高遷移率族蛋白A2和基質(zhì)金屬蛋白酶-11在乳腺癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

李 楊， 吳珺藝， 王 曄， 秦 鈞， 戴雪明， 徐軍明

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科，上海 200080)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別居女性惡性腫瘤的第1位和第2位[1]。根據(jù)2015中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)每年新發(fā)乳腺癌病例27.2萬(wàn)，每年約7.0萬(wàn)人死于乳腺癌，主要致死原因?yàn)檗D(zhuǎn)移[2]。高遷移率族蛋白A2(high mobility group AT-hook 2, HMGA2)表達(dá)于多種人類惡性腫瘤，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移、患者生存時(shí)間縮短和靶向藥物治療耐藥性等過(guò)程關(guān)系密切[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-11(matrix metalloproteinase-1, MMP-11)可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，參與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，MMP-11在改進(jìn)腫瘤治療和監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移等方面受到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。本研究檢測(cè)173例乳腺癌患者術(shù)后組織樣本中HMGA2和MMP-11的表達(dá)，分析兩者與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系和兩者之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年1月—2008年12月在上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科行手術(shù)切除的173例乳腺癌患者臨床資料，其中排除術(shù)前接受新輔助化療和放療者、術(shù)中無(wú)法行腋窩淋巴結(jié)清掃者及雙側(cè)乳腺癌患者，治療結(jié)束后對(duì)患者行定期隨訪(1年內(nèi)每3個(gè)月、2～5年內(nèi)每6個(gè)月、>5年每年進(jìn)行隨訪)，隨訪方式包括門(mén)診復(fù)查、電話隨訪、登門(mén)隨訪和詢問(wèn)親屬等，隨訪截止至2017年12月31日，平均隨訪(78.9±7.75)個(gè)月，中位隨訪時(shí)間71個(gè)月。本研究獲得上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用SP法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。兔抗人HMGA2和MMP-11多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。具體過(guò)程如下： 將癌組織和癌旁正常組織石蠟連續(xù)切片，脫蠟、水化，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后在3%過(guò)氧化氫溶液孵育5～10min。應(yīng)用抗原修復(fù)液修復(fù)后加入山羊血清工作液封閉，每個(gè)樣本滴加50μL一抗工作液4℃過(guò)夜，PBS漂洗后加入二抗工作液37℃孵育30min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染。使用乙醇梯度脫水法干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察HMGA2和MMP-11染色情況。

1.3 結(jié)果判定

HMGA2蛋白陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核，而MMP-11蛋白陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，根據(jù)切片中染色陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量計(jì)分。染色強(qiáng)度： 無(wú)顯色為0分，淡黃色、棕黃色和棕褐色分別計(jì)1、2、3分。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分： <5%計(jì)0分，6%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。根據(jù)兩項(xiàng)得分乘積將結(jié)果分為： <1分為陰性，2～5分為弱陽(yáng)性，6～9分為陽(yáng)性，10～12分為強(qiáng)陽(yáng)性，陰性和弱陽(yáng)性均判為陰性，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性均判為陽(yáng)性。HER-2表達(dá)判定方法： 免疫組化3+為HER-2陽(yáng)性，0和1+為HER-2陰性，2+為HER-2不確定狀態(tài)，需進(jìn)一步行FISH方法檢測(cè)HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HMGA2和MMP-11在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

在乳腺癌組織中，HMGA2陽(yáng)性表達(dá)率為74.6%(129/173)，MMP-11陽(yáng)性表達(dá)率為59.0%(102/173)；在癌旁組織中，兩者的陽(yáng)性表達(dá)率分別為16.2%、9.8%，乳腺癌組織中HMGA2和MMP-11的表達(dá)顯著高于癌旁組織(HMGA2：2=75.890，P<0.001；MMP-11：2=17.621，P<0.001)。

2.2 HMGA2和MMP-11表達(dá)相關(guān)性分析

在173例乳腺癌標(biāo)本中，HMGA2和MMP-11蛋白同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)28例，同時(shí)陰性表達(dá)9例。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，HMGA2和MMP-11陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.772，P<0.01)。

