天花粉化學(xué)成分的藥理活性及其提取與檢測方法研究進(jìn)展

丁建營 劉春娟 郭建軍 胡曉宇 公愛娟 張波

中圖分類號 R93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1859-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.31

摘 要 目的：為建立天花粉的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：以“天花粉”“化學(xué)成分”“質(zhì)量評價”“天花粉蛋白”“天花粉凝集素”“天花粉多糖”“藥理活性”“檢測方法”“Trichosanthis Radix”“Chemical component”“Quality evaluation”“Trichosanthin”“Trichosanthes kirilowii lection”“Polysaccharides of trichosanthis radix”等為關(guān)鍵詞，組合查詢1980年1月-2018年1月在中國知網(wǎng)、萬方、維普、ScienceDirect、PubMed、Web of Science等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)，對天花粉化學(xué)成分的藥理活性、提取與檢測方法進(jìn)行論述。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)857篇，其中有效文獻(xiàn)54篇。天花粉含有蛋白質(zhì)類、多糖類、皂苷類、黃酮類、氨基酸等多種活性成分，其中研究較多的為天花粉蛋白、天花粉多糖、天花粉凝集素這3種成分的藥理活性、提取與檢測方法，而皂苷類成分和黃酮類成分研究較少，停留在總皂苷或總黃酮的層面上，缺乏化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定及藥理活性研究。天花粉蛋白是天花粉的專屬性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、中期引產(chǎn)等多種藥理活性，可作為天花粉質(zhì)量評價指標(biāo)性成分。

關(guān)鍵詞 天花粉；化學(xué)成分；質(zhì)量評價；天花粉蛋白；天花粉凝集素；天花粉多糖

天花粉，又名栝樓根，為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthornii Harms.）的干燥根，具有清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿等多種功效[1]，是臨床常用中藥材之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年版《中國藥典》（一部）收載的成方制劑和單味制劑共1 943種，其中含有天花粉的中成藥有44個之多，約占收載總量的2.3%，使用頻次較高[1]。再者，天花粉為“消渴圣藥”，可“通月水”“治包衣不下”[2]，在治療糖尿病及終止妊娠方面具有極高的新藥開發(fā)利用價值。天花粉發(fā)揮其藥理活性的主要成分包括天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）、天花粉凝集素（Trichosanthes kirilowii lection，TKL）、天花粉多糖、瓜氨酸，此外還包括皂苷類和黃酮類成分等[3]，但在諸多的化學(xué)成分中并沒有明確其質(zhì)量控制指標(biāo)性成分。2015年版《中國藥典》（一部）僅規(guī)定了天花粉的“水浸出物含量（冷浸法）不得少于15.0%”[1]，指標(biāo)特異性有待提高。筆者以“天花粉”“化學(xué)成分”“質(zhì)量評價”“天花粉蛋白”“天花粉凝集素”“天花粉多糖”“藥理活性”“檢測方法”“Trichosanthis Radix” “Chemical component” “Quality evaluation” “Trichosanthin” “Trichosanthes kirilowii lection” “Polysaccharides of trichosanthis radix”等為關(guān)鍵詞，組合查詢1980年1月-2018年1月在中國知網(wǎng)、萬方、維普、ScienceDirect、PubMed、Web of Science等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)857篇，其中有效文獻(xiàn)54篇?，F(xiàn)對天花粉化學(xué)成分的藥理活性、提取與檢測方法進(jìn)行綜述，以期為建立天花粉的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 TCS的藥理活性、提取與檢測方法

