植物抗鎘內(nèi)生細(xì)菌篩選及其對(duì)小麥幼苗耐鎘能力的影響

劉軍生 解修超 羅陽(yáng)蘭 鄧百萬(wàn) 曹乃馨 賈嬌

摘要：【目的】篩選出抗鎘內(nèi)生細(xì)菌，為應(yīng)用植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)修復(fù)鎘污染土壤提供優(yōu)勢(shì)菌株?！痉椒ā繉?duì)秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)內(nèi)優(yōu)勢(shì)植物杠柳（Periploca sepium Bunge）和草木樨（Melilotus suaveolens Ledeb）的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，篩選出具有較高鎘抗性的內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)行16S rDNA序列分析，對(duì)其Cd2+去除率、吲哚乙酸（IAA）活性、鐵載體活性和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶活性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，并利用盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其提高小麥幼苗耐鎘脅迫的能力?！窘Y(jié)果】在800 mg/L Cd2+濃度條件下共分離篩選得到11株抗鎘內(nèi)生細(xì)菌（GS3、CR4、CG7、GR31、GR38、GR42、GR43、GR44、GR45、GR49和GR54），經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，在800 mg/L Cd2+濃度條件下11株內(nèi)生細(xì)菌的Cd2+去除率在14.56%～79.45%，其中GR44的Cd2+去除率最高;7株內(nèi)生細(xì)菌有IAA活性，其中GR44、GR49和CG7的IAA活性較高;11株內(nèi)生細(xì)菌均有鐵載體活性和ACC脫氨酶活性，其中GR44的鐵載體活性最高，GR54的ACC脫氨酶活性最高。小麥盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，GR44能顯著提高小麥幼苗的耐鎘能力（P<0.05）?！窘Y(jié)論】篩選出的抗鎘內(nèi)生細(xì)菌GR44可作為植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)中修復(fù)鎘污染土壤的優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)礦區(qū)復(fù)墾具有一定意義。

關(guān)鍵詞： 抗鎘內(nèi)生細(xì)菌;植物—微生物聯(lián)合修復(fù);生物學(xué)特性;盆栽試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S182? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）12-2379-08

Screening of cadmium-resistant endophytic bacteria and its effect on enhancing cadmium tolerance of wheat seeding

LIU Jun-sheng1，2， XIE Xiu-chao1，2*， LUO Yang-lan1，2， DENG Bai-wan1，2，

CAO Nai-xin1，2， JIA Jiao1，2

（1Shaanxi Provincial Engineering Research Center of Edible & Medicinal Fungi， Shaanxi University of Technology，Hanzhong， Shaanxi? 723001， China; 2School of Biological Science & Engineering， Shaanxi University of Technology，

Hanzhong， Shaanxi? 723001， China）

Abstract：【Objective】In order to provide the dominant strains for the remediation of soil polluted by cadmium via plant-microbe combined remediation system，the cadmium-resistant endophytic bacteria were screened. 【Method】Endophytic bacteria were isolated from Periploca sepium Bunge and Melilotus suaveolens Ledeb in Qinling Mountains lead-zinc tai-ling area，and those with high cadmium-resistant level were screened and identified by analysis of 16S rDNA sequence. The biological characteristics including its removal rate of Cd2+， the activity of indole acetic acid （IAA），siderophore and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid （ACC） deaminase were measured. Potted plant experiment was used to test whe-ther the strains improved the tolerance of wheat seeding to cadmium. 【Result】The results showed that 11 cadmium-resistant endophytic bacteria（GS3，CR4，CG7，GR31，GR38，GR42，GR43，GR44，GR45，GR49 and GR54） were isolated and screened with the condition of 800 mg/L Cd2+ concentration. All the strains were identified as Bacillus sp. Biological chara-cteristics showed that the removal rate of Cd2+ for all 11 endophytic bacteria were in the range of 14.56%-79.45% at 800 mg/L Cd2+ concentration level， and removal rate of Cd2+ for the strain GR44 was the highest. There were 7 strains which had activity of IAA and strain GR44，GR49，CG7 were higher. All the 11 strains contained siderophore activity and ACC deaminase activity. Siderophore activity of GR44 was the highest， and ACC deaminase activity of GR54 was the highest. Wheat potted experiment showed that endophytic bacteria GR44 could significantly improve the tolerance of wheat seedling to cadmium（P<0.05）. 【Conclusion】As the selected cadmium-resistant endophytic bacteria， GR44 can be used as dominant strains for constructing the plant-microbe combined remediation system for soil polluted by cadmium，and has positive significance for reclamation of mining area.

