何首烏離體快繁技術(shù)體系的建立

曾文丹 嚴(yán)華兵 曹升 謝向譽(yù) 陸柳英

摘要：【目的】建立何首烏離體快繁技術(shù)體系，為其種苗生產(chǎn)提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳詮膹V西陸川縣采集的何首烏幼嫩單芽莖段為外植體，分析不同滅菌時(shí)間、不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度及不同培養(yǎng)方式對其組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的影響?！窘Y(jié)果】適宜何首烏外植體消毒滅菌的方法為0.1% HgCl2浸泡處理8 min;適宜不定芽誘導(dǎo)的初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-氨基腺嘌呤（6-BA）+0.05 mg/L a-萘乙酸（NAA），腋芽萌發(fā)率達(dá)96.7%;適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L苯基噻二唑脲（TDZ）+ 0.05 mg/L NAA，增殖系數(shù)為5.68，植株健壯;無菌苗的單芽莖段以浸沒間歇式培養(yǎng)（TIBs）增殖系統(tǒng)效果最佳;適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.01 mg/L NAA，生根率達(dá)91.33%?！窘Y(jié)論】建立了以帶腋芽莖段為外植體的何首烏離體快繁技術(shù)體系，可為其種苗生產(chǎn)提供新途徑。

關(guān)鍵詞： 何首烏;離體快繁;苯基噻二唑脲（TDZ）;浸沒間歇式培養(yǎng)（TIBs）

中圖分類號： S567.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2018）12-2494-06

Establishment of rapid propagation technology for Polygonum multiflorum in vitro

ZENG Wen-dan1，2， YAN Hua-bing1*， CAO Sheng1，2， XIE Xiang-yu1，2， LU Liu-ying1，2

（1Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China; 2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】The present study was conducted to develop rapid propagation technology of Polygonum multiforum in vitro and provide reference for seeding-use seedling production. 【Method】The single-bud stems of P. multiforum from Luchuan， Guangxi were as the explants. The effects of different sterilization times，types and concentrations of plant growth regulators and different culture methods on the tissue culture rapid propagation technology of P. multiforum were explored. 【Result】The results showed that，the best explant sterilization effects for explants was achieved by immersing the explants in 0.1% HgCl2 solution for 8 min. The suitable primary medium for adventitious bud induction was MS+1.0 mg/L 6-aminadenine（6-BA）+0.05 mg/L a-naphthylacetic acid（NAA），and the axillary bud germination rate was 96.7% under this condition. The suitable subculture medium was MS+2.0 mg/L phenothiadiazolylurea（TDZ）+0.05 mg/L NAA，and the multiplication coefficient was 5.68.? The plantlets were strong. Temporary immersion system（TIBs） culture was suitable for single bud stem segment of P. multiforum aseptic seedlings. The suitable medium for rooting was 1/2MS+0.01 mg/L NAA，and the rooting rate was 91.33%. 【Conclusion】The in vitro rapid propagation system for P. multiforum explants with axillary bud is established，it can provide new method for producing seed-using seedlings.

Key words： Polygonum multiforum; in vitro propagation; phenothiadiazolylurea（TDZ）; temporary immersion system（TIBs）

