海洋細(xì)菌GM-1-1產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

吳海霞 陳茹 曹雪梅 李歡 暴增海 馬桂珍 王軍強(qiáng) 羅志會(huì)

摘要：【目的】?jī)?yōu)化海洋解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GM-1-1的產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件，為該菌株的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳訥M-1-1菌株發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率為檢測(cè)指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)該菌株產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化;GM-1-1菌株發(fā)酵完成后噴霧干燥制成菌粉，加入不同助劑制成有效含量為1010 CFU/g的可濕性粉劑用于水稻紋枯病田間防治試驗(yàn)。【結(jié)果】GM-1-1菌株產(chǎn)芽孢最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥麩0.75%、花生餅粉2.5%、CaCO3 0.05%;最佳發(fā)酵條件為pH 7，溫度30 ℃，250 mL三角瓶裝液量60 mL，接種量8%，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間54 h。優(yōu)化后GM-1-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率分別達(dá)7.40×109個(gè)/mL和89.42%。田間防治試驗(yàn)結(jié)果表明，GM-1-1可濕性粉劑對(duì)水稻紋枯病的防治效果最高可達(dá)82.06%?！窘Y(jié)論】?jī)?yōu)化后的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可有效提高GM-1-1菌株的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率，且培養(yǎng)基成本低、來源廣泛。GM-1-1可濕性粉劑對(duì)水稻紋枯病有較好的防治效果，可用于生產(chǎn)菌劑并推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 海洋解淀粉芽孢桿菌;GM-1-1菌株;芽孢;培養(yǎng)基;發(fā)酵條件;田間防治效果

中圖分類號(hào)： S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）12-2454-09

Optimization of fermentation medium for spore production and flask-shaking fermentation conditions of marine

bacteria GM-1-1

WU Hai-xia1， CHEN Ru1， CAO Xue-mei1， LI Huan1， BAO Zeng-hai1，

MA Gui-zhen1*， WANG Jun-qiang2， LUO Zhi-hui2

（1School of Marine Science and Technology， Huaihai Institute of Technology，Lianyungang， Jiangsu? 222005， China; 2Jiangsu Frey Agrochemicals Co.， Ltd.， Lianyungang， Jiangsu? 222005， China）

Abstract：【Objective】Fermentation medium for spore production and flask-shaking fermentation conditions of Baci-llus amyloliquefaciens GM-1-1 were optimized， in order to provide theoretical references for exploitation and application of GM-1-1 strain. 【Method】Total number of bacteria and spore production rate in fermentation broth of GM-1-1strain were set as test indexes. And fermentation medium for spore production and flask-shaking fermentation conditions of GM-1-1 strain were optimized by using single factor and orthogonal test. After the fermentation was finished， bacteria powder was made by spraying and dying. Then different promoters were added to make the wettable powder with effective content of 1010 CFU/g. The wettable powder was used to conduct field control test of rice sheath blight. 【Result】The results showed that the best formulation of fermentation medium for spore production of GM-1-1 strain was as follows：wheat bran 0.75%， peanut meal 2.5% and CaCO3 0.05% . The optimum fermentation conditions were as follows：pH 7， temperature 30 ℃， broth content 60 mL in 250 mL triangular flask， inoculation amount 8%， rotation speed 200 r/min and incubation time 54 h. After optimization， the total number of bacteria and spore production rate infermentation mediumof GM-1-1 strain reached 7.4×109 cells/mL and 89.42% respectively. The results of field control test showed that control efficacy of GM-1-1 wettable powder on rice sheath blight could be up to 82.06%. 【Conclusion】The optimized medium and fermentation conditions can effectively increase total number of bacteria and spore production rateof GM-1-1 strain， and the culture cost is low and with wide source. The control efficacy of GM-1-1 wettable powder on rice sheath blight is fine. Therefore， GM-1-1 can be used to produce bacterial agents and then be promoted and applied.