Key words： cadmium resistance endophytic bacteria; plant-microbe combined remediation; biological characteristics; pot experiment

0 引言

【研究意義】秦巴山區(qū)鉛鋅等金屬礦產(chǎn)十分豐富，而鎘作為其伴生礦，持續(xù)的礦山開(kāi)采和金屬冶煉及超標(biāo)排污等導(dǎo)致尾礦及其周邊地區(qū)重金屬鎘污染較嚴(yán)重。近年來(lái)，污染土壤的物理和化學(xué)修復(fù)技術(shù)雖已取得一定成果，但其成本較高、易產(chǎn)生二次污染、修復(fù)不徹底等問(wèn)題較突出（劉菊梅等，2015）。植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)可充分發(fā)揮植物和微生物各自的優(yōu)勢(shì)，提高污染土壤的修復(fù)效率，且該技術(shù)具有安全環(huán)保、方便易行、成本低廉等特點(diǎn)（劉志培和劉雙江，2015）。但由于植物根際微生物受環(huán)境影響大，定殖率低，且與土著菌株存在競(jìng)爭(zhēng)（初龍等，2017），加之部分超富集植物生長(zhǎng)速度慢，生物量?。≒uschenreiter et al.，2001），致使植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用受到限制，而植物內(nèi)生菌（Endophyte）的應(yīng)用將有效解決這一問(wèn)題（Ma et al.，2011）。因此，研究和完善植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，篩選高效微生物菌株，對(duì)增強(qiáng)植物抗鎘能力，提高污染土壤修復(fù)效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物內(nèi)生菌是生活史的部分或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官間隙內(nèi)，并與之建立和諧聯(lián)合關(guān)系的各種不同微生物。這些微生物中部分能分泌植物激素類物質(zhì)吲哚乙酸（IAA）和鐵載體、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶等活性物質(zhì)（Yang et al.，2012），促進(jìn)植物生長(zhǎng)（Glick，2010;Babu and Reddy，2011），從而有利于植物對(duì)重金屬的吸收（Weyens et al.，2009）、積累和轉(zhuǎn)運(yùn)（Glick and Steams，2011;Rajkumar et al.，2012）。植物分泌的糖類、氨基酸、有機(jī)酸和可溶性有機(jī)質(zhì)等可被微生物代謝利用，并促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，從而提高植物—微生物聯(lián)合修復(fù)的效率（劉志培和劉雙江，2015）。內(nèi)生菌可幫助宿主植物提高抗逆性。劉莉華（2013）研究發(fā)現(xiàn)，將抗鎘內(nèi)生細(xì)菌接入龍葵根際可顯著提高龍葵的抗鎘能力，使其生物量明顯增加，長(zhǎng)勢(shì)良好。吳秉奇等（2014）研究表明，龍葵抗鎘內(nèi)生菌接入青葙后可顯著提高青葙的鎘積累量，說(shuō)明部分內(nèi)生細(xì)菌具有多種宿主植物，可在不同宿主間生存并發(fā)揮作用。趙龍飛等（2017）研究認(rèn)為內(nèi)生細(xì)菌能提高小麥的耐鹽脅迫能力，提高小麥抗逆性，并可用于植物—微生物聯(lián)合修復(fù)污染土壤。【本研究切入點(diǎn)】秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)及其周邊土壤由于鎘等重金屬污染導(dǎo)致復(fù)墾困難，農(nóng)作物生長(zhǎng)不良，篩選具有促生能力的抗鎘菌株與大田作物共同構(gòu)建植物—微生物聯(lián)合修復(fù)體系對(duì)尾礦復(fù)墾區(qū)進(jìn)行生產(chǎn)修復(fù)是一條安全環(huán)保且簡(jiǎn)便有效的途徑?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)采集的優(yōu)勢(shì)植物中分離篩選抗鎘內(nèi)生細(xì)菌，研究其Cd2+去除率、IAA活性、鐵載體和ACC脫氨酶活性，并以小麥為盆栽試驗(yàn)對(duì)象，探討不同抗鎘內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鎘脅迫條件下小麥幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為應(yīng)用植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)修復(fù)尾礦復(fù)墾區(qū)鎘污染提供優(yōu)勢(shì)菌株。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 采樣地點(diǎn) 供試的杠柳（Periploca sepium Bunge）和草木樨（Melilotus suaveolens Ledeb）于2017年3月采自陜西省漢中市略陽(yáng)縣（東經(jīng)106?16′，北緯33?34′）。剪取健康植株的根和莖，用自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，24 h內(nèi)分離其內(nèi)生細(xì)菌。