2.3 HMGA2與MMP-11的表達(dá)與乳腺癌主要臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

HMGA2陽(yáng)性表達(dá)與年齡>40歲、絕經(jīng)期后、組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)相關(guān)(P<0.05)。HMAG2在伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(estrogen receptor, ER)表達(dá)陰性、HER-2表達(dá)陽(yáng)性和TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)中陽(yáng)性表達(dá)率分別為88.4%、82.9%、84.5%、53.5%，明顯高于腋窩無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)陽(yáng)性、HER-2陰性和TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期)組(34.1%、67.0%、59.1%、31.8%)。HMGA2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、孕激素受體(progesterone receptor, PR)表達(dá)和Ki-67表達(dá)無(wú)關(guān)(P>0.05)。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組中MMP-11陽(yáng)性表達(dá)率為67.5%，明顯高于腋窩淋巴結(jié)陰性組(P=0.001)。在ER表達(dá)陰性組、HER-2表達(dá)陽(yáng)性組和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組中，MMP-11陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.0%、64.1%、70.3%，明顯高于ER表達(dá)陽(yáng)性組(31.0%，P<0.001)、HER-2陰性組(44.4%，P=0.021)和TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組(46.3%，P=0.001)。MMP-11表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、月經(jīng)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)、PR表達(dá)和Ki-67表達(dá)均無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HMGA2和MMP-11表達(dá)與乳腺癌臨床病理資料之間的關(guān)系Tab. 1 Relationship between the expression of HMGA2 and MMP-11 and cilincopathological characteristics of breast cancer

(續(xù)表1)

2.4 HMGA2和MMP-11與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

乳腺癌患者中HMGA2和MMP-11同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性者，其無(wú)病生存時(shí)間(disease free survival, DFS)短于HMGA2和/或MMP-11表達(dá)陰性者(P<0.001)，見(jiàn)圖1。乳腺癌患者中HMGA2和MMP-11同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性者，其總生存時(shí)間(overall survival, OS)短于HMGA2和/或MMP-11表達(dá)陰性者(P=0.001)，見(jiàn)圖2。

圖1 HMGA2、MMP-11表達(dá)與乳腺癌患者DFS的關(guān)系Fig.1 Relationship between the expression of HMGA2, MMP-11 and DFS in breast cancer patientsA組： HMGA2(+) MMP-11 (+);B組： HMGA2 (+) MMP-11 (-);C組： HMGA2 (-) MMP (+);D組： HMGA2 (-) MMP-11 (-)

圖2 HMGA2、MMP-11表達(dá)與乳腺癌患者OS的關(guān)系Fig.2 Relationship between the expression of HMGA2, MMP-11 and OS in breast cancer patientsA組： HMGA2 (+) MMP-11 (+);B組： HMGA2 (+) MMP-11 (-);C組： HMGA2 (-) MMP (+);D組： HMGA2 (-) MMP-11 (-)

采用Cox回歸分析對(duì)乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征及HMGA2、MMP-11表達(dá)情況與乳腺癌患者DFS和OS的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HMGA2和MMP-11表達(dá)情況是決定患者DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，見(jiàn)表2。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2表達(dá)、TNM分期和HMGA2表達(dá)是決定患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素，而MMP-11的表達(dá)情況不是決定患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.157)，見(jiàn)表3。

表2 乳腺癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)與DFS相關(guān)性的單因素和多因素預(yù)后分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of variables correlated with DFS in breast cancer patients

表3 乳腺癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)與OS相關(guān)性的單因素和多因素預(yù)后分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of variables correlated with OS in breast cancer patients

3 討 論

HMGA2是高遷移率蛋白家族的一員，包括3個(gè)AT-鉤狀結(jié)構(gòu)域，可與DNA小溝內(nèi)的AT豐富區(qū)域結(jié)合，引起DNA結(jié)構(gòu)彎曲、拉伸、成環(huán)或解鏈，從而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)；研究[3]表明，HMGA2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤新生血管生成、侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HMGA2在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可作為多種惡性腫瘤預(yù)后指標(biāo)之一，在肺癌、卵巢癌、口腔鱗狀上皮癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中，HMGA2表達(dá)上調(diào)常與腫瘤的高級(jí)別組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，并與腫瘤早期復(fù)發(fā)和較低的總體生存率相關(guān)[5-6]。此外，HMGA2表達(dá)與結(jié)腸癌Duks分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。Motoyama等[8]研究表明，在胃癌中，HMGA2表達(dá)與胃癌漿膜侵犯具有相關(guān)性。

