苦參堿通過P38通路調節(jié)H2AX磷酸化抑制宮頸癌細胞的增殖及遷移

趙淑婷， 雷 蕾， 程靜新

(同濟大學附屬東方醫(yī)院婦產科，上海 200120)

宮頸癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年增高[1]。即使在早期宮頸癌根治性切除術后，仍大約有20%～30%的患者復發(fā)[2-3]。化療廣泛用于治療復發(fā)或轉移性疾病[4]。

苦參堿是一種從豆科槐屬植物中提取的生物堿，具有利尿、抗病原體、抗肝炎病毒等作用，且無明顯的毒性作用[5-7]。既往研究[8-10]表明，苦參堿可能是通過抑制癌細胞增殖、誘導細胞凋亡和細胞自噬而對胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和胰腺癌等發(fā)揮抗腫瘤作用。其抗腫瘤作用極其復雜，涉及對細胞增殖、凋亡及周期的影響。本研究旨在探討苦參堿對宮頸癌細胞生長和轉移的抑制作用與H2AX是否相關。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

苦參堿(分析純)購自上海源葉公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)購自美國Corning公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒購自日本同仁公司；Cell-Light EdU Apollo?567 In Vitro Imaging Kit購自廣州銳博公司；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Annexin V-FITC試劑盒、Transwell小室購自美國BD公司；鼠單克隆抗體β-actin購自美國Proteintech公司；兔單克隆抗體H2AX、P38、抗鼠IgG及抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司。

1.2 細胞系

人宮頸癌SiHa、C33A細胞購自中國科學院上海細胞庫。SiHa細胞用含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；C33A細胞用含有10%血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。以上細胞置于37℃，5% CO2飽和濕度下貼壁培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況1～2d換液一次。

1.3 方法

1.3.1 CCK8試驗 將對數(shù)生長期細胞按2×103/孔接種于96孔板，貼壁后更換不同濃度苦參堿(0～2mg/mL)培養(yǎng)基，于24、48、72h后按照CCK8說明書配制CCK8溶液，在培養(yǎng)箱中溫育2h，用酶標儀測定450nm處吸光度值(A450)。

1.3.2 EdU法 將2×103個宮頸癌細胞接種于96孔板，貼壁后更換培養(yǎng)基，24h后按EdU試劑盒說明配置溶液，試劑A液孵育2h，4%多聚甲醛固定，甘氨酸脫色，滲透劑孵育。Apollo?反應溶液避光、室溫、孵育后Hoechst33342反應液避光室溫孵育，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 流式細胞術 將細胞種于6孔板培養(yǎng)12h后，更換正常及含0.5mg/mL苦參堿的培養(yǎng)基，作用24h后的細胞，用預冷PBS充分洗滌細胞3次，按照Annexin V-FITC試劑盒說明書配置溶液，細胞用195μL 結合緩沖液和5μL Annexin V-FITC室溫避光孵育10min，然后加入10μL碘化丙啶室溫避光孵育10min，上機檢測細胞凋亡率。

1.3.4 細胞凋亡與壞死檢測 將5×103個宮頸癌細胞接種于6孔板，貼壁后更換不同濃度苦參堿培養(yǎng)基，作用24h后，先加入Hoechst33342染液4℃避光孵育30min，再加入碘化丙啶染液4℃避光孵育30min進行雙標記染色，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 細胞遷移試驗 在Transwell小室中加入200μL(1×106個/mL)不同處理后的無血清細胞懸液，底部加入600μL含10%血清的培養(yǎng)液。置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24h，將小室置于4%多聚甲醛溶液中固定后結晶紫染色，PBS輕輕沖洗小室，用棉棒將室頂細胞輕輕擦去，晾干后于倒置顯微鏡觀察，隨機取3個視野進行拍照，統(tǒng)計細胞遷移率。

1.3.6 劃痕實驗 將細胞以每孔1×106密度接種于6孔板中，待細胞貼壁長滿后時用10μL槍頭垂直劃一條直線，PBS沖洗去除劃下細胞，更換含(0、0.5mg/mL)苦參堿的無血清的培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用倒置顯微鏡下分別在0、24h拍照。

1.3.7 Western印跡法檢測 干預后的細胞經預冷PBS漂洗后，用RIPA裂解液處理后輕輕刮下細胞，冰上反應30min后超聲并離心獲得各組細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，與5×SDS蛋白上樣緩沖溶液混合，100℃下變性8min。每孔上樣30μg蛋白，SDS-PAGE分離并轉膜后用5%脫脂牛奶封閉1h后加入相應一抗(1∶1000)4℃孵育過夜，隨后加入二抗(1∶10000)，室溫孵育1h，進行ECL反應。利用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 苦參堿對SiHa/C33A細胞增殖的影響