1. 1. 2 主要試劑、儀器 試驗(yàn)用細(xì)菌基因DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余所用試劑均為分析純。試驗(yàn)儀器：EYELA N1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)郎儀器有限公司），SW-CJ-1D型單人超凈工作臺(tái)（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司），YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），UV2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），AA320原子吸收分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）。

1. 1. 3 培養(yǎng)基和鐵載體檢測(cè)液 所用培養(yǎng)基包括牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、DF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基，鐵載體檢測(cè)液為CAS染液。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 抗鎘內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定 將杠柳、草木樨的根和莖用流水沖洗干凈，依次用75%酒精（30 s）、0.1%升汞（8 min）、10%次氯酸鈉溶液（1 min）消毒，并用組織印跡法（董曉輝等，2009）進(jìn)行消毒可靠性檢驗(yàn)。將根和莖分別研磨后稀釋3個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，分別涂布于Cd2+濃度為800 mg/L的固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)72 h，篩選出高鎘抗性內(nèi)生細(xì)菌，菌種于4 ℃冰箱保藏。

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，采用細(xì)菌通用引物1492R（5'-GGTTACCTTGT

TACGACTT-3'）和27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT

CAG-3'）對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50.00 ?L：2×Taq Master Mix 25.00 ?L，10 ?mol/L上、下游引物各2.00 ?L，10 ng/?L模板DNA 1.00 ?L，10×Buffer 5.00 ?L，10 mmol/L dNTP 5.00 ?L，ddH2O補(bǔ)足至50.00 ?L。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果整理后進(jìn)行BLAST比對(duì)，提交NCBI申請(qǐng)并獲得登錄號(hào)，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 2. 2 抗鎘內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)特性研究

1. 2. 2. 1 Cd2+去除率測(cè)定 采用原子吸收分光光度法測(cè)定Cd2+濃度（金忠民等，2015）。將篩選得到的抗鎘內(nèi)生細(xì)菌活化后進(jìn)行去除試驗(yàn)，初始條件設(shè)定為：轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量2%，pH 7.0，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)基初始Cd2+濃度600 mg/L。將培養(yǎng)液10000 r/min離心12 min除去菌體，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜用于測(cè)定Cd2+濃度，以不含菌但含Cd2+的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，去除率按下列公式計(jì)算：

Cd2+去除率（%）=[（C0-C）/C0]×100

式中，C0為Cd2+的初始濃度（mg/L），C為Cd2+的殘留濃度（mg/L）。

1. 2. 2. 2 促生能力分析 產(chǎn)IAA活性菌株的初篩方法參考代金霞等（2017），顏色呈粉紅色者為陽(yáng)性，表示具有IAA活性，顏色越深代表活性越高;不變色者為陰性，表示無(wú)IAA活性。

IAA活性測(cè)定參考姜云等（2015）的Salko-wski比色法，分別測(cè)定菌懸液OD600和離心后上清液OD530，計(jì)算菌懸液OD600為1時(shí)，單位體積菌懸液中細(xì)菌分泌IAA的量。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用分析純的IAA梯度稀釋后，以濃度為橫坐標(biāo)、OD530為縱坐標(biāo)繪制。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算單位體積菌懸液中IAA的含量，并以此值表示菌株的IAA活性。

鐵載體活性測(cè)定參考肖艷紅等（2013）的分光光度計(jì)法，用鐵載體活性單位（Siderophore units，SU）表示鐵載體活性，根據(jù)下列公式計(jì)算菌株鐵載體活性：

