正交試驗(yàn)法優(yōu)選超聲提取溪黃草中齊墩果酸的工藝研究

龔先玲，何銀妹，陳志紅，李燕秋

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，東莞 523808； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)分析中心，東莞 523808)

溪黃草為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜Rabdosialophanthoides(Buch-Ham ex D Don) Hara的干燥全草[1]，具有清熱利濕、涼血散瘀、退黃祛濕等功效，臨床上用于治療急性肝炎、膽囊炎和跌打瘀腫等癥[2，3]。其葉和莖中含有多種化合物，如溪黃草素A、溪黃草素B、溪黃草素D、熊果酸、尾葉香茶菜素A、2α-羥基熊果酸、β-谷甾醇苷、齊墩果酸、β-谷甾醇、線紋香茶菜、Gerardianin B和C等[1，2,4-6]。其中，齊墩果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，具有多種顯著的生物活性：如抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗菌、抗糖尿病、抗癌、抗肝脂肪變以及抗肝纖維化等作用[7-11]。齊墩果酸的提取常用超聲提取法和微波提取法[12，13]，超聲提取法具有提取時(shí)間短、節(jié)約溶劑、避免高溫對(duì)提取成分的破壞等優(yōu)點(diǎn)，此方法已被廣泛用于中藥有效成分的提取[14,15]，但用于提取溪黃草中的齊墩果酸仍未見(jiàn)報(bào)道。本文采用正交試驗(yàn)優(yōu)選超聲提取溪黃草中的齊墩果酸的工藝條件，為溪黃草的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為齊墩果酸的來(lái)源與合理化生產(chǎn)提供新的參考方向。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)惠普公司 HP -1200 高效液相色譜儀；瑞士梅特勒公司 AE-240 型電子分析天平；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 齊墩果酸對(duì)照品購(gòu)于寶雞辰光生物科技有限公司 (批號(hào)20160701,含量大于98%)；乙腈為一級(jí)色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純；溪黃草購(gòu)于東莞國(guó)藥集團(tuán)，產(chǎn)地廣東清遠(yuǎn)，由廣東醫(yī)科大學(xué)茍占平博士鑒定為線紋香茶菜Rabdosialophanthoides(Buch-Ham ex D Don) Hara。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考查

2.1.1 色譜條件 ODS C18分析色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm )，流動(dòng)相乙腈-水-磷酸(400∶100∶0.84)，流速1.0 ml/min，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃,進(jìn)樣量20 μl。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5.34 mg，加乙醇溶解后定容至100 ml，制成0.053 4 g/L的齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取溪黃草4.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加無(wú)水乙醇40 ml，超聲提取60 min(每20 min暫停一次)，放冷，濾過(guò)，移入100 ml量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液，備用。

2.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀， 按 “2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品圖譜中，齊墩果酸與其他成分峰能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于3 000。結(jié)果見(jiàn)圖 1。

1.齊墩果酸

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取體積分別為4、8、12、16和20 μl的齊墩果酸對(duì)照品溶液，依次注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以齊墩果酸的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)作圖，得回歸方程Y=1 226 300.974X-41 012.876(r=0.999 0)，表明齊墩果酸的線性范圍為0.213 6～1.068 μg，且線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.053 4 g/L 的對(duì)照品溶液20 μl，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，經(jīng)計(jì)算得齊墩果酸的RSD為1.49%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批溪黃草樣品6份，每份4.0 g，按“2.1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各進(jìn)樣20 μl，測(cè)定其峰面積，結(jié)果RSD為1.68%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于0、2、4、6和12 h，各進(jìn)樣20 μl，測(cè)定其峰面積，結(jié)果RSD為1.33%，說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的溪黃草樣品4.0 g，共6份，每份加入“2.1.2.1”項(xiàng)下的0.053 4 g/L齊墩果酸對(duì)照品溶液10 ml，按“2.1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果齊墩果酸的平均回收率為97.16%，RSD為1.40%。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以溪黃草中齊墩果酸的含量為指標(biāo)，考查乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、溶劑倍數(shù)(C)、提取次數(shù)(D)4種因素對(duì)提取結(jié)果的影響，按L9(34) 進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體水平和因素見(jiàn)表2。