CCK8法檢測0、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL苦參堿誘導24、48、72h后對宮頸癌細胞SiHa、C33A細胞增殖的影響。相同作用時間下，抑制作用隨苦參堿濃度的升高而增強，相同濃度下，抑制作用隨苦參堿作用時間的延長而增強，在苦參堿濃度高于0.5mg/mL時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EdU實驗結果顯示，1mg/mL苦參堿作用后細胞的增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 苦參堿對SiHa/C33A細胞凋亡的影響

通過細胞凋亡與壞死檢測Hochest33342和碘化丙啶雙染實驗，評估苦參堿對宮頸癌細胞凋亡形態(tài)的影響，結果顯示，苦參堿作用后的細胞密度明顯降低，出現(xiàn)亮藍色，核染色質固縮染色體碎裂、固縮的細胞被染成亮藍色或淡紅色。通過流式細胞術，檢測結果顯示，苦參堿誘導細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 苦參堿對SiHa/C33A細胞遷移的影響

通過Transwell實驗與劃痕實驗檢測苦參堿對宮頸癌遷移能力的影響。Transwell實驗結果顯示： 較正常對照組，苦參堿作用后的宮頸癌細胞的穿膜數(shù)量均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。劃痕實驗結果顯示： 處理24h時，正常對照組細胞劃痕寬度大于苦參堿作用后的宮頸癌細胞，即遷移能力受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 苦參堿對SiHa/C33A細胞H2AX、P38表達的影響

通過Western印跡法檢測苦參堿對γH2AX、pP38蛋白水平的影響，結果顯示苦參堿隨著藥物濃度增高，γH2AX、pP38的表達顯著增高，即H2AX、P38磷酸化水平隨著苦參堿濃度增高而增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖1 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A增殖的影響Fig.1 The effect of matrine on SiHa and C33A cell proliferationA： CCK8實驗檢測不同時間點、不同苦參堿對宮頸癌細胞增殖的影響；B： EdU法檢測苦參堿對宮頸癌細胞增殖的影響；與對照組相比，*P<0.05

圖2 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A凋亡的影響Fig.2 The effect of matrine on SiHa and C33A cell apoptosisA： 細胞凋亡實驗對宮頸癌細胞凋亡的檢測；B： 流式細胞術對宮頸癌細胞凋亡的檢測；與對照組相比，*P<0.05

圖3 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A侵襲和遷移的影響Fig.3 The effect of matrine on invasion and migration of SiHa and C33A cellsA： 宮頸癌細胞侵襲能力；B： 宮頸癌細胞遷移能力；與對照組相比，*P<0.05

圖4 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A中H2AX基因表達的影響Fig.4 The effect of matrine on the expression of H2AX in cervical cancer cells與0mg/mL苦參堿組相比，*P<0.05

2.5 H2AX磷酸化對苦參堿作用的宮頸癌細胞增殖、遷移的影響

在宮頸癌細胞SiHa中穩(wěn)轉H2AX-wt和H2AX-139m(含有Ser139突變以阻斷磷酸化)后加入苦參堿，檢測H2AX的磷酸化不同對宮頸癌細胞增殖、遷移的影響。結果顯示，與H2AX-wt組相比，苦參堿對H2AX-139m組宮頸癌細胞的增殖抑制程度減低，遷移率明顯增強，即H2AX磷酸化的阻斷可降低苦參堿對宮頸癌細胞的抑增殖、抑遷移的作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 H2AX磷酸化對苦參堿作用的宮頸癌細胞增殖、遷移的影響Fig.5 The effect of H2AX phosphorylation on proliferation and migration in cervical cancer cellsA： CCK8法檢測苦參堿在H2AX不同磷酸化下對宮頸癌細胞48h增殖的抑制率的影響；B： Transwell實驗檢測苦參堿在H2AX不同磷酸化下對宮頸癌細胞遷移的影響；與H2AX-wt組相比，*P<0.05

2.6 苦參堿通過P38信號通路對宮頸癌細胞H2AX磷酸化的影響

在宮頸癌細胞SiHa中加入P38磷酸激酶抑制劑SB202190，通過Western印跡法檢測P38磷酸化被抑制后對γH2AX、pP38表達的影響。結果顯示，加入抑制劑后，P38信號磷酸化通路被抑制，同時H2AX磷酸化水平也隨之降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 苦參堿通過P38信號通路對宮頸癌細胞H2AX磷酸化的影響Fig.6 The effect of Matrine on the phosphorylation of H2AX in cervical cancer cells through P38 signaling pathway與苦參堿組相比，*P<0.05