SU（%）=[（Ar-As）/Ar]×100

式中，Ar為空白參比值，As為處理參比值。

ACC脫氨酶活性測(cè)定參考劉莉華（2013）、韓坤等（2015）的方法并作部分調(diào)整。用比活力表示ACC脫氨酶活性。

比活力（U/mg）=單位酶活/總蛋白濃度

1. 2. 3 小麥驗(yàn)證試驗(yàn)

1. 2. 3. 1 小麥種子活力測(cè)定 利用TTC法（邊子星等，2017）測(cè)定供試小麥的種子活力。

1. 2. 3. 2 不同濃度Cd2+對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響 將珍珠巖滅菌后，加入含Cd2+的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液使Cd2+的終濃度分別為1、5、10、15、20、25、20和35 mg/kg，設(shè)無(wú)Cd2+的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為空白對(duì)照，拌勻后平衡7 d再用于后續(xù)試驗(yàn)。種子先用25～30 ℃的溫水浸泡10 h，再將種子整齊而均勻地播種在鋪有珍珠巖的發(fā)芽床上，定期進(jìn)行觀察，待小麥生長(zhǎng)15 d后測(cè)其生理指標(biāo)，包括株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重及葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量，其中葉綠素含量采用80%丙酮比色法測(cè)定（袁進(jìn)，2011），可溶性糖含量采用苯酚—濃硫酸法測(cè)定（張志良，2000），可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定（張志良，2000）。

1. 2. 3. 3 不同菌懸液對(duì)鎘脅迫條件下小麥幼苗生長(zhǎng)的影響 通過(guò)抗鎘內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)特性的研究，選擇綜合效果較好的內(nèi)生細(xì)菌作為篩選提高小麥幼苗耐鎘能力的出發(fā)菌株，分別用其菌懸液澆灌小麥，篩選出能提高小麥幼苗耐鎘能力的菌株。以不含菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，以無(wú)菌水為空白，分別將篩選出的內(nèi)生菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于恒溫水平搖床（轉(zhuǎn)速140 r/min，37 ℃）培養(yǎng)36 h后備用。

將珍珠巖置于組培瓶中，加入含Cd2+的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，使珍珠巖中的Cd2+終濃度為10 mg/kg，滅菌后將消毒過(guò)的小麥種子置于組培瓶的沙床上，每瓶10粒種子，3個(gè)重復(fù)，恒溫培養(yǎng)15 d，分別在第5和10 d加入10 mL不同的菌懸液，以無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照，以無(wú)菌水為空白。15 d后測(cè)其生理指標(biāo)，包括株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重及葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖，采用SPSS 24.0進(jìn)行方差分析和數(shù)據(jù)變異分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 抗鎘內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列鑒定結(jié)果

通過(guò)平板培養(yǎng)法篩選出11株在800 mg/L Cd2+濃度培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的內(nèi)生菌（GS3、CR4、CG7、GR31、GR38、GR42、GR43、GR44、GR45、GR49和GR54）。經(jīng)測(cè)序后，提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行序列分析和相似性比較，建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖1），序列登錄號(hào)為MF919463-MF919473。

結(jié)果顯示，篩選出的11株抗鎘內(nèi)生細(xì)菌菌株與芽孢桿菌（Bacillus sp.）中的16S rDNA序列具有99%的相似性，表明這兩種植物在受鎘污染脅迫后其可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)菌群為芽孢桿菌屬。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行樹(shù)分析結(jié)果表明，兩種植物內(nèi)生細(xì)菌間具有一定的親緣關(guān)系。其中編號(hào)為GR和GS的菌株分離自杠柳，編號(hào)為CR4和CG7的菌株分離自草木樨;CR4與GR42聚類在一個(gè)分支，而CG7單獨(dú)聚類于一個(gè)分支，說(shuō)明CR4與杠柳內(nèi)生細(xì)菌的親緣關(guān)系較近，而CG7與其他菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，不同植物中的內(nèi)生菌間有一定的親緣關(guān)系，此結(jié)果可為植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。