表2 溪黃草中齊墩果酸超聲提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.2 試驗(yàn)安排與結(jié)果 按照L9(34)正交試驗(yàn)安排表進(jìn)行試驗(yàn)，精密稱取溪黃草4.0 g，共9份，加相應(yīng)體積的提取溶劑，超聲提取，過(guò)濾，合并濾液，測(cè)定體積，得到1～9號(hào)待測(cè)溶液。將各待測(cè)液按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，并計(jì)算齊墩果酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 溪黃草中齊墩果酸的

2.2.3 最佳提取工藝的確定 由表3的試驗(yàn)結(jié)果可知，A3>A2>A1，B3>B2>B1,C2>C3>C1，D3>D2>D1，A3B3C2D3所得齊墩果酸提取率最高，由此得最佳提取條件為A3B3C2D3，即用無(wú)水乙醇提取，料液比為1∶10，提取3次，每次60 min。根據(jù)直觀分析結(jié)果，各因素對(duì)超聲提取溪黃草中的齊墩果酸都有不同程度的影響，其中提取率均隨著乙醇濃度、提取時(shí)間和提取次數(shù)的增加而升高，但料液比的梯度變化并沒(méi)有使齊墩果酸的提取率呈現(xiàn)正相關(guān)或負(fù)相關(guān)變化，即料液比對(duì)齊墩果酸的提取影響不大。

方差分析用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。由于在設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)時(shí)，沒(méi)有設(shè)置誤差項(xiàng)，因此，應(yīng)把A、B、C、D中均方值最小的A項(xiàng)作為誤差項(xiàng)來(lái)考查[16]，計(jì)算方差齊分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由方差分析結(jié)果可知，四種因素對(duì)齊墩果酸提取率的影響程度依次為D>C>B>A，其中D因素顯著影響齊墩果酸的提取率。由于B1與B3兩水平對(duì)工藝影響的差異不顯著，為了適應(yīng)大批量生產(chǎn)，結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，生產(chǎn)工藝最終優(yōu)化為：A3B1C2D3，即用10倍量的無(wú)水乙醇，每次超聲20 min，共提取3次。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取3批不同批次的溪黃草各一份，每份4.0 g，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，即加40 ml的無(wú)水乙醇，每次20 min，超聲提取，過(guò)濾，重復(fù)上述操作2次，合并濾液。HPLC法在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定含量，結(jié)果得每克溪黃草中齊墩果酸的平均含量為520.06 μg，的RSD為1.41%，重現(xiàn)性良好。

表4 方差分析結(jié)果

3 討論

正交試驗(yàn)法是一種多因素、多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，當(dāng)設(shè)計(jì)要求的試驗(yàn)次數(shù)太多時(shí)，正交試驗(yàn)不僅減少了工作量，減少了時(shí)間，還節(jié)省試驗(yàn)耗材，降低試驗(yàn)成本。本試驗(yàn)為四個(gè)三水平因子的試驗(yàn)，若進(jìn)行全面試驗(yàn)則需要做34=81次試驗(yàn)，而用L9(34)只需9次。而且試驗(yàn)時(shí)間越長(zhǎng)干擾越多，因此與全面試驗(yàn)相比，正交試驗(yàn)縮短了試驗(yàn)周期，提高了試驗(yàn)的精確度，因此本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法，高效、經(jīng)濟(jì)、精確。

本試驗(yàn)通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)溪黃草中齊墩果酸的含量進(jìn)行定量分析，HPLC流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸(400∶100∶0.84)，齊墩果酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，標(biāo)準(zhǔn)品的線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 0，方法學(xué)驗(yàn)證中，儀器的精密度、方法的重復(fù)性與試樣的穩(wěn)定性均良好，加樣回收率在95.79%～99.24%，該方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、高效、重現(xiàn)性好，對(duì)檢測(cè)溪黃草中的齊墩果酸含量是較為適宜的方法。

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，提取次數(shù)對(duì)溪黃草中齊墩果酸的提取率影響最大，其次是料液比和提取時(shí)間，乙醇濃度對(duì)提取率的影響最小。因此結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，從降低耗能、節(jié)省時(shí)間等方面考慮，最終確定提取齊墩果酸的最佳方法是：用無(wú)水乙醇提取，提取時(shí)間為每次20 min，料液比1∶10，提取3次，即最優(yōu)的生產(chǎn)工藝是A3B1C2D3。按照最佳的生產(chǎn)工藝條件，進(jìn)行優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn), 此工藝條件得到較高的提取率，具有節(jié)省成本、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。