Key words： Bacillus amyloliquefaciens; GM-1-1 strain; spore; medium; fermentation conditions; field control effects

0 引言

【研究意義】水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻三大重要病害之一，一般發(fā)病時(shí)可造成水稻減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%以上。目前生產(chǎn)中主要使用井岡霉素進(jìn)行防治，農(nóng)藥種類單一，一些地區(qū)的水稻紋枯病菌已出現(xiàn)了抗藥性（許麗娟等，2008）。因此，研究新型、高效、無毒的生物農(nóng)藥豐富植物病害防治藥劑種類，避免長(zhǎng)期使用單一藥劑帶來的副作用已成為當(dāng)前植物病害防治研究的熱點(diǎn)。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amylolique-faciens）是重要的農(nóng)業(yè)生防菌，該菌可通過產(chǎn)生一系列抑制細(xì)菌和真菌的代謝物而達(dá)到防治植物病害的目的（Sutyak et al.，2008;王玲等，2014;饒勝其等，2015;李曉宇，2018）。美國(guó)、德國(guó)已將該菌制成不同制劑用于馬鈴薯黑痣病、黃瓜白粉病和稻瘟病等病害的防治，且已商品化（陳志誼，2015）。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2013年為解淀粉芽孢桿菌頒發(fā)了100億活芽孢/g的母藥和10億活芽孢/g可濕性粉劑生產(chǎn)許可證，已有產(chǎn)品登記銷售，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本研究旨在優(yōu)化源自海洋的解淀粉芽孢桿菌GM-1-1菌株的發(fā)酵條件，為該菌株制劑的研制提供參考。【前人研究進(jìn)展】來源于不同生境的解淀粉芽孢桿菌菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)及其環(huán)境要求不同，優(yōu)化適合特定菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件是開發(fā)應(yīng)用優(yōu)良菌株的基礎(chǔ)（趙志祥等，2015;武國(guó)慧等，2017）。不同學(xué)者采用單因素和正交試驗(yàn)及Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面法分別對(duì)解淀粉芽孢桿菌的不同菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了發(fā)酵水平。郭龍濤等（2010）采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TB2菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件下發(fā)酵水平活菌數(shù)達(dá)8.52×1010 CFU/mL;蔣盼盼等（2016）采用單因子篩選和正交試驗(yàn)對(duì)解淀粉芽孢桿菌菌株B1619的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的生物發(fā)酵工藝獲得的發(fā)酵菌液含菌量為7.13×109 CFU/mL，比初始發(fā)酵工藝的發(fā)酵菌液含菌量提高了87.83%;王法國(guó)等（2017）通過單因素試驗(yàn)及Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面法對(duì)解淀粉芽孢桿菌菌株JT84的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件下發(fā)酵液芽孢含量為1.67×109 CFU/mL，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基芽孢含量提高159%。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵的優(yōu)化主要集中在抗菌物質(zhì)的研究應(yīng)用和提高單位體積發(fā)酵液活菌數(shù)量方面，對(duì)提高芽孢數(shù)量的研究報(bào)道較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】解淀粉芽孢桿菌GM-1-1菌株是本實(shí)驗(yàn)室（抗菌微生物及其代謝產(chǎn)物研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，下同）從連云港海域分離得到的一株對(duì)多種植物病原真菌有較強(qiáng)抑制作用、具有良好生防應(yīng)用前景的優(yōu)良菌株（葛平華等，2012;王琦等，2016;曹雪梅等，2017）。本研究以GM-1-1菌株發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率為檢測(cè)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化GM-1-1菌株的培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件，以期為該菌株的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 海洋解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）菌株GM-1-1由本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域中分離獲得并保藏;水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 菌株活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基;菌株種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、葡萄糖5 g/L。

1. 2 種子液制備

取1環(huán)活化18 h的GM-1-1菌株接種于盛有60 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃ 180 r /min振蕩培養(yǎng)18 h，調(diào)整菌液濃度為108個(gè)/mL，作為發(fā)酵用種子液。