2. 2 抗鎘內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)特性

2. 2. 1 Cd2+去除率的測(cè)定結(jié)果 細(xì)菌吸附重金屬離子后，可將其結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)或胞外基質(zhì)上，進(jìn)而降低外部環(huán)境中重金屬離子的濃度。菌株對(duì)重金屬離子的去除率是衡量菌株修復(fù)能力的重要指標(biāo)。篩選到的11株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)Cd2+的去除效果（圖2）表明，Cd2+去除率在14.56%～79.45%，其中有4株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)Cd2+的去除效果較好，去除率均在60.00%以上，分別為GR44（79.45%）>GR42（68.78%）>GR45（64.65%）>GR31（63.24%），說(shuō)明這些內(nèi)生細(xì)菌在高濃度鎘污染環(huán)境中具有修復(fù)潛力。

2. 2. 2 促生能力分析結(jié)果 植物內(nèi)生細(xì)菌能夠分泌IAA促進(jìn)植物根系發(fā)育，因此篩選具有產(chǎn)IAA活性的菌株對(duì)促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)有重要作用。以11株不同抗鎘內(nèi)生細(xì)菌為材料進(jìn)行分泌IAA活性初篩，結(jié)果（表1）顯示，有7株內(nèi)生細(xì)菌具有IAA活性，其中3株為深粉色，2株為粉色，2株為淺粉色，顏色越深，表明IAA活性越高;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=7.9681x+0.8845，R2=0.9955）計(jì)算菌株分泌IAA的含量，發(fā)現(xiàn)這7株內(nèi)生細(xì)菌的IAA活性存在差異，IAA活性在15.71～36.69 mg/L，其中CG7的分泌能力最強(qiáng)，其次是GR49。說(shuō)明CG7和GR49具有較強(qiáng)的促生潛力。

在細(xì)菌的代謝過(guò)程中，鐵元素可作為激活劑和催化基團(tuán)，在酶的作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Miethke and Marahiel，2007），為更好地適應(yīng)環(huán)境，微生物會(huì)合成和分泌一種對(duì)三價(jià)鐵離子具有高螯合力的小分子物質(zhì)——鐵載體，以滿足自身生長(zhǎng)需求（孫萌等，2017）。因此，采用CAS比色法進(jìn)行定量測(cè)定，以SU作為定量指標(biāo)，SU越大代表鐵載體的活性越高。結(jié)果如表1所示，11株抗鎘內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵液中均含有鐵載體，且SU在58.27%～80.10%，活性較高，其中GR44和GR42的SU較高，分別為80.10%和76.74%，且二者對(duì)Cd2+也有較高的去除率，說(shuō)明鐵載體在菌株抗鎘性能方面也可能具有重要作用。有活性的鐵載體可為細(xì)菌和宿主提供生長(zhǎng)發(fā)育所必需的鐵元素，促進(jìn)自身和宿主的生長(zhǎng)。

內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的ACC脫氨酶可抑制植物體內(nèi)乙烯的合成，將乙烯合成前體ACC分解為α-丁酮酸和氨，促進(jìn)自身和宿主植物的生長(zhǎng)（Arshad et al.，2008）。由表1可看出，11株抗鎘內(nèi)生菌均具有ACC脫氨酶活性，活性在0.174～2.435 U/mg，其中GR54活性最高（2.435 U/mg），顯著高于其他菌株（P<0.05，下同），CG7活性次之，為1.798 U/mg。

2. 3 小麥盆栽試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)菌株生物學(xué)特性的分析結(jié)果，選擇綜合效果較好的5株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行盆栽促生試驗(yàn)，初步探究其提高小麥幼苗耐鎘能力的效果。

2. 3. 1 小麥種子活力測(cè)定結(jié)果 TTC法測(cè)定結(jié)果表明，3組平行試驗(yàn)中種子活力在97%～99%，種子活力平均值為98%，可用于盆栽試驗(yàn)。