0 引言

【研究意義】何首烏（Polygonum multiforum）別名首烏，為蓼科多年生宿根藤本植物，屬傳統(tǒng)中藥材，富含多種化學(xué)成分、維生素和微量元素及人體必須的18種氨基酸等，具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值（Rachel et al.，2003;Yang et al.，2005;孫桂波等，2007;曾文丹等，2016）。由于市場對何首烏原材料需求量不斷增大，其野生種源很難滿足市場需求，加上長期過量的采摘勢必會造成野生何首烏資源枯竭。但何首烏常規(guī)繁殖系數(shù)低，用種量大，難以滿足規(guī)?；a(chǎn)對種源的要求。組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高、不受外界環(huán)境條件限制等特點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的材料，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。因此，建立以帶腋芽莖段為外植體的何首烏離體快繁技術(shù)體系，對擴(kuò)大其種苗生產(chǎn)途徑及促進(jìn)新品種推廣具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】李娟玲等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，以何首烏種子為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg/L吲哚丁酸（IBA）和3.0%蔗糖，較適宜何首烏離體誘導(dǎo)培養(yǎng)。龍瀅等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，何首烏莖尖的誘導(dǎo)分化能力比莖段強(qiáng)，誘導(dǎo)率達(dá)100.0%。袁紅霞等（2005）以何首烏塊根為外植體，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出MS+0.5 mg/L 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）+3.0 mg/L吲哚乙酸（IAA）+0.1 mg/L 6-氨基腺嘌呤（6-BA）+3.0%蔗糖為最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。陳菊和陳國惠（2006b）采用二次回歸正交設(shè)計(jì)方法研究了何首烏繼代增殖培養(yǎng)基中6-BA和NAA（a-萘乙酸）的濃度配比關(guān)系。姚焱等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，2，4-D是誘導(dǎo)何首烏葉片愈傷組織的必需激素。間歇式浸沒培養(yǎng)（TIBs）系統(tǒng)是新型的植物組織培養(yǎng)系統(tǒng)，楊柳等（2010）使用TIBs系統(tǒng)進(jìn)行果蔗組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增殖系數(shù)較傳統(tǒng)方法高10.0倍以上;Yan等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，利用TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)的淮山組培苗各項(xiàng)生長指標(biāo)均顯著高于傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)的組培苗;高美萍等（2016）利用TIBs系統(tǒng)開展慈姑組培快繁，發(fā)現(xiàn)TIBs系統(tǒng)可使慈姑組培苗一代增殖19.5倍以上，比傳統(tǒng)方法提高3.0倍以上?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，利用何首烏帶腋芽莖段為外植體建立離體快繁技術(shù)體系的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立以帶腋芽莖段為外植體的何首烏離體組培快繁技術(shù)體系，為加快何首烏良種繁育及開展其生物技術(shù)育種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

何首烏幼嫩莖段采自廣西陸川縣中藥材種植示范基地。HgCl2、6-BA和NAA等均購自生工生物工程（上海）股份限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體預(yù)處理 將采集的何首烏嫩莖剪成長約2.0 cm的單芽莖段，剪掉其葉片后置于添加洗潔精的水中用軟毛刷清洗表面污垢，在流水中沖洗干凈后備用。

1. 2. 2 外植體表面消毒 將預(yù)處理后的何首烏單芽莖段分別用0.1% HgCl2浸泡4、6、8和10 min進(jìn)行消毒（4個消毒處理）。浸泡期間常振蕩容器，使外植體與HgCl2溶液充分接觸。將經(jīng)消毒處理的外植體用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干表面水分備用。接種時(shí)，在超凈工作臺上將單芽莖段修剪至長約1.0 cm后插入MS培養(yǎng)基。每處理接種45瓶，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次，每5 d觀察記錄1次，接種30 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率及存活率。

1. 2. 3 初代培養(yǎng)基篩選 將經(jīng)消毒處理的無菌單芽莖段分別接種于添加1.0、2.0和3.0 mg/L 6-BA 和0.01、0.02和0.05 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基中（共6個處理）。每處理接種15瓶，每瓶接6個單芽莖段，重復(fù)3次，每重復(fù)5瓶。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率、株高、愈傷組織寬度和不定芽數(shù)，觀察不定芽的生長情況。

1. 2. 4 繼代培養(yǎng)基篩選 將初代培養(yǎng)獲得的無菌苗單芽莖段接種于添加1.5、2.0和2.5 mg/L 6-BA或1.5、2.0和2.5 mg/L苯基噻二唑脲（TDZ）、0.02和0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中。每處理接種15瓶，每瓶接6個單芽莖段，重復(fù)3次，每重復(fù)5瓶。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖系數(shù)（帶葉莖節(jié)位數(shù)）、株高及愈傷組織寬度、鮮重和干重。

1. 2. 5 不同培養(yǎng)方式對繼代增殖的影響 將無菌苗的單芽莖段分別采用半固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和TIBs系統(tǒng)進(jìn)行增殖培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，比較不同培養(yǎng)方式無菌苗的繁殖系數(shù)、株高、鮮重和干重差異。每處理接種15瓶，每瓶接6個單芽莖段，重復(fù)3次，每重復(fù)5瓶。每隔15 d觀察記錄1次，接種30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖系數(shù)、株高及愈傷組織寬度、鮮重和干重。