1. 3 搖瓶發(fā)酵初始條件

將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到裝有60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，pH 7.0、28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)54 h。

1. 4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

參考沈萍和陳向東（2007）采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。參考陳美娜等（2013）采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定芽孢產(chǎn)率。

1. 5 培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)

1. 5. 1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 將GM-1-1菌株在不同的培養(yǎng)基（表1）中按初始發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率為指標(biāo)，選擇細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率較高的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1. 5. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn) 選擇8種碳源（蔗糖、棉子糖、玉米粉、淀粉、葡萄糖、乳糖、麥麩和麥芽糖），7種氮源（胰蛋白胨、脲、硫酸銨、酵母粉、牛肉膏、花生餅粉和豆餅粉），10種無機(jī)鹽（K2HPO4、KH2PO4、ZnSO4、MgCl2、MnSO4、CaCO3、CaCO3+MnSO4、CaCO3+MgCl2、CaCO3+MnSO4+MgCl2和MnSO4+MgCl2），分別等量代替篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機(jī)鹽，配制不同發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行GM-1-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率篩選出最適碳源、氮源和無機(jī)鹽種類。

設(shè)置篩選出的碳源、氮源和無機(jī)鹽的不同濃度分別進(jìn)行GM-1-1菌株發(fā)酵試驗(yàn)，篩選出碳源、氮源和無機(jī)鹽的適宜濃度。

1. 5. 3 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽種類和濃度，按正交試驗(yàn)L9（33）設(shè)計(jì)（表2）配制不同培養(yǎng)基進(jìn)行GM-1-1菌株發(fā)酵試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)基配方。

1. 6 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)

以優(yōu)化的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別測(cè)定不同初始pH（5、6、7、8和9）、發(fā)酵時(shí)間（0～60 h，每間隔4 h為一時(shí)間梯度，產(chǎn)芽孢后每隔2 h為一時(shí)間梯度）、裝液量（30、50、60、70、90、110和250 mL）、溫度（24、26、28、30和32 ℃）、接種量（5%、8%、10%、12%和15%）和搖床轉(zhuǎn)速（140、160、180、200和220 r/min）對(duì)GM-1-1菌株細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率的影響。以初始發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，每一因素的優(yōu)化均在前一因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行。

1. 7 GM-1-1可濕性粉劑對(duì)水稻紋枯病的田間防治試驗(yàn)

按照上述篩選的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行GM-1-1菌株發(fā)酵，發(fā)酵完成后噴霧干燥制成菌粉，加入不同助劑（硅藻土和硬脂酸鈣等）制成有效含量為1010 CFU/g的可濕性粉劑，在水稻紋枯病發(fā)病前或發(fā)病初期均勻噴霧于水稻莖基部，每隔7 d用藥1次，連續(xù)用藥3次，最后一次噴藥7 d后調(diào)查發(fā)病率，收獲時(shí)測(cè)定產(chǎn)量，計(jì)算防病效果和保產(chǎn)率。田間試驗(yàn)在江蘇省連云港市東海縣石榴鎮(zhèn)進(jìn)行，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)面積25 m2，可濕性粉劑設(shè)450、600、750、900 和1050 g/ha 5個(gè)濃度，以20%井崗霉素水劑為對(duì)照CK1，清水為對(duì)照CK2，每一濃度及對(duì)照為一處理，3次重復(fù)。