2. 3. 2 不同濃度Cd2+對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響 小麥在受到逆境脅迫時(shí)其生理指標(biāo)會(huì)發(fā)生不同程度的變化，其變化幅度可反映小麥所受脅迫的強(qiáng)弱。不同濃度Cd2+對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響結(jié)果（表2）表明，隨Cd2+濃度的增加，小麥幼苗的整體生長(zhǎng)狀況呈下降趨勢(shì)，在Cd2+濃度達(dá)5 mg/kg后受到明顯抑制。小麥幼苗的各項(xiàng)生理指標(biāo)在Cd2+濃度為1 mg/kg時(shí)均與空白相比無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），在Cd2+濃度達(dá)5 mg/kg時(shí)，小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重和葉綠素含量均顯著降低，而可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著增加，說(shuō)明5 mg/kg Cd2+濃度已對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，使得小麥幼苗自身的氧化應(yīng)激物質(zhì)含量上升。在Cd2+濃度達(dá)10 mg/kg后，株高、根長(zhǎng)等生理指標(biāo)均較5 mg/kg時(shí)進(jìn)一步顯著下降，說(shuō)明10 mg/kg Cd2+濃度嚴(yán)重阻礙了小麥幼苗的生長(zhǎng)，僅靠小麥自身的防御機(jī)制已不足以維持其幼苗的正常生長(zhǎng)，需要外源輔助措施的幫助。由此可見(jiàn)，高濃度鎘脅迫對(duì)小麥幼苗的各項(xiàng)生理指標(biāo)有顯著影響，嚴(yán)重阻礙了小麥幼苗的生長(zhǎng)。

2. 3. 3 不同菌懸液對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)的影響 由表3可知，與空白組相比，對(duì)照組的株高和鮮重顯著增加，其余生理指標(biāo)無(wú)顯著變化，表明無(wú)菌培養(yǎng)基的添加對(duì)小麥幼苗的耐鎘能力無(wú)顯著影響。與對(duì)照組相比，添加GR44處理的小麥幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)均顯著增加，株高增加43.01%，根長(zhǎng)增加28.77%，鮮重增加19.41%，干重增加42.42%，葉綠素含量增加10.82%，可溶性糖含量增加2.63%，可溶性蛋白含量增加0.72%，整體促進(jìn)效果顯著，具有較大的應(yīng)用潛力。與對(duì)照組相比，添加GR42處理的小麥幼苗的鮮重、可溶性糖和可溶性蛋白含量差異不顯著，其余生理指標(biāo)均有顯著增加;添加GR49處理的小麥幼苗的葉綠素和可溶性蛋白含量差異不顯著;添加GR54處理的小麥幼苗的株高和鮮重差異不顯著;添加CG7處理的小麥幼苗的葉綠素和可溶性蛋白含量差異不顯著，其余生理指標(biāo)均較對(duì)照顯著增加。由此可見(jiàn)，抗鎘內(nèi)生細(xì)菌能通過(guò)提高宿主植物的葉綠素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量以幫助宿主抵抗逆境，從而提高宿主植物的生物量，提高環(huán)境修復(fù)效率。說(shuō)明抗鎘內(nèi)生細(xì)菌可提高小麥幼苗對(duì)鎘的耐受能力。

3 討論

內(nèi)生菌與宿主植物在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，其基因組中會(huì)含有與宿主植物相同或相似的序列，使內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主植物相同活性物質(zhì)的能力，因此部分內(nèi)生菌對(duì)宿主植物具有促生抗逆作用而又不對(duì)宿主造成危害，利用內(nèi)生菌構(gòu)建植物—微生物聯(lián)合修復(fù)體系方便高效，安全環(huán)保，能充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，是一種具有潛力的生物修復(fù)技術(shù)。

