脂素濃度分別為2.663、5.325、7.988、10.650、13.313、15.975和26.625 μg/ml的對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定補骨脂素和異補骨脂素峰面積，以進樣量的自然對數(shù)為橫坐標(X)，以峰面積積分值自然對數(shù)為縱坐標(Y)，得補骨脂素回歸方程Y=84 390X+17 112(R2=0．999 6)，異補骨脂素回歸方程Y=82 172X+13 558(R2=0．999 8)，結(jié)果表明補骨脂素在2．650～26．500 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，異補骨脂素在2．663～26．625 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 取補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液連續(xù)進樣6次，每次10 μl，測定峰面積，RSD分別為1.04%和1.95%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別在第 0、2、4、8、12和24 h 進樣，測補骨脂素和異補骨脂素峰面積，RSD分別為1.58%和1.23%。

2.1.7 重復性試驗 取同一復方補骨脂酊儲備液6 份，分別按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定補骨脂素和異補骨脂素含量。結(jié)果儲備藥液中補骨脂素和異補骨脂素平均含量分別為3．775和3．209 mg/ml，RSD分別為1.82%和1.24%。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的儲備藥液(補骨脂素和異補骨脂素平均含量分別為3．775和3．209 mg/ml) ，共取 9 份，每份0.5 ml，分別加補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液 (濃度分別為1.892和1.624 mg/ml)0.5、1.0和1.5 ml各3份，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積，結(jié)果補骨脂素和異補骨脂素平均回收率分別為98.90%和97.42%，RSD分別為1.42%和1.65%，結(jié)果見表 1和表2。

表1 補骨脂素加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

表2 異補骨脂素加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2．1．9 含量測定 精密量取儲備藥液1 ml，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品，按“2．1．1”項下色譜條件進樣，測定藥液中補骨脂素和異補骨脂素的含量。

2.2 總固物 精密量取復方補骨脂酊儲備液25 ml，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，水浴蒸干，于 105 ℃ 干燥3 h，稱重，計算總固物量[3]。

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗及結(jié)果 以乙醇濃度、乙醇用量及浸漬時間為因素進行正交試驗，每個因素設(shè) 3 個水平，設(shè)置乙醇濃度為60%、70%和80%，乙醇用量為3、5和7倍，浸漬時間為7、10和14 d。選用 L9(34) 正交表。試驗安排及結(jié)果見表3-5。

表3 正式試驗因素水平

表4 正交試驗及結(jié)果

注：綜合評分值= 補骨脂素和異補骨脂素總含量 /補骨脂素和異補骨脂素總含量最大值 ×100×0．6+總固物/總固物最大值×100×0.4。

表5 方差分析

注:F0．05( 1，2) = 19，F(xiàn)0．01( 1，2) = 99。

極差(R值) B>A>C，直觀分析表明: 各因素對提取效果的影響為乙醇用量>乙醇濃度>浸漬時間，最佳參數(shù)為 B3A1C2；方差分析結(jié)果表明：A、B、C因素均為非顯著因素，從節(jié)省時間、提高效率角度出發(fā)，確定提取工藝為B3A1C1，即7倍量的60%乙醇浸漬7 d。

2.3.2 驗證試驗 取處方量藥材 6 份，按B3A1C1提取工藝，即7倍量的60%乙醇浸漬7 d，濾過，定容至 500 ml，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，測定補骨脂素和異補骨脂素含量，按“2.2”項下方法測得總固物，結(jié)果見表 5，補骨脂素和異補骨脂素平均含量分別為9.841和8.083 mg/ml，總固物平均為0.630 6 g。結(jié)果表明按B3A1C1提取工藝，補骨脂素和異補骨脂素含量和總固物接近最大值，說明工藝合理可行。

表6 驗證試驗結(jié)果

3 討論

復方補骨脂酊由補骨脂、丹參、白芷、紅花組成，采用乙醇浸漬法制備。該方以補骨脂為君藥，溫腎助陽，外用消斑祛風；臣藥以丹參活血化瘀；白芷、紅花均為佐藥，白芷活血生肌、紅花活血養(yǎng)血，具有溫通氣血、調(diào)和營衛(wèi)之功效，主要用于治療白癜風及各種白斑、斑禿、脫發(fā)。白癜風發(fā)病機制目前仍不清楚，中醫(yī)方法對白癜風患者進行治療具有一定的優(yōu)勢，并且在臨床上的經(jīng)驗也更加豐富[4]。研究發(fā)現(xiàn)單味中藥女貞子、丹參、白芷、菟絲子、補骨脂、紅花可促進黑素細胞黏附，刺蒺藜、女貞子、黃芪、白芷、補骨脂對黑素細胞遷移有誘導作用[5]。在外用中藥制劑中，單用或以補骨脂為主藥進行組方治療白癜風的報道較多[6-10]，故本研究選用補骨脂素和異補骨脂素含量作為主要指標，綜合評分權(quán)重定為60%。總固物中其他成分對本方功效共同發(fā)揮作用，故設(shè)定總固物權(quán)重為40%。

復方補骨脂酊原生產(chǎn)工藝為補骨脂150 g、丹參150 g、白芷150 g、紅花150 g ，采用乙醇浸漬法制備，浸漬7 d后過濾，加乙醇至1 000 ml，乙醇用量僅為藥材量的1.67倍，提取效果不佳，在設(shè)置因素水平時，參考文獻[11-13]，將乙醇用量設(shè)為3、5、7倍三個水平，試驗結(jié)果直觀分析表明：各因素對提取效果的影響為乙醇用量>乙醇濃度>浸漬時間，說明加大乙醇用量對提取效果具有較大影響。本研究通過對補骨脂素和異補骨脂素的含量指標及總固物指標進行綜合評價，采用 L9(34)正交試驗法優(yōu)化復方補骨脂酊提取工藝，對其提取工藝進行篩選，保證制劑質(zhì)量。最終優(yōu)選出最佳提取工藝為加7倍量的60%乙醇浸漬7 d，通過驗證試驗證明該工藝穩(wěn)定可行，為復方補骨脂酊劑型改革的研制和生產(chǎn)提供了參考。