發(fā)病率（%）=發(fā)病數(shù)/調(diào)查總數(shù)×100

保產(chǎn)率（%）=（處理產(chǎn)量-清水對(duì)照產(chǎn)量）/清水

對(duì)照產(chǎn)量×100

防治效果（%）=（清水對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/

清水對(duì)照發(fā)病率×100

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Duncans進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2. 1. 1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選結(jié)果 由圖1可知，5種供試培養(yǎng)基中C號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率最高，分別為4.04×109個(gè)/mL和82.73%，顯著高于其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理（P<0.05，下同）;其次是D號(hào)培養(yǎng)基，細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率分別為3.6×109個(gè)/mL和73.62%;培養(yǎng)基A和E不產(chǎn)芽孢。因此，選取C號(hào)培養(yǎng)基為GM-1-1菌株產(chǎn)芽孢的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2. 1. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 2. 1 碳源 由圖2可知，以7號(hào)麥麩為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率最高，分別為3.65×109個(gè)/mL和85.74%，顯著高于其他碳源培養(yǎng)基處理;以4號(hào)淀粉為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)最少，為2.29×109個(gè)/mL，說明GM-1-1菌株在生長(zhǎng)過程中不能很好地利用淀粉。因此，選擇麥麩作為GM-1-1菌株產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基的碳源。

由圖3可知，麥麩濃度為0.50%時(shí)發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均達(dá)最高值，分別為3.80×109個(gè)/mL和85.71%;當(dāng)濃度低于或高于0.50%時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均有所下降。因此，選擇0.25%、0.50%和0.75%作為正交試驗(yàn)碳源濃度的3個(gè)水平。

2. 1. 2. 2 氮源 由圖4可知，以5號(hào)牛肉膏為氮源的發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)最高，為5.58×109個(gè)/mL，顯著高于其他氮源發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)，但不產(chǎn)生芽孢;其次是6號(hào)花生餅粉為氮源的培養(yǎng)基，細(xì)菌總數(shù)為3.81×109個(gè)/mL，芽孢產(chǎn)率最高，為87.10%;2、3和5號(hào)氮源的發(fā)酵液均不產(chǎn)生芽孢。因此，選擇6號(hào)花生餅粉作為GM-1-1菌株產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

由圖5可知，花生餅粉濃度對(duì)GM-1-1菌株發(fā)酵液的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率有明顯影響，花生餅粉濃度為2.5%時(shí)細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均達(dá)最高值，分別為3.80×109個(gè)/mL和86.30%;濃度高于或低于2.5%時(shí)發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均有所降低。因此，選擇2.0%、2.5%和3.0%作為正交試驗(yàn)氮源花生餅粉濃度的3個(gè)水平。

2. 1. 2. 3 無機(jī)鹽 由圖6可知，添加7號(hào)CaCO3和4號(hào)ZnSO4發(fā)酵液處理中的芽孢產(chǎn)率顯著高于其他無機(jī)鹽發(fā)酵液，芽孢產(chǎn)率分別為88.15%和89.44%，二者間無顯著差異（P>0.05，下同），但4號(hào)ZnSO4發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)最少，僅1.64×109個(gè)/mL，而7號(hào)CaCO3發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)最高，為4.68×109個(gè)/mL，顯著高于其他處理;添加其余幾種無機(jī)鹽的發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)均較低。因此，選擇CaCO3為GM-1-1菌株產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的無機(jī)鹽。

由圖7可知，CaCO3濃度為0.10%時(shí)發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均達(dá)最高值，分別為3.95×109個(gè)/mL和81.08%;濃度低于或高于0.10%時(shí)發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均明顯下降。因此，選擇0.05%、0.10%和0.20%作為正交試驗(yàn)無機(jī)鹽濃度的3個(gè)水平。

2. 1. 3 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，氮源花生餅粉（B）對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響最大，其次為無機(jī)鹽CaCO3（C）、碳源麥麩（A），即B>C>A，對(duì)應(yīng)的最佳組合為A3B2C1;碳源麥麩（A）對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響最大，其次是無機(jī)鹽CaCO3（C）、氮源花生餅粉（B），即A>C>B，對(duì)應(yīng)的最佳組合為A3B2C2。8號(hào)試驗(yàn)A3B2C1培養(yǎng)基中的細(xì)菌總數(shù)和產(chǎn)芽胞率最高，分別為5.90×109個(gè)/mL和88.78%，顯著高于其他試驗(yàn)組合，因此確定產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：麥麩0.75%、花生餅粉 2.5%、CaCO3 0.05%。