1. 2. 6 生根培養(yǎng) 將無菌苗的單芽莖段接種于添加0、0.10、0.20和0.30 mg/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基中。每處理接種15瓶，每瓶接6個單芽莖段，重復(fù)3次，每個重復(fù)5瓶。接種30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的生根率和株高，并觀察生長情況。

1. 2. 7 煉苗和移栽 將生長健壯、根系較發(fā)達(dá)的無菌組培苗從培養(yǎng)室移入溫室煉苗，放置約5 d后擰松瓶蓋，使瓶內(nèi)環(huán)境與外界相當(dāng)，讓組培苗在自然狀態(tài)下馴化2～3 d后取出，洗凈附著的培養(yǎng)基，用0.1%高錳酸鉀溶液清洗后栽入珍珠巖∶草炭土∶黃土（體積比2∶2∶1）的混合基質(zhì)中。移栽30 d后統(tǒng)計(jì)其成活率。

1.2.3～1.2.6中，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照1500～2000 lx，光照時(shí)間12 h/d。若無特別說明，培養(yǎng)基均添加30.0 g/L蔗糖和6.0 g/L瓊脂粉，pH 5.8。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2010進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 外植體的消毒結(jié)果

由表1可知，隨消毒時(shí)間的延長，何首烏外植體的污染率明顯降低，但褐化率逐漸升高。其中，消毒時(shí)間為4 min時(shí)外植體的褐化率僅4.7%，但污染率達(dá)53.2%，成活率僅42.1%;消毒10 min時(shí)外植體的污染率最低，僅10.3%，但褐化率最高，達(dá)25.6%;消毒時(shí)間為8 min時(shí)外植體的褐化率為10.4%，污染率為12.5%，成活率最高，達(dá)77.1%。說明0.1% HgCl2消毒8 min對何首烏外植體的滅菌效果最佳。

2. 2 初代培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

經(jīng)消毒處理的何首烏單芽莖段接種至附加不同濃度6-BA和NAA組合的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 d后腋芽開始萌發(fā)，部分莖段基部開始膨大形成愈傷組織。由表2可知，在相同NAA濃度下，處理3的腋芽萌發(fā)率、株高和產(chǎn)生的不定芽數(shù)顯著低于處理1和處理2（P<0.05，下同），愈傷組織寬度較大，但與處理2差異不顯著（P>0.05，下同）;處理6的腋芽萌發(fā)率、株高和不定芽數(shù)顯著低于處理4和處理5，愈傷組織寬度顯著大于處理4和處理5，說明高濃度（3.0 mg/L）6-BA不利于何首烏腋芽萌發(fā)和萌發(fā)芽的生長。在相同低濃度（1.0和2.0 mg/L）6-BA下，隨NAA濃度的增加，何首烏莖段腋芽萌發(fā)率和株高均增加。在添加1.0 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基中，何首烏外植體的腋芽萌芽率、株高和不定芽數(shù)均最高，芽的長勢良好，植株健壯，表明MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA是最佳的何首烏外植體初代培養(yǎng)基。

2. 3 繼代培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的單芽莖段接種至不同濃度6-BA、TDZ和NAA組合的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，結(jié)果見表3。由表3可知，在相同NAA濃度下，隨6-BA濃度的增加，不定芽的增殖系數(shù)、株高、鮮重和愈傷組織鮮重均呈先增加后減少的變化趨勢，其中以2.0 mg/L 6-BA處理的增殖效果最佳;在相同6-BA濃度下，添加0.05 mg/L NAA較添加0.02 mg/L NAA增殖效果佳，其中以處理4的增殖效果最佳;在相同NAA濃度下，隨TDZ濃度的增加，不定芽的增殖系數(shù)、鮮重和愈傷組織鮮重均呈先增加后減少的變化趨勢;株高和愈傷組織寬度隨之增加，但差異不顯著。此外，以相同濃度的TDZ和6-BA對何首烏組培苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，TDZ誘導(dǎo)的不定芽較6-BA誘導(dǎo)的不定芽粗壯（圖1-A和圖1-B），且處理8的增殖系數(shù)顯著高于處理4。說明MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L NAA為何首烏組培苗最佳繼代培養(yǎng)基。

