miR-30b在肺癌細胞HCC-827侵襲中的作用及相關通路研究

徐峰 張波 張健 齊澤鋮 徐建峰 朱成楚

肺癌是世界范圍內第一大癌癥疾病，其中約80%為非小細胞肺癌（NSCLC）[1]。近些年，肺癌無論在發(fā)生率還是病死率均逐年增長，與吸煙、空氣環(huán)境惡化有密切關系。盡管肺癌的檢測手段和手術方式不斷改進，但患者的5年生存率依舊低下，僅為15%[2]，在一些發(fā)展中國家，5年生存率更低。表皮生長因子受體（EGFR）廣泛分布于細胞表面，對細胞的生長、增殖、分化起到關鍵作用，同時與腫瘤的生長、侵襲和轉移有關。microRNA是一群由20～24個核苷酸構成的不具有編碼功能的微小RNA,它們在腫瘤細胞增殖、分化與凋亡的過程中起著

重要作用[3-5]，miR-30b在多種腫瘤中表達異常，但其在NSCLC進程中的機制尚不清楚。本研究分析miR-30b在肺癌細胞HCC-827侵襲中的作用及對相關通路的影響，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌細胞HCC-827購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基購自賽默飛公司。胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗購自上海生工公司。二甲基亞砜（DMSO）；lipofectamine 2000脂質體購自美國invitrogen公司。無核酸酶水（DEPC處理水）購自北京索萊寶生物科技有限公司。TRIzol裂解液購自美國SIGMA公司。山羊抗兔抗體購自上海碧云天生物技術研究所。上樣緩沖液（loading buffer）購自上海捷瑞生物工程有限公司。microRNA檢測試劑盒購自上海吉瑪制藥有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 HCC-827肺癌細胞的培養(yǎng) 用DMEM低糖培養(yǎng)基（含 10%FBS、1%雙抗）在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HCC-827肺癌細胞，置培養(yǎng)瓶于恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞瓶底部HCC-827肺癌細胞達到90%融合度時，用細胞緩沖液PBS沖洗后加入胰蛋白酶1ml，覆蓋培養(yǎng)瓶底部的細胞消化約3min，當顯微鏡下細胞變?yōu)楣铝⑶蛐螘r，終止胰蛋白酶對細胞消化，取含細胞混合液于離心管，800r/min離心6min。棄廢液，加入新培養(yǎng)基吹打保留的細胞沉積，充分混勻，最后將含有細胞的重懸液分配于新的培養(yǎng)瓶中傳代。

1.2.2 HCC-827肺癌細胞的瞬時轉染 將HCC-827細胞種植于6孔細胞培養(yǎng)板上。接種第2天，待細胞融合度達到80%時，使用lipofectamine 2000脂質體與opti-MEM培養(yǎng)基，參考說明書，選擇細胞生長狀態(tài)相近的細胞分成未轉染組（不進行轉染處理）、空載體組（轉染空載體）、miR-30b轉染組（轉染miR-30b質粒），每組3個副孔，其余處理相同，放于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5h后將原有轉染培養(yǎng)液更換成含血清的新鮮培養(yǎng)基。48h后將6孔板置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 總RNA的提取及逆轉錄 首先除去6孔板中原有培養(yǎng)基，分別加入1ml Trizol試劑，充分裂解細胞后，將混合液至1.5ml EP管中，加入0.2ml氯仿，持續(xù)震蕩，充分混勻后，室溫靜置2～3min。低溫13 000r/min，離心12min。完畢后，取上清液0.5ml至新的EP管中。加入500μl異丙醇，輕輕搖晃，放置8min。低溫13 000r/min，離心12min，棄上清液。加入1ml 75%乙醇與25%DEPC處理水的混合液，混勻，在4℃，7500r/min，5min離心后，棄乙醇，干燥10min后加DEPC水重懸，重懸液進行RNA純度的測定。microRNA逆轉錄試劑盒（Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit），進行cDNA的合成。