2. 2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2. 2. 1 pH pH對(duì)GM-1-1菌株的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率有顯著影響，在pH為5～7時(shí)細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均隨pH增大而增加，pH為7時(shí)細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均最高，分別為5.75×109個(gè)/mL和90.92%，當(dāng)pH大于7時(shí)，細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均明顯下降，說明中性條件適合GM-1-1菌株生長(zhǎng)。因此，選擇pH 7為GM-1-1菌株搖瓶產(chǎn)芽孢發(fā)酵的最佳pH。

2. 2. 2 發(fā)酵時(shí)間 由圖9可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)GM-1-1菌株的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率有明顯影響，在0～20 h內(nèi)細(xì)菌總數(shù)增長(zhǎng)緩慢，20 h后細(xì)菌總數(shù)快速增加，20～28 h為對(duì)數(shù)期，28 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌總數(shù)增加緩慢，芽孢開始形成，32 h后產(chǎn)芽孢率快速增加，40 h細(xì)菌總數(shù)最高，為6.95×109個(gè)/mL，54 h芽孢產(chǎn)率達(dá)最高值，為91.81%，其后細(xì)菌總數(shù)開始下降，進(jìn)入衰退期。因此，選擇54 h為GM-1-1菌株搖瓶產(chǎn)芽孢發(fā)酵的最佳發(fā)酵時(shí)間。

2. 2. 3 裝液量 由圖10可知，在250 mL三角瓶中，裝液量為30～60 mL/時(shí)，隨裝液量的增加，發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率呈上升趨勢(shì)，裝液量在60 mL時(shí)發(fā)酵液的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均最高，分別為5.95×109個(gè)/mL和87.37%;裝液量大于60 mL后細(xì)菌總數(shù)明顯下降。因此，選擇60 mL為GM-1-1菌株搖瓶產(chǎn)芽孢發(fā)酵的最佳裝液量。

2. 2. 4 接種量 由圖11可知，接種量為5%～8%時(shí)，GM-1-1菌株發(fā)酵液的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率呈上升趨勢(shì)，8%時(shí)達(dá)最高值，細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率分別為6.30×109個(gè)/mL和87.25%;接種量超過8%后，細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均減少。因此，選擇8%為GM-1-1菌株搖瓶產(chǎn)芽孢發(fā)酵的最佳接種量。

2. 2. 5 發(fā)酵溫度 由圖12可知，在24～30 ℃時(shí)，GM-1-1菌株發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均呈上升趨勢(shì)，30 ℃時(shí)細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均達(dá)最高值，分別為7.20×109個(gè)/mL和88.34%，超過30 ℃細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均明顯下降。因此，選擇30 ℃作為GM-1-1菌株搖瓶產(chǎn)芽孢發(fā)酵的最佳溫度。

2. 2. 6 搖床轉(zhuǎn)速 由圖13可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140～200 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速增大，GM-1-1菌株發(fā)酵液中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率均呈上升趨勢(shì)，在200 r/min時(shí)細(xì)菌總數(shù)最高，達(dá)7.40×109個(gè)/mL，芽孢產(chǎn)率為89.42%;在轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)芽孢產(chǎn)率最大，為92.08%，但可能搖床轉(zhuǎn)速太快導(dǎo)致菌體自溶，其細(xì)菌總數(shù)較低，僅為3.20×109個(gè)/mL。綜合考慮，選擇200 r/min作為GM-1-1菌株搖瓶產(chǎn)芽孢發(fā)酵最佳搖床轉(zhuǎn)速。