2. 4 不同培養(yǎng)方式對不定芽繼代增殖的影響

由表4可知，采用TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)何首烏組培苗（圖1-C）的增殖系數(shù)、株高和不定芽鮮重均高于其余2種培養(yǎng)方式，其中增殖系數(shù)達(dá)5.24，顯著高于以液體培養(yǎng)方式誘導(dǎo)的不定芽，且愈傷組織寬度僅3.27 mm，顯著低于其余培養(yǎng)方式。說明TIBs系統(tǒng)不利于何首烏組培苗基部愈傷組織產(chǎn)生，可作為何首烏不定芽增殖的最佳培養(yǎng)方式。

2. 5 生根培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

不同NAA濃度對何首烏組培苗生根的影響結(jié)果見表5。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加NAA時(shí)，組培苗生根率僅39.00%，株高為2.14 cm，顯著低于其余3個處理，且根系纖細(xì)，須根少，不利于組培苗移栽成活。隨NAA濃度的增加，組培苗根系增粗，形成須根。但當(dāng)NAA濃度增至0.30 mg/L時(shí)，組培苗根部形成愈傷組織，部分植株生長異常（圖1-F）。當(dāng)NAA濃度為0.10 mg/L時(shí)，組培苗生根率為91.33%，顯著高于其余處理，且植株生長正常，根系較粗（圖1-D和圖1-E）。說明1/2MS+0.10 mg/L NAA為何首烏最佳生根培養(yǎng)基。

2. 6 組培苗移栽

將生根苗移栽于珍珠巖∶草炭土∶黃土（2∶2∶1）混合基質(zhì)中，30 d后組培苗移栽成活率達(dá)95.0%，且生長良好（圖1-G）。

3 討論

TDZ是人工合成的苯基脲衍生物之一，具有很強(qiáng)的類似于細(xì)胞分裂素的活性，已廣泛應(yīng)用于各種植物的不定芽、愈傷組織及體細(xì)胞胚誘導(dǎo)，且作用效果明顯（魏岳榮等，2007;賈夢雪等，2013;朱橋等，2014;李晶等，2016）。吳光洪等（2016）研究認(rèn)為，在誘導(dǎo)藍(lán)莓葉片產(chǎn)生不定芽過程中，TDZ發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。劉義存等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，TDZ對櫟葉枇杷莖段愈傷組織具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)能力。孫英坤等（2017）分別采用6-BA、激動素（KT）和玉米素（ZT）進(jìn)行堇葉紫金牛不定芽誘導(dǎo)，均無法誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，改用TDZ后，各處理均產(chǎn)生大量不定芽。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，將誘導(dǎo)出的何首烏單芽莖段移至MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L NAA 增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，殖系數(shù)最大，達(dá)5.68，比使用添加同濃度6-BA的培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA）的增殖系數(shù)大14.8%，且植株粗壯。

TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)可促進(jìn)容器中氣體與培養(yǎng)基進(jìn)行氣體交換，防止?fàn)I養(yǎng)成分沉積和有害物質(zhì)積累（許亞良和張家明，2013;曾文丹等，2014）。本研究采用TIBs方式培養(yǎng)何首烏組培苗單芽莖段，其增殖系數(shù)、株高和不定芽鮮重均高于半固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)方式，與楊柳等（2010）對果蔗、Yan等（2010）對淮山、高美萍等（2016）對慈姑的研究結(jié)果相似。

已有研究表明，影響何首烏生根的因子排序?yàn)榕囵B(yǎng)基>IBA>蔗糖>NAA，而添加一定濃度（0.50 mg/L）植物生長調(diào)節(jié)劑[多效唑（PPP333）]對其不定根誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用（陳菊和陳國惠，2006a;徐秋云等，2012），本研究結(jié)果與其存在差異，在1/2MS中添加低濃度（0.10 mg/L）NAA可促進(jìn)何首烏組培苗生根（生根率高于90.0%），而添加高濃度（0.30 mg/L）NAA會促使組培苗基部形成愈傷組織，不利于生根，可能與供試外植體來源不同有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究建立的何首烏離體組培快繁技術(shù)體系為：將幼嫩何首烏單芽莖段用0.1% HgCl2消毒8 min，無菌水清洗4～5次滅菌后，在初代培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，在MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L NAA中進(jìn)行組培苗增殖培養(yǎng)，在1/2MS+0.10 mg/L NAA中進(jìn)行生根培養(yǎng)。該離體快繁技術(shù)體系可為何首烏種苗生產(chǎn)提供新的途徑。

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