3 討 論

苦參堿對多種腫瘤有抑制作用，且毒副作用較小，是一種應用于臨床的高效、低毒的新型抗腫瘤藥。既往研究[8,11]表明，苦參堿在病毒性肝炎、心律失常、皮膚炎癥等的治療中廣泛應用，且與標準療法聯(lián)合應用能顯著改善癌癥患者的生活質量和預后，顯示其作為抗癌藥物的潛力。然而，其對腫瘤抑制作用的具體機制目前還不明確，尤其是在宮頸癌中。在本實驗中，探究不同濃度苦參堿對人宮頸癌細胞系SiHa和C33A細胞功能的影響，及與P38/H2AX基因表達的相關性，以期揭示苦參堿對宮頸癌抑癌作用的機制。

腫瘤細胞的增殖能力與腫瘤的惡性程度密切相關。本研究驗證了苦參堿對宮頸癌細胞增殖的抑制，苦參堿對宮頸癌SiHa和C33A細胞的增殖顯著抑制，且呈劑量依賴。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與細胞的增殖分化有關，還與細胞的凋亡障礙有密切關系，細胞凋亡是維持機體自身穩(wěn)態(tài)所必須的生理性細胞自殺過程，苦參堿在肝細胞癌中可通過凋亡誘導因子的核轉位而產生的細胞凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中，苦參堿可促進細胞凋亡。遷移和侵襲是評價宮頸癌預后的重要指標并提示治療后效果，遷移能力強的細胞更具有復發(fā)和轉移的潛能[12]。本實驗通過Transwell實驗和劃痕實驗檢測苦參堿對宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)苦參堿在宮頸癌中顯著抑制細胞的遷移能力。這一結果與前列腺癌的低遷移率一致[5]，進一步驗證了苦參堿對宮頸癌細胞遷移的抑制作用[13]；通過CCK8、EdU等實驗技術，針對細胞的增殖、凋亡、轉移等多角度綜合證明苦參堿對宮頸癌的抑增殖、促凋亡、抑轉移等抗腫瘤作用

關于苦參堿對腫瘤抑制作用的機制研究[14-15]認為，抑制作用可能與miR-21/PTEN/Akt通路、AKT/GSK3β/β-Catenin等通路相關。本研究通過苦參堿作用于宮頸癌細胞，證明苦參堿隨濃度增加可梯度增加γH2AX、pP38的表達，提示苦參堿的抑癌作用可能與H2AX相關。H2AX屬于編碼組蛋白H2A家族，參與細胞的增殖和DNA的修復[16]。DNA損傷可導致增殖失控和驅動惡性腫瘤的形成H2AX在Ser139位點發(fā)生磷酸化進而調控細胞增殖、細胞凋亡、DNA的修復中起重要作用。在真核細胞中，生物、物理及化學因素等可使DNA損傷而形成γH2AX。在越來越多的證據(jù)[17]表明，γH2AX參與多種人類惡性腫瘤的凋亡過程中。H2AX磷酸化可由ATM、ATR和DNA-PKcs催化[18]。研究[19-20]報道，H2AX的磷酸化可通過P38絲裂原活化蛋白激酶途徑調控細胞的凋亡。在本研究中發(fā)現(xiàn)，苦參堿抑制宮頸癌增殖、遷移時，γH2AX、pP38的表達增加，提示苦參堿可能是通過誘導H2AX磷酸化進而發(fā)揮作用。為證明H2AX是通過磷酸化激活發(fā)揮作用，通過抑制H2AX的磷酸化發(fā)現(xiàn)苦參堿對增殖、遷移的抑制作用解除。為探究γH2AX的作用通路，通過阻斷H2AX上游基因P38的磷酸化，結果證實P38磷酸化的阻斷可抑制γH2AX的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠有效抑制宮頸癌SiHa/C33A細胞的增殖、遷移，誘導細胞凋亡，并證實苦參堿通過P38信號通路使H2AX(Ser139)位點磷酸化發(fā)揮抑增殖、抑遷移作用。本研究下一步將繼續(xù)闡述苦參堿有無其他通路調控H2AX的表達，為宮頸癌輔助治療的臨床前和臨床評價奠定基礎。