2. 3 GM-1-1可濕性粉劑對(duì)水稻紋枯病的田間防治效果

由表3可知，GM-1-1可濕性粉劑對(duì)水稻紋枯病有明顯的防治作用，用藥量為750 g/ha時(shí)水稻產(chǎn)量最高，為8323.5 kg/ha;用藥量為1050 g/ha時(shí)對(duì)水稻紋枯病的防治病效果最好，為82.06%。GM-1-1可濕性粉劑用藥量不同，防病效果和產(chǎn)量稍有不同，但各處理組的水稻產(chǎn)量和對(duì)水稻紋枯病的防治效果均與噴霧20%井岡霉素水劑（CK1）處理組的水稻產(chǎn)量和防治效果相當(dāng)，因此，田間可使用GM-1-1可濕性粉劑防治水稻紋枯病。

3 討論

芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中形成的一種抗逆休眠體，芽孢的形成受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境等因素的綜合影響（郭威等，2017;王繼雯等，2017）。芽孢產(chǎn)率是衡量生防菌劑品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)（鄭雙鳳，2017），通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可提高產(chǎn)芽孢細(xì)菌的芽孢產(chǎn)率和細(xì)菌總數(shù)，為工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)、開發(fā)生防菌劑提供保障。

本研究結(jié)果表明，麥麩作為碳源對(duì)源于海洋的解淀粉芽孢桿菌GM-1-1菌株的細(xì)胞總數(shù)和芽孢形成有利，與王繼雯等（2014）對(duì)巨大芽孢桿菌C2的研究結(jié)果一致，且麥麩廉價(jià)易得，成本低，適合工業(yè)上大批量發(fā)酵。本研究中，GM-1-1菌株在以花生餅粉為氮源的培養(yǎng)基上細(xì)菌總數(shù)和芽孢產(chǎn)率較高，與劉寬博等（2016）對(duì)枯草芽孢桿菌C3的研究結(jié)果一致;而添加其他氮源（硫酸銨和脲）不利于GM-1-1菌株細(xì)菌總數(shù)的增加和芽孢形成，說明無機(jī)氮源不適宜其生長(zhǎng)及形成芽孢;添加速效氮源（胰蛋白胨）的芽孢形成率明顯低于長(zhǎng)效氮源（花生餅粉和豆餅粉），與郭榮君等（2005）報(bào)道的速效氮源對(duì)生防菌BH1菌株芽孢形成效果較差相一致。Posada-Uribe等（2015）研究表明添加無機(jī)鹽可提高枯草芽孢桿菌EA-CB0575的芽孢產(chǎn)率;李文哲等（2017）研究發(fā)現(xiàn)添加鈣離子可提高枯草芽孢桿菌D1的芽孢產(chǎn)率;本研究亦發(fā)現(xiàn)添加鈣離子可促進(jìn)芽孢生成。相關(guān)研究表明，大多數(shù)鈣離子與芽孢所特有的化學(xué)成分吡啶二羧酸相結(jié)合，形成的鈣—吡啶二羧酸復(fù)合物約占芽孢干重的10%，復(fù)合物通過降低芽孢水含量而增加芽孢的抗逆性（郭夏麗等，2012）。

本研究按照優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件發(fā)酵GM-1-1菌株后噴霧干燥制成菌粉，添加不同載體助劑制成含量為1010 CFU/g的GM-1-1可濕性粉劑，對(duì)水稻紋枯病的田間防治效果最高可達(dá)82.06%，與20%井岡霉素水劑的防治效果相當(dāng)，且用該菌粉后水稻產(chǎn)量有一定的增加，表明該菌株具有良好的應(yīng)用前景。為提高該菌株的防病效果，今后將進(jìn)一步開展菌藥混配方面的研究，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

GM-1-1菌株產(chǎn)芽孢最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥麩0.75%、花生餅粉2.5%、CaCO3 0.05%;最佳發(fā)酵條件為pH 7，溫度30 ℃，250 mL三角瓶裝液量60 mL，接種量8%，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間54 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成本低，來源廣泛，適合工業(yè)上大批量發(fā)酵，可采用GM-1-1菌株生產(chǎn)菌劑并推廣應(yīng)用。

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