1.1 藥理活性

TCS是從天花粉中分離得到的一種由19種共247個氨基酸組成的堿性（等電點(diǎn)為9.4）失活蛋白，分子量約27 kD，是僅由肽鏈組成的簡單蛋白，且結(jié)構(gòu)中不含半胱氨酸[4]。TCS是我國醫(yī)藥工作者在20世紀(jì)80～90年代根據(jù)國家計(jì)劃生育基本國策所需從傳統(tǒng)中藥復(fù)方中篩選獲得的具有顯著終止妊娠作用的活性成分，因此其最早應(yīng)用于中期引產(chǎn)，其引產(chǎn)機(jī)制為專一性破壞滋養(yǎng)層細(xì)胞[5]。由于對滋養(yǎng)層細(xì)胞的破壞作用顯著，TCS還被廣泛用于治療惡性葡萄胎、絨毛癌、宮頸癌等與胎盤滋養(yǎng)層相關(guān)的疾病[6]。TCS屬Ⅰ型核糖體失活蛋白，其可水解真核細(xì)胞核糖體的28S rRNA的4324位上的腺苷酸N-C糖苷鍵，使核糖體發(fā)生不可逆失活，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，此特性大大提高了TCS的應(yīng)用范圍，如用于抗腫瘤與抗病毒。TCS對小鼠宮頸癌U14細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人宮頸癌Caski細(xì)胞、人卵巢癌HO8910細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞、人白血病HL-60細(xì)胞、人白血病K562細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、人黑色素瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌SW-620細(xì)胞、結(jié)腸癌CMT-93細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞、食管癌Eca-109細(xì)胞、肝癌H22細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、鼻咽癌CNE2細(xì)胞、小鼠前列腺癌RM-1細(xì)胞、前列腺癌PC3細(xì)胞等均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用[7]。高富紅等[8]對TCS的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)分析，認(rèn)為TCS發(fā)揮抗腫瘤活性除與抑制蛋白合成相關(guān)外，還可通過抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)（增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、激活補(bǔ)體系統(tǒng)、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能）等途徑發(fā)揮作用。研究表明，TCS對多種病毒具有抑制作用，包括乙腦病毒、流感病毒、單純皰疹病毒、柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、麻疹病毒、肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等，其作用機(jī)制包括核糖體失活作用、抑制病毒DNA聚合酶或核酸內(nèi)切酶活性、選擇性殺死病毒感染細(xì)胞、介導(dǎo)趨化因子等[9]。

1.2 提取與純化方法

TCS屬于水溶性堿性蛋白質(zhì)，其提取方法主要采用偏酸性的鹽溶液提取，而純化方法主要有丙酮分級沉淀法和鹽析法[10]。

1.2.1 丙酮分級沉淀法 丙酮分級沉淀法最早由汪猷[4]提出，該法以新鮮栝樓根為原料，經(jīng)去皮、搗碎、榨汁、過濾后，上清液用鹽酸（2 mol/L）調(diào)節(jié)pH至4.0左右，再加入原汁體積0.8倍的丙酮，離心去除沉淀。上清液再加入原體積0.5倍量的丙酮，此次離心所得沉淀經(jīng)蒸餾水溶解并透析后得TCS提取物，得率為0.1%～0.15%。

1.2.2 鹽析法 硫酸銨溶解度大，溶解后可形成大量的銨根正離子和硫酸根離子，可競爭結(jié)合蛋白表面的水分子，破壞其水化膜，降低蛋白溶解度，進(jìn)而聚集沉淀，是鹽析法最常用的無機(jī)鹽之一。孫建忠等[11]用生理鹽水抽提粉碎后的栝樓根塊莖，然后加硫酸銨至濾液中使其濃度至90%，離心收集沉淀經(jīng)凝膠過濾后即可獲得TCS，與結(jié)晶法比較該方法提取周期短，且保持了TCS的活性。馬翠麗等[12]以新鮮栝樓根為原料，經(jīng)去皮、粉碎、榨汁后，第一次向原汁中加入硫酸銨粉末使其濃度達(dá)到40%，沉淀離心后取上清，再加硫酸銨使其濃度達(dá)到75%，離心后得天花粉蛋白粗提物（沉淀）。經(jīng)蒸餾水透析和柱層析純化后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，天花粉蛋白為1條或2條完全分離的條帶，表明該方法簡單、高效。

1.2.3 以干栝樓根為原料的TCS提取與純化方法 TCS最早從新鮮栝樓根中提取，但新鮮栝樓根市場使用量少，且水分含量大不易長期保存，因此近年來研究多以干栝樓根為原料。楊燁等[13]以干栝樓根為原料，粉碎后過篩，用氯化鈉（0.15 mol/L）攪拌過夜提取，過濾，上清液用醋酸鹽緩沖液（0.5 mol/L，pH=2.0）調(diào)節(jié)pH=3.0，離心取上清，再用磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L，pH=7.0）調(diào)節(jié)pH=6.5，然后用30%～85%硫酸銨分級沉淀，85%所得沉淀組分經(jīng)透析、Sepharose CL-6B層析柱純化后得TCS純品（得率為2.2%），SDS-PAGE與PAGE結(jié)果均顯示1條條帶，表明該方法可用于干栝樓根為原料的TCS提取制備。汪苗苗等[14]以干栝樓根為原料，采用硫酸銨分級沉淀法制備TCS粗提物，并進(jìn)一步利用雙水相技術(shù)純化后得到了TCS純品，其優(yōu)選的最佳硫酸銨分級沉淀?xiàng)l件為固液比1 ∶ 12，浸泡時間24 h，溶液pH在5.0左右，最終得率為0.08%。Maraganore JM、Narayanan P等[15-16]采用磷酸鹽緩沖液勻漿提取法，從干栝樓根中提取TCS粗品，利用柱層析或反相高效液相色譜（RP-HPLC）進(jìn)一步純化獲得TCS純品。