1.2.4 逆轉錄PCR（RT-PCR）檢測miR-30b的表達按照microRNA含量測定試劑盒的手冊配制15μl的PCR反應體系，在PCR儀器上進行反應，選擇U6作為內參。PCR 過程：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，共 40個循環(huán)。選用2-ΔΔCt法歸納分析所得到的數據。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 將Transwell小室置于細胞培養(yǎng)板內，加入基質膠。室溫下靜置20min，使基質膠于小室底部鋪開，培養(yǎng)箱內恒溫孵育3h。孵育完后，各小室內加200μl無血清培養(yǎng)基，水化20min。12h后，3組細胞分別取200μl加入各小室內，數目為1×105，在對應的24孔細胞培養(yǎng)板內（即小室外）加入500μl完全培養(yǎng)基。24h后取出小室，用細胞緩沖液PBS清洗2次，去除殘留的細胞，完成甲醛固定后用結晶紫進行染色2h。2h后清除殘余的結晶紫染料，置于顯微鏡下觀察并保留圖像，隨機選擇3個視野進行侵襲細胞計數。

1.2.6 Western blot實驗 將3組細胞分別種植于6孔細胞培養(yǎng)板，各3孔。棄去多余的培養(yǎng)液，加細胞緩沖液PBS清洗各孔2次。完畢后，各孔加入足量的細胞裂解液，待充分裂解細胞后，刮下細胞并混勻，冰浴1h。待細胞懸液不再黏稠，4℃下，12 000r/min，離心25min，取上清液分裝于EP管。將總蛋白按比例加入蛋白電泳用的上樣緩沖液，100℃水浴加熱 5min。保持實驗條件的等同，綜合所得的數據資料記錄平均值，上述實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,符合正態(tài)分布的計量資料以表示，3組比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組HCC-827肺癌細胞熒光顯微鏡下所見 見圖1（插頁）。

由圖1可見，空載體組、miR-30b轉染組可見綠色熒光，未轉染組未見綠色熒光，表明空載體、miR-30b已經轉染至HCC-827肺癌細胞內。

2.2 3組細胞轉染后48h miR-30b相對表達量的比較 見圖2。

圖2 3組細胞轉染后48h miR-30b相對表達量的比較

由圖2可見，miR-30b轉染組miR-30相對表達量為 6.97±0.42，顯著高于未轉染組 1.00±0.10、空載體組 1.15±0.09，差異有統(tǒng)計學意義（t=-24.08、-23.56，P＜0.05）。未轉染組和空載體組miR-30b相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 3組細胞的侵襲實驗顯微鏡下所見及結果統(tǒng)計見圖 3（插頁）。

由圖3可見，Transwell侵襲實驗進行24h后，3組侵襲細胞數目比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.79，P＜0.05）。miR-30b轉染組侵襲細胞的數目為157.00±10.54，與未轉染組、空載體組的（195.33±10.02、192.00±7.94）比較，分別下降了19.4%，17.9%，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（t=4.69、4.75，P＜0.05），表明過表達 miR-30b能顯著抑制HCC-827肺癌細胞的侵襲能力。

2.4 3組細胞p-EGFR、p-AKT蛋白表達的比較 見圖4。

圖4 3組細胞p-EGFR、p-AKT蛋白表達的比較

由圖4可見，經GAPDH內參標準化后，3組p-EGFR表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=130.59，P＜0.05）。miR-30b轉染組p-EGFR表達量為0.57±0.02，與未轉染組0.82±0.02、空載體組0.87±0.03比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=14.08、14.33，P＜0.05）。未轉染組和空載體組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3組p-AKT表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2440.5，P＜0.05）。miR-30b轉染組p-AKT蛋白表達量為0.32±0.01，與未轉染組0.66±0.01、空載體組 0.67±0.01比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=60.56、66.54，P＜0.05），未轉染組和空載體組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

