不同品種黨參游離糖成分的氣相色譜-質(zhì)譜研究

李家宇 左之文 王曦璠 陳林 王璽 賀煒 周卿意駿 張水寒

〔摘要〕 目的 運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)黨參Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen及川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的游離糖成分進(jìn)行分析鑒定。方法 采用震蕩提取法從黨參中提取多種游離糖化合物，游離糖成分經(jīng)乙?；罄脷庀嗌V-質(zhì)譜法分析其組成、結(jié)構(gòu)。結(jié)果 通過氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻(xiàn)，鑒別出3種黨參中7種游離糖成分，分別為山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖，游離糖含量存在差異。結(jié)論 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以對(duì)黨參游離糖成分進(jìn)行定性及定量分析，為黨參品質(zhì)分析提供科學(xué)依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 黨參;乙?；?游離糖;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

〔中圖分類號(hào)〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.010

黨參作為一味傳統(tǒng)的名貴中藥材，來源為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根[1]。其味甘性平，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺之功效[2]。主治脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等癥[3]。黨參之名始見于《本草從新》，書中所述的“真黨參”系指產(chǎn)于山西上黨（今山西長治）的五加科人參[4]。隨著五加科人參資源的減少，形似人參的替代品被采用，至清代已將根有獅子盤頭的一類替代藥材獨(dú)立出來作為新的藥材品種，并定名黨參。

黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)一直備受關(guān)注，“味甜者佳”的觀點(diǎn)作為民間判斷黨參質(zhì)量優(yōu)劣的方式，但存在缺陷，如何更加客觀、科學(xué)地評(píng)價(jià)黨參甜度與質(zhì)量的關(guān)系值得研究。通常，“甜味”的強(qiáng)弱用甜度來表示[5]，而甜度與游離糖的含量相關(guān)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）方法具有高分離度、高速度、高靈敏度等特點(diǎn)，已在眾多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[6-8]。因而，本文采用GC-MS分析方法對(duì)不同品種、不同產(chǎn)地黨參中的游離糖成分進(jìn)行了快速測(cè)定和比較，以期為黨參品種甄別和品質(zhì)分析提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1? 材料與試劑

甲醇（德國Merck公司）、乙酸（美國Tedia公司）為色譜純;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水采用重蒸純凈水（華潤怡寶飲料長沙有限公司）。單糖標(biāo)準(zhǔn)品：D-木糖、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、核糖醇、L-阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、D-甘露糖、肌醇、甘露醇、D-山梨醇、蔗糖、半葡胺標(biāo)準(zhǔn)品（長沙錦農(nóng)生物科技有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)所采用的24批黨參藥材（見表1）分別采集自山西省晉城市、甘肅省文縣、湖北省恩施縣及四川省甘孜州等地，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院湖南中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，分別為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.的干燥根、素花黨參 Codonopsis? pilosula? Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen的干燥根、川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，均為2015版《中華人民共和國藥典》所收載的品種。

1.2? 儀器

GC-2014氣相色譜儀（日本島津公司）;NDK200-1氮吹儀（杭州米歐儀器廠）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵（上海貝侖儀器設(shè)備有限公司）;KM-500DB臺(tái)式超聲波清洗器（昆山市美美超聲儀器有限公司）;HC-700高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）;AE240電子天平（瑞士梅特勒-托利多國際有限公司）。

1.3? 氣相色譜檢測(cè)條件

VF-23 ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 毛細(xì)管柱;載氣為高純氦;柱流量1.0 mL/min;分流比45∶1;進(jìn)樣口溫度220 ℃;柱壓73.0 kPa;程序升溫：起始溫度100 ℃，10 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，1 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，30 ℃/min升至220 ℃，保持2 min，0.5 ℃/min升至222 ℃，保持3 min，0.5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

1.4? 質(zhì)譜檢測(cè)條件

電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度220 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍45～550 m/z。

1.5? 標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液的制備

1.5.1? 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備? 精密稱取5.0 mg核糖醇標(biāo)準(zhǔn)品，溶于50.0 mL二甲亞砜（DMSO）中，定容[9]。配制成0.1 mg/mL的核糖醇-二甲亞砜溶液備用。精密稱取0.1 mg標(biāo)準(zhǔn)品，溶于0.2 mL核糖醇-二甲亞砜溶液（0.1 mg/mL）中。以0.03 mL 1-甲基咪唑?yàn)榇呋瘎?.2 mL乙酸酐為乙?；噭10]，30 ℃水浴，振蕩、攪拌10 min，加1.0 mL蒸餾水，除去過量乙酸酐，終止反應(yīng)。以0.2 mL二氯甲烷萃取2次，合并后用無水硫酸鈉除去殘留水分，過0.22 μm濾膜，備用。

1.5.2? 黨參供試液的制備? 將樣品置于烘箱中干燥至恒重。精密稱取樣品細(xì)粉50.0 mg，置于10.0 mL離心管中。加入1 mL含0.1 mg/mL核糖醇提取液（三氯甲烷∶甲醇∶水=12∶5∶1），4 ℃震蕩過夜。3 000 r/min離心10 min，取上層清液，揮干。復(fù)溶于0.1 mL二甲亞砜中，以0.03 mL 1-甲基咪唑?yàn)榇呋瘎?.2 mL乙酸酐為乙?；噭?，30 ℃水浴，振蕩、攪拌10 min，加1.0 mL蒸餾水終止反應(yīng)。以0.5 mL二氯甲烷萃取2次，將下層有機(jī)層提取、合并后用無水硫酸鈉除去殘留水分，過0.22 μm濾膜，備用。

1.6? 方法學(xué)考察

1.6.1? 精密度試驗(yàn)? 取CT-01號(hào)樣品溶液，按“1.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation， RSD）。