與丙酮分級沉淀法比較，鹽析法不使用有機(jī)溶劑，減少了提取過程對人體和環(huán)境的危害，且縮短了制備周期，方法更加簡便，可應(yīng)用于干栝樓根為原料的TCS提取，是比較理想的提取TCS的方法。

1.3 檢測方法

1.3.1 紫外分光光度法 TCS本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，具有蛋白質(zhì)的共性，所以常規(guī)蛋白質(zhì)的檢測方法如凱式定氮法和紫外分光光度法均可用于TCS的定量檢測[17]。根據(jù)顯色劑的不同，紫外分光光度法又可分為雙縮脲法、Folin-酚法、考馬斯亮藍(lán)染色法和二喹啉甲酸（BCA）法等。張波等[18]采用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測了雌雄栝樓根中TCS的含量差異。此外，2015年版《中國藥典》（一部）采用Folin-酚法，以牛血清白蛋白為對照品，用以檢測雷丸中的雷丸素含量作為其質(zhì)量評價指標(biāo)，為中藥蛋白質(zhì)類成分的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)方法提供了借鑒[1]。但此類檢測方法缺乏專一性，且檢測結(jié)果易受基質(zhì)干擾。

1.3.2 HPLC法 HPLC法是各國藥典應(yīng)用最多的質(zhì)量控制方法，但其多用于小分子化合物的定性定量檢測。對于TCS的定量檢測，李艷萍等[19]以硅膠基TSK- G3000SW凝膠柱為HPLC的固定相，以0.02 mol/L磷酸二氫鈉-0.15 mol/L 氯化鈉 -95%乙醇（45 ∶ 45 ∶ 10，V/V/V）為流動相，結(jié)果TCS保留時間為16 min，檢測限為0.625 μg/mL。與紫外分光光度法比較，HPLC法對樣品純度要求較高，因此目前只適用于TCS注射液的檢測，若應(yīng)用于基質(zhì)復(fù)雜的天花粉提取液仍有一定難度。

1.3.3 免疫檢測法 免疫檢測技術(shù)是基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)定性檢測，結(jié)合抗原抗體標(biāo)記技術(shù)而實(shí)現(xiàn)定量檢測的技術(shù)，在中藥質(zhì)量安全性和有效性快速評價中應(yīng)用廣泛[20]。TCS是大分子化合物，對于實(shí)驗(yàn)動物（小鼠、兔、羊等）來說是免疫原性較強(qiáng)的異源蛋白，因此很容易致敏動物從而獲得抗血清，或進(jìn)一步利用單克隆抗體技術(shù)制備單克隆抗體[21-23]。利用放射性同位素或酶標(biāo)記抗體后，通過檢測放射性信號或酶促反應(yīng)信號即可實(shí)現(xiàn)TCS的定量檢測。馬恒東等[24]以放射性同位素125I標(biāo)記TCS，采用雙抗體法進(jìn)行牛奶中TCS的放射性免疫分析（RIA），其靈敏度為87.7 pg/管，平均回收率為100.29%。同理，鄭亦輝等[25]也建立了檢測牛奶中TCS的RIA法，其靈敏度為0.3 ng/管。與紫外分光光度法、HPLC法比較，RIA法雖然靈敏度較高，但其存在放射性污染且對實(shí)驗(yàn)室條件要求苛刻，而以酶標(biāo)記代替放射性同位素而發(fā)展起來的免疫檢測方法，也稱酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），其能有效避免放射性污染，且具有操作簡單、檢測快速、高通量等優(yōu)勢。馮成強(qiáng)等[26]用TCS純品免疫新西蘭大耳兔后，制備了抗TCS的多克隆抗體，然后建立了定性定量檢測TCS的間接競爭ELISA檢測法，該方法靈敏度為10 ng/mL，并將此法應(yīng)用于天花粉的真?zhèn)舞b別。結(jié)果顯示，新鮮栝樓根和天花粉飲片中均有檢出TCS，而天花粉偽品（王瓜根、湖北栝樓根、木鱉子根、異葉馬瓞兒根等）均未檢出TCS，說明通過ELISA檢測TCS，可用于天花粉的真?zhèn)舞b定。