MMP-11的表達(dá)與退變、胚胎形成、傷口愈合等正常生理狀況下的的組織重構(gòu)密切相關(guān)。已證實(shí)MMP-11過(guò)表達(dá)于多種人類腫瘤中，包括口腔癌、纖維瘤、非小細(xì)胞肺癌、食管腺癌等，此外，MMP-11基因表達(dá)增加與腫瘤惡性程度密切相關(guān)，并預(yù)示患者預(yù)后較差[9]。MMP-11高水平表達(dá)與乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌患者臨床預(yù)后差相關(guān)[10]。Deng等[11]研究證實(shí)敲除胃癌細(xì)胞BGC823 MMP-11表達(dá)可抑制軟瓊脂試驗(yàn)中的細(xì)胞增殖和克隆形成能力，裸鼠的皮下腫瘤形成能力也有所減弱。Hsin等[12]分析了279例口腔鱗癌MMP-11表達(dá)，證實(shí)了MMP-11陽(yáng)性表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。研究[13]發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞表達(dá)MMP-11聯(lián)合炎性蛋白前體可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃逸且具有侵襲性，從而促進(jìn)其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Kwon等[14]發(fā)現(xiàn)在ER陰性乳腺癌細(xì)胞中，Gli1過(guò)表達(dá)可上調(diào)MMP-11進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明，在發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組中，HMGA2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組；TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌組織HMGA2陽(yáng)性表達(dá)率低于Ⅲ～Ⅳ期HMGA2陽(yáng)性表達(dá)率；HER-2陰性組HMGA2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于HER-2陽(yáng)性組。MMP-11陽(yáng)性表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、ER陰性表達(dá)、HER2陽(yáng)性表達(dá)顯著相關(guān)，提示HMGA2和MMP-11蛋白表達(dá)可能對(duì)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移起到重要作用，與乳腺癌預(yù)后密切相關(guān)，與前述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

HMGA2表達(dá)與MMP-11表達(dá)水平呈正相關(guān)，并且HMGA2和MMP-11表達(dá)陽(yáng)性患者DFS和OS均短于HMGA2和/或MMP-11表達(dá)陰性者，表明HMGA2與MMP-11之間可能存在著內(nèi)在的聯(lián)系。在小鼠乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β誘導(dǎo)Smad表達(dá)增強(qiáng)，繼而引起HMGA2表達(dá)上調(diào)；HMGA2與Smad結(jié)合促進(jìn)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)的一系列基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)(如Snail、Slug、Twist等)，同時(shí)抑制E-cadherin表達(dá)，表明HMGA2是乳腺癌EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究[15]表明，由TGF-β誘導(dǎo)的Ras轉(zhuǎn)化小鼠乳腺上皮細(xì)胞中，MMP-2、MMP-11和MMP-13轉(zhuǎn)錄活性提高。小鼠乳腺上皮細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中下調(diào)single-minded 2可激活EMT并促進(jìn)MMP-11的表達(dá)，而MCF-7細(xì)胞中Snail表達(dá)上調(diào)可引起MMP-11獨(dú)立引起的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；由此，本研究猜測(cè)HMGA2表達(dá)上調(diào)引起多個(gè)EMT轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT改變，同時(shí)通過(guò)某種機(jī)制促進(jìn)MMP-11過(guò)表達(dá)，這一系列綜合作用促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，HMGA2和MMP-11可能參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，其表達(dá)陽(yáng)性提示患者預(yù)后較差，HMGA2和MMP-11表達(dá)情況對(duì)判斷乳腺癌患者的預(yù)后具有一定的參考價(jià)值，HMGA2與MMP-11之間內(nèi)在的具體的分子調(diào)控機(jī)制仍需不斷探索。