1.6.2? 重復(fù)性試驗(yàn)? 取同一批黨參樣品5份，按“1.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，分別計(jì)算RSD。

1.6.3? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取同一份置于4 ℃冰箱內(nèi)的供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)色譜條件在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)行測(cè)定，分別記錄峰面積，分別計(jì)算RSD。

1.7? GC-MS測(cè)定黨參中的游離糖的含量

按“1.5.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)品供試溶液，以核糖醇標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)試樣，分別進(jìn)樣0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 ？滋L分別計(jì)算核糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及各標(biāo)準(zhǔn)品與核糖醇的相對(duì)校正因子。

按“1.5.2”項(xiàng)下方法制備樣品供試溶液，取2.0 ？滋L供試溶液注入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)。根據(jù)單糖及糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜質(zhì)譜的色譜圖進(jìn)行分辨，對(duì)樣品中的糖類化合物進(jìn)行定量分析。

糖類化合物含量計(jì)算公式：

mi=f×（Ai×ms）/As

mi、ms分別表示待測(cè)糖以及內(nèi)標(biāo)試樣的質(zhì)量，Ai、AS分別表示待測(cè)糖以及內(nèi)標(biāo)試樣的峰面積，f表示待測(cè)糖和內(nèi)標(biāo)的相對(duì)校正因子。

2 結(jié)果

2.1? 黨參游離糖組成及含量

17個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合樣品，經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜分析所得色譜圖見圖1（A），不同黨參的樣品中游離糖衍生物經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜分析所得色譜圖見圖1。

進(jìn)一步利用NIST05庫進(jìn)行搜索與匹配，對(duì)17種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行鑒定，所得結(jié)果如表2所示。其中，內(nèi)標(biāo)核糖醇的標(biāo)準(zhǔn)方程為

ms=2.0×10-7As+7.7×10-3，r=0.999 0

2.2? 方法學(xué)考察

精密度：山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖的RSD分別為0.20%、0.13%、0.16%、0.21%、0.19%、0.22%、0.22%，表明儀器精密度較好。

重復(fù)性：山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖的RSD分別為0.23%、0.17%、0.18%、0.25%、0.23%、0.22%、0.24%，表明方法的重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性：山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖的RSD分別為0.19%、0.15%、0.18%、0.22%、0.21%、0.22%、0.23%，表明供試品溶液在4 ℃條件下，24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3? 不同黨參樣品的游離糖組成及含量分析

對(duì)黨參樣品采用相同的預(yù)處理并對(duì)黨參中的糖及糖醇類成分采用相同分析條件進(jìn)行定量分析，不同品種黨參游離糖組成及含量見表3。黨參主要包括山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖，且這7種糖及糖醇成分的含量在不同黨參中存在差異。

3 討論

研究系首次通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析2015版《中華人民共和國藥典》中收錄的3種黨參游離糖的含量，發(fā)現(xiàn)不同品種的黨參游離糖有相同點(diǎn)及差異性。相同點(diǎn)為不同黨參所含游離糖種類基本相同，均包括山梨糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、肌醇、蔗糖在內(nèi)的6種游離糖。差異性則表現(xiàn)在不同品種黨參游離糖的百分含量有顯著差異性;桔?？浦参稂h參的干燥根中可檢出D-甘露糖，而素花黨參及川黨參的干燥根中未檢出D-甘露糖。D-甘露糖可作為辨別桔?？浦参稂h參的標(biāo)志性單糖成分。3種黨參中最主要的游離糖成分均為果糖和葡萄糖。在對(duì)黨參甜度的貢獻(xiàn)上，果糖對(duì)甜度的影響最大，其次為蔗糖，這兩種糖類成分在黨參中的含量較高，占游離糖成分90%以上，對(duì)黨參的甜味的影響相較于其他糖明顯。山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、肌醇等糖類成分，由于在黨參中的含量較低，對(duì)黨參的甜度影響作用較小。

本研究通過GC-MS分析結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻(xiàn)，在保留時(shí)間、分子式等方面對(duì)黨參游離糖成分進(jìn)行定性及定量分析。建立了一種準(zhǔn)確、快速的中藥黨參游離糖分析方法，此方法可為黨參品質(zhì)分析提供游離糖成分方面的參考，并為黨參干燥加工提供指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：264.

[2] 楊鵬飛，楚世峰，陳乃宏.黨參的藥理學(xué)研究進(jìn)展及其抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（12）：5-10.

[3] 焦紅軍.黨參的藥理作用及其臨床應(yīng)用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2012，25（19）：92-92.

[4] 鄒蔭甲.黨參的本草學(xué)考證[J].中草藥，2000，31（6）：466-467.

[5] BELITZ H D， GROSCH W， SCHIEBERLE P.食品化學(xué)：第3版[M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.

[6] 陳曉水，侯宏衛(wèi)，邊照陽，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2013，34（5）：308-320.

[7] DIMITRA J D， BASIL N Z， MOSCHOS G P， et al. GC-MS analysis of essential oils from some greek aromatic plants and their fungitoxicity on penicillium digitatum[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2000， 48（6）：2576-2581.

[8] LUEDEMANN A， STRASSBURG K， ERBAN A， et al. TagFinder for the quantitative analysis of gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）-based metabolite profiling experiments[J]. Bioinformatics， 2008， 24（5）：732-737.

[9] 高凡茸.黃芪藥材甜味與品質(zhì)關(guān)聯(lián)性研究及黃芪糖譜分析方法的建立[D].太原：山西大學(xué)，2015.

[10] 廖洪梅，戴? 玲，魏曉飛，等.單糖乙酰化條件的優(yōu)化[J].理化檢驗(yàn)·化學(xué)分冊(cè)，2008，44（5）：441-443.