TCS的定性定量檢測方法較多，與紫外分光光度法、HPLC法、RIA法比較，ELISA具有免疫檢測技術(shù)的高度專一性，且靈敏度高，操作更加簡便，樣品前處理簡單（無需柱層析純化），無有機(jī)溶劑和放射性污染的優(yōu)點(diǎn)，是天花粉中TCS檢測的較為理想的檢測方法。

2 TKL的藥理活性、提取與檢測方法

2.1 藥理活性

TKL是從天花粉中分離得到的一種由兩條肽鏈構(gòu)成的專一結(jié)合半乳糖的蛋白質(zhì)，其分子量約為60 kD，等電點(diǎn)約為5.5，結(jié)構(gòu)中有一個疏水微區(qū)，無金屬離子結(jié)合部位[27]。TKL被認(rèn)為是天花粉降糖作用的主要活性成分。李瓊等[28]以鹽酸二甲雙胍為陽性對照，將TKL分為低、中、高（0.3、0.6、0.9 g/kg）3個劑量分別灌胃鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠，3周后結(jié)果顯示，TKL可顯著改善糖尿病大鼠的血糖異常，增強(qiáng)大鼠抗氧化能力。其后又研究了TKL對自發(fā)性2型KK-Ay糖尿病小鼠血糖、血脂的影響，結(jié)果表明，TKL對KK-Ay糖尿病小鼠的血糖、血脂水平均有顯著的調(diào)節(jié)作用，TKL可促進(jìn)糖、脂代謝良性循環(huán)[29]。此外，TKL還可降低補(bǔ)體溶血[30]。

2.2 提取與檢測方法

同TCS一樣，TKL屬于蛋白質(zhì)類成分，提取與檢測方法類似。目前已報(bào)道的TKL的提取方法以無機(jī)鹽溶液浸提-硫酸銨分級沉淀法純化為主。李瓊等[31]采用磷酸鹽緩沖液浸提天花粉中的TKL，通過硫酸銨分級沉淀和蒸餾水透析純化后，利用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測TKL含量，并利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了以磷酸鹽緩沖液提取TKL的最佳工藝，最終確定料液比為1 ∶ 30 （g/mL），提取時間為24 h，緩沖液pH為7.2，硫酸銨飽和度為70%，結(jié)果表明由優(yōu)化工藝提取得到的TKL降糖活性較好。

3 天花粉多糖的藥理活性、提取與檢測方法

天花粉多糖是從天花粉中分離得到的一種多糖類成分，但由于分離純化的方法不同、檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)品不同，導(dǎo)致測定的相對分子量（Mr）及其單糖組成存在差異。黃曉蘭等[32]利用超聲波振蕩提取、乙醇沉淀制備天花粉粗多糖，然后用重結(jié)晶、色譜柱純化獲得精制天花粉多糖，分別利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、HPLC和凝膠滲透色譜（GPC）分析了天花粉多糖的單糖組成及其Mr。結(jié)果顯示，天花粉粗多糖及精制后的多糖均是由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖組成的雜多糖，且GPC顯示粗多糖和多糖均有2個有效峰，但其Mr存在差異：粗多糖的Mr分別為181 000和1 460，而精制天花粉多糖的Mr分別為160 000和4 554。屠婕紅等[33]經(jīng)水提醇沉提取及多步柱純化后精制的天花粉活性多糖RTPS-1的Mr為17 555，且經(jīng)GC、GPC、紅外光譜、核磁共振分析確定其是由葡萄糖組成的均多糖。許林琴等[34]通過高效凝膠滲透色譜法研究了天花粉多糖的Mr，結(jié)果表明，天花粉多糖的重均Mr在7 555～15 423之間。