microRNA表達譜與腫瘤的臨床和生物學特征相關，包括組織類型，分化，侵襲，治療反應和預后[6]，因此，自microRNA被發(fā)現以來，較早是用于各種腫瘤的鑒別診斷[7-8]，亦可用于預測腫瘤患者的生存時間。越來越多證據表明這類microRNA在各種生物過程具有重要作用，研究報道其上調與下調會對細胞的增殖、生長、分化與凋亡產生影響[9-10]，換言之，它們具有類似致癌或抑癌基因的功能[11]。microRNA進行基因調控的機制是它們同參與生成蛋白質的microRNA匹配，降低microRNA生成蛋白效率或其程度以抑制相關蛋白的表達[12-13]，從而實現對基因的調控，均已被相關研究證實。下游靶基因受microRNA的調節(jié)通路而發(fā)揮生物學效應[14]，microRNA的作用表現在調控細胞的整個生命過程，包括分化和凋亡，腫瘤細胞同樣接受其調控，這些microRNA可影響腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[15]。

肺癌是較常見的惡性腫瘤之一，具有較強的侵襲和轉移能力，臨床上其類型大多為非小細胞型，肺癌若發(fā)生早期轉移往往提示預后不良。在NSCLC中大多數均存在EGFR的突變，通常EGFR表達量升高。目前早期肺癌可采用開胸或胸腔鏡下外科手術切除腫瘤，治愈率較高，是目前可行的治療肺癌的方法，但也有一定的復發(fā)率。晚期肺癌患者有腦部或者其他器官轉移將失去手術機會，而化療帶給患者諸如手腳麻木、血細胞減少、神經損傷等不良反應有時讓患者難以忍受，放療對人體正常細胞產生較大的殺傷作用，放、化療對于NSCLC的疾病化解率約1/4和1/5。晚期肺癌臨床上也可以采取靶向治療方案[16]，然而遺憾的是患者往往會產生耐藥，最終的療效不能令人滿意。所以，尋找并研究其他治療手段十分重要。

許多研究表明，多種microRNA在肺癌中存在表達異常，microRNA let-7是第一個在肺癌組織中被發(fā)現表達異常的microRNA，之后研究者陸續(xù)發(fā)現miR-126、miR-191、miR-224等microRNA在肺癌中均有表達異常。microRNAs是內源性的小片段RNA，在先天上就具有其他優(yōu)勢，近些年對microRNA上調及下調對肺癌的影響的研究也慢慢地成為了熱點[1-2]。許多研究者試圖通過改變肺癌細胞中特定microRNA的表達量來分析該中microRNA對肺癌細胞生物學特性的影響。Bai等[17]發(fā)現通過改變A549肺癌細胞中miR-196b的表達量，發(fā)現它能抑制肺癌細胞的生長和轉移。Ma等[18]通過小鼠體內異種腫瘤移植實驗，體外肺癌細胞實驗證實miR-383對肺癌具有抑制作用。

綜上所述，本研究通過將外源性攜帶有miR-30b基因片段的質粒導入到HCC-827肺癌細胞中，構建出過表達miR-30b的穩(wěn)定細胞株，RT-PCR檢測證實miR-30b轉染組與未轉染組、空載體組相比，miR-30b存在過表達，transwell侵襲實驗證實miR-30b的過表達抑制了HCC-827肺癌細胞的侵襲能力[6]。Western blot實驗檢測miR-30b轉染組中p-EGFR與p-AKT

的表達顯著降低，表明過表達miR-30b可能通過EGFR/AKT信號通路抑制了HCC-827肺癌細胞的侵襲能力。許多研究表明多種信號通路會對肺癌起到調控作用，miR-30b通過EGFR/AKT信號通路對NSCLC的作用的機制需要進一步研究。調節(jié)microRNA表達水平,研究其對腫瘤生物學特性的改變和對相關通路的影響，為我們今后臨床上克服肺癌這一難題上開啟了一個新思路，為肺癌潛在的臨床治愈提供了新方案。

圖1 3組HCC-827肺癌細胞熒光顯微鏡下所見（a：未轉染組；b：空載體組；c：miR-30b轉染組）

圖3 3組細胞侵襲實驗顯微鏡下所見及結果統(tǒng)計（a：未轉染組；b：空載體組；c：miR-30b轉染組；d：3組細胞侵襲實驗結果比較）