植物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自身水分含量，產(chǎn)生可溶性糖、可溶性蛋白等物質(zhì)以提高自身抗逆能力。當(dāng)植物受到鎘污染脅迫時(shí)，自身的抗氧化酶系統(tǒng)能減少植株受到的損害，但當(dāng)污染負(fù)荷指數(shù)過(guò)大、影響植物生長(zhǎng)時(shí)，其生物量和葉綠素含量等生理指標(biāo)會(huì)隨之下降，甚至死亡。本研究發(fā)現(xiàn)小麥幼苗的生物量隨鎘濃度的增加急劇下降，與鄧平香（2016）研究認(rèn)為土壤鎘濃度的增加顯著降低東南景天內(nèi)生細(xì)菌多樣性和生物量，進(jìn)而影響其正常生長(zhǎng)的結(jié)果一致。在一定的Cd2+濃度污染范圍內(nèi)，內(nèi)生細(xì)菌的加入使得植物對(duì)鎘的耐受能力有所提高。江春玉等（2008）將篩選得到的抗鎘菌株接種到含鎘的土壤中，并種植番茄進(jìn)行富集試驗(yàn)，結(jié)果表明，接種過(guò)抗鎘菌株的植株比不接種的植株其有效鎘含量及植株吸收的鎘含量同比增加43.6%和107.8%，說(shuō)明抗鎘細(xì)菌能促進(jìn)番茄對(duì)鎘的吸收，提高番茄的耐鎘能力。本研究結(jié)果與其相似，接種抗鎘內(nèi)生細(xì)菌后，小麥幼苗的耐鎘能力得到顯著提高，可能是與抗鎘內(nèi)生細(xì)菌吸收了部分Cd2+，同時(shí)分泌了促生物質(zhì)有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)抗鎘內(nèi)生細(xì)菌可顯著提高小麥幼苗的葉綠素和可溶性蛋白含量，與劉莉華（2013）對(duì)龍葵接種內(nèi)生細(xì)菌后生物量、葉綠素和可溶性蛋白含量顯著增加的研究結(jié)果一致。曹書(shū)苗（2016）研究發(fā)現(xiàn)密旋鏈霉菌可促進(jìn)籽粒莧在含鎘土壤中的生長(zhǎng)，提高籽粒莧葉片葉綠素和谷胱甘肽（GSH）含量、葉片抗氧化酶活性及根系活力，降低葉片MDA含量，增強(qiáng)籽粒莧對(duì)鎘的耐受性。本研究結(jié)果表明，抗鎘內(nèi)生細(xì)菌增加了小麥幼苗的葉綠素含量，促進(jìn)其生長(zhǎng)，與其研究結(jié)果相似。胥正鋼（2015）發(fā)現(xiàn)從蔞蒿中分離出的抗鎘內(nèi)生細(xì)菌能促進(jìn)蔞蒿在鎘污染環(huán)境下的生長(zhǎng)發(fā)育，提高蔞蒿對(duì)鎘的吸收能力。本研究結(jié)果與之類似，可能與接入內(nèi)生細(xì)菌后根際土壤類型由真菌占多數(shù)型變?yōu)榧?xì)菌占多數(shù)型，使得根際土壤中的微生物數(shù)量明顯增加，土壤中微生物生物量碳和生物量氮的含量有所提高有關(guān)。綜上所述，內(nèi)生細(xì)菌的加入提高了植物對(duì)鎘的耐受和吸收能力，同時(shí)改變植物體內(nèi)部分活性物質(zhì)的含量，提高其抗逆能力，促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生物量的增加。

本研究篩選的11株抗鎘內(nèi)生細(xì)菌均具有較高的鎘抗性，同時(shí)具有一定的促生能力，通過(guò)小麥驗(yàn)證試驗(yàn)篩選到能顯著提高小麥幼苗耐鎘能力的菌株，對(duì)礦區(qū)復(fù)墾具有一定意義?？规k內(nèi)生細(xì)菌的加入使得小麥的株高、根長(zhǎng)等生理指標(biāo)顯著增加，其中以GR44的效果最佳，使小麥各項(xiàng)生理指標(biāo)均顯著增加，小麥長(zhǎng)勢(shì)最好。抗鎘內(nèi)生細(xì)菌能通過(guò)提高宿主植物的葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量來(lái)幫助宿主抵抗逆境，從而提高宿主植物的生物量，提高環(huán)境修復(fù)效率。但本研究中并未測(cè)定組培瓶珍珠巖中剩余的有效態(tài)鎘和總鎘的含量，以及小麥地上部分和地下部分中有效態(tài)鎘和總鎘的含量，因此尚需進(jìn)一步研究小麥耐鎘能力的提升是否與小麥吸收了更多的鎘，使之在體內(nèi)以無(wú)效態(tài)沉積下來(lái)有關(guān)。此外，小麥耐鎘能力增加是否會(huì)使得小麥種子中的鎘含量增加也是需深入研究的問(wèn)題。

4 結(jié)論

本研究分離篩選出11株在800 mg/mL Cd2+濃度下生長(zhǎng)良好的抗鎘內(nèi)生細(xì)菌，均為芽孢桿菌，具有鐵載體和ACC脫氨酶活性，其中7株有產(chǎn)IAA活性，4株的Cd2+去除率在60.00%以上，尤其GR44能顯著提高小麥幼苗的耐鎘能力，可為植物—微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)提供優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)礦區(qū)復(fù)墾具有一定意義。

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