3.1 藥理活性

3.1.1 免疫增強(qiáng)活性 徐水凌等[35]采用噻唑藍(lán)（MTT）法測定了不同濃度天花粉多糖的促人外周血單個核細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖作用，結(jié)果表明，天花粉多糖具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，可促進(jìn)人外周血單個核細(xì)胞淋巴細(xì)胞的增殖和活化作用，上調(diào)T細(xì)胞含量，并誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞淋巴細(xì)胞高水平分泌腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6。

3.1.2 抗腫瘤活性 曹麗莉等[36]在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的天花粉多糖（0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L），并采用MTT法觀察MCF-7細(xì)胞的生長情況。結(jié)果證實(shí)，10 μmol/L以上的天花粉多糖培養(yǎng)2 d即可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，凋亡率為27.6%。趙桂珠等[37]用添加了不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mmol/L）天花粉多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞3 d，結(jié)果表明，5.0 mmol/L以上的天花粉多糖僅培養(yǎng)1 d即可有效抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長，抑制率分別為53.1%、29.0%。

3.1.3 降糖活性 Hikino H等[38]從天花粉中分離得到了5種多糖類成分，即Trichosans A、B、C、D、E，這5種多糖在正常大鼠中均可表現(xiàn)出降糖活性，其中Trichosans A可顯著降低四氧嘧啶引起的糖尿病模型大鼠血糖濃度，且經(jīng)檢測Trichosans A的組成為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖（摩爾比0.8 ∶ 2.0 ∶ 0.4 ∶ 1.0 ∶ 0.2 ∶ 0.3），與黃曉蘭等[32]的研究結(jié)果相似。

3.2 提取與檢測方法

天花粉多糖的提取方法總體上以水提醇沉法為主，其中水提方法包括回流提取[39]、超聲提取[40-41]、微波提取[42]等，醇沉方法均為添加乙醇使提取液中乙醇濃度達(dá)到80%，多糖即可析出。為消除天花粉中脂溶性成分、單糖、低聚糖、苷類成分對多糖提取的影響，研究者使用石油醚、乙醚和80%乙醇加熱回流處理后再進(jìn)一步提取多糖[39，41]。黃曉蘭等[40]優(yōu)選的天花粉多糖超聲波振動提取條件為溫度45 ℃、料液比1 ∶ 5 （g/mL）、提取時間2 h。譚志燦等[41]采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選的天花粉多糖超聲提取最佳條件為溫度52 ℃、料液比1 ∶ 16（g/mL）、超聲提取2次、每次71 min，多糖提取率可達(dá)4.36%。微波具有極強(qiáng)穿透力，可用于細(xì)胞破壁，提高提取率。王莉等[42]采用微波技術(shù)提取天花粉中多糖，整個提取過程約40 min，且多糖提取率由回流提取法的0.84%提高到18.30%。與水提醇沉法比較，纖維素酶法具有設(shè)備需求簡單、提取率高、成本低、適于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。牛憲立等[43]優(yōu)選了纖維素酶法提取天花粉多糖的最佳工藝為溫度60 ℃、pH 5.0、酶用量0.2%、提取時間1.5 h，天花粉多糖得率為5.48%。

目前天花粉多糖的含量測定方法大多采用糠醛縮合顯色-紫外分光光度法（或苯酚-硫酸分光光度法或蒽酮-硫酸分光光度法）[39-43]，在2015年版《中國藥典》（一部）中廣泛應(yīng)用于玉竹多糖、靈芝多糖、昆布多糖、金櫻子多糖、枸杞多糖、鐵皮石斛多糖、海藻多糖和黃精多糖等中藥多糖成分的含量測定[1]。

4 天花粉中總皂苷的藥理活性、提取與檢測方法

4.1 藥理活性

陳穎等[44-45]以熊果酸為對照品，以香草醛-冰醋酸為顯色劑，采用紫外分光光度法測定了天花粉中總皂苷含量，結(jié)果表明天花粉約含有1.9%～2.4%的總皂苷，且皂苷類成分表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化活性[46]。李曉芳等[47]從天花粉中分離純化了1個四環(huán)三萜類化合物，進(jìn)一步藥理實(shí)驗(yàn)表明，該化合物對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠表現(xiàn)出顯著的降糖作用。此外，陳穎等[48]研究發(fā)現(xiàn)，天花粉皂苷對缺血性腦血管疾病具有較好的治療作用。

4.2 提取與檢測方法

天花粉總皂苷的提取方法有2種，即乙醇超聲提取和乙醇回流提取。陳穎等[44]優(yōu)選的天花粉總皂苷超聲輔助萃取條件為溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時間10 min。黃慶勇等[49]優(yōu)選的回流提取條件為料液比 1 ∶ 15（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、溫度88 ℃、時間120 min。天花粉總皂苷的含量測定方法主要以5%香草醛-冰醋酸和高氯酸為顯色劑的紫外分光光度法為主[45]。

5 瓜氨酸的藥理活性、提取與檢測方法

天花粉中富含多種氨基酸。張波等[50]采用柱前衍生HPLC法檢測了雌、雄栝樓根中的氨基酸含量，結(jié)果表明天花粉中含有17種氨基酸，其中必需氨基酸7種（蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸），非必需氨基酸10種，且雌、雄栝樓根中氨基酸組成比例差異明顯，雄株堿性氨基酸（尤其是精氨酸）含量高于雌株，而酸性氨基酸低于雌株。瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)α-氨基酸，具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力活性，由于瓜氨酸可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)換成精氨酸，因此瓜氨酸還可用于治療精氨酸缺乏引起的系列疾病，如心血管類疾病、糖尿病、代謝性疾病等[51]。2015年版《中國藥典》（一部）采用乙醇超聲提取[1]，茚三酮顯色的薄層色譜法檢測瓜氨酸的有無作為天花粉真?zhèn)舞b定的主要依據(jù)之一。天花粉中瓜氨酸的提取主要以乙醇超聲提取為主，檢測方法則以薄層色譜法和柱前衍生-HPLC法為主。

6 其他成分

除TCS、TKL、天花粉多糖、三萜皂苷和氨基酸外，天花粉中還含有黃酮類成分、葫蘆素B、淀粉以及微量元素。天花粉中黃酮類成分含量極低，以至于汪猷[4]認(rèn)為天花粉中不含黃酮，而楊申明等[52]利用1%氫氧化鈉、三氯化鋁甲醇溶液、鹽酸-鎂粉、濃硫酸等進(jìn)行顯色反應(yīng)定性鑒定天花粉中含黃酮，并利用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定天花粉總黃酮，結(jié)果其平均含量約為0.118 4 mg/g。葫蘆素B是天花粉中的毒性成分，劑量越大毒副反應(yīng)越明顯，可致人出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，其在天花粉偽品中的含量比正品高出1 000倍。彭朝霞等[53]采用超聲提取法提取天花粉并建立了檢測葫蘆素B含量的HPLC法，為天花粉中葫蘆素B的含量檢測提供了參考。天花粉中含有大量淀粉，在其性狀鑒定中亦有“粉性足者佳”的說法。此外，天花粉中還含有大量微量元素，包括鐵、錳、鋅、銅、鈣等[54]。

7 結(jié)語

通過以上對天花粉中化學(xué)成分的藥理活性和提取與檢測方法的系統(tǒng)梳理可知，天花粉中雖然含有多種活性成分，但以TCS、TKL、天花粉多糖三者研究最為廣泛，且TCS是目前研究的熱點(diǎn)；而對于皂苷類成分和黃酮類成分的研究則相對較少，尤其在化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定和藥理活性的篩選方面存在較多空白，有待研究。

以《中國藥典》為標(biāo)準(zhǔn)的中藥質(zhì)量評價方法現(xiàn)階段多以單個、多個或一類具有相關(guān)藥理活性或相對特異性的化學(xué)成分為指標(biāo)，設(shè)置最低含量要求。而天花粉雖然具有顯著的臨床療效和廣泛的臨床應(yīng)用，但其藥典標(biāo)準(zhǔn)中以“水浸出物總量”為質(zhì)量評價指標(biāo)缺乏特異性。通過本文的歸納分析，筆者認(rèn)為TCS的藥理活性最為廣泛、作用機(jī)制較為清晰、提取與檢測方法成熟，且是天花粉中的特異性成分，既可起到藥材真?zhèn)舞b定的作用，又部分反映了天花粉的主要藥理活性，是較為理想的真?zhèn)舞b定及品質(zhì)評價指標(biāo)性成分。因此，筆者建議對于天花粉及其飲片可建立以TCS為指標(biāo)性成分的基于鹽析法提取-ELISA定量檢測的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。

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（收稿日期：2018-03-01 修回日期：2018-05-08）

（編輯：余慶華）