柔肝寶顆粒對肝纖維化模型大鼠相關指標的改善作用研究

高洪燕 白殊同 劉金坤 喻曉雯 馮婧 黃祎

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1625-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.10

摘 要 目的：研究柔肝寶顆粒對肝纖維化模型大鼠相關指標的改善作用，為該制劑的進一步研發(fā)提供實驗依據(jù)。方法：取雄性SD大鼠45只，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽性對照組（扶正化瘀膠囊，給藥劑量為0.4 g/kg）與柔肝寶顆粒高、低劑量組（給藥劑量按生藥計分別為16.8、8.4 g/kg），每組9只。除正常組外，其余各組大鼠皮下注射四氧化碳并給予高脂飼料和15%乙醇溶液喂養(yǎng)12周，以建立肝纖維化模型。造模完成后，給藥組大鼠分別灌胃給予相應藥物，每天1次，連續(xù)給藥12周；正常組、模型組大鼠灌胃給予相應體積的水。采用倒置顯微鏡觀察大鼠肝組織病理學變化；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測大鼠血清中肝功能指標[丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、白蛋白（ALB）]和肝纖維化指標[透明質酸（HA）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、 層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型膠原前體（Ⅲ-PC）]的水平。結果：與模型組比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠肝組織細胞空泡變性現(xiàn)象和纖維化程度均明顯改善，中央靜脈清晰可見，均未見擴張與萎縮，以高劑量組效果更為顯著；血清ALT、AST水平均顯著降低，ALB水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；其保肝作用與陽性對照藥物相當，但在升高ALB方面效果較陽性對照藥物更顯著（P<0.05或P<0.01）；血清HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC水平均有不同程度的下降，以高劑量組效果更為顯著（P<0.05或P<0.01），其延緩肝纖維化進展的作用與陽性對照藥物相當。結論：柔肝寶顆粒具有改善模型大鼠肝功能、延緩肝纖維化進展的作用。

關鍵詞 柔肝寶顆粒；肝功能；肝纖維化；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Rouganbao granules on liver fibrosis of model rats， and to provide experimental evidence for further development of this preparation. METHODS： Totally 45 male SD rats were divided into normal group， model group， positive control group （Fuzheng huayu capsules， 0.4 g/kg） and Rouganbao granules high-dose and low-dose groups （16.8， 8.4 g/kg by crude drug） according to random number table， with 9 rats in each group. Except for normal group， other groups were given CCl4 subcutaneously and high lipid diet+15% ethanol solution for 12 weeks to establish liver fibrosis model. After modeling， medication groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. Normal group and model group were given corresponding volume of water intragastrically. The pathology change of liver tissues of rats was observed by inverted microscope. The levels of liver function indexes （ALT， AST， ALB） and liver fibrosis indexes （HA， Ⅳ-C， LN， Ⅲ-PC） were determined by ELISA. RESULTS： Compared with model group， liver cell vacuolation and liver fibrosis of rats were improved significantly in Rouganbao granule high-dose and low-dose groups； central vein was clearly visible， and no dilation and atrophy were found， especially in high-dose group； the serum levels of ALT and AST were decreased significantly， while the level of ALB was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， of which the protective effect for liver was similar to positive control drug but better in increasing ALB （P<0.05 or P<0.01）； the serum levels of HA， Ⅳ-C， LN and Ⅲ-PC were all decreased in varying degree， especially in high-dose group （P<0.05 or P<0.01）， of which the effect of relieving liver fibrosis was similar to positive control drug. CONCLUSIONS： Rouganbao granules can improve liver function and delay the progression of liver fibrosis in model rats.

KEYWORDS Rouganbao granules； Liver function； Liver fibrosis； Rat

肝纖維化是由于各種慢性肝病引起的持續(xù)或反復的肝實質炎癥壞死破壞了肝臟纖維增生和分解的平衡，從而導致肝內纖維結締組織過度沉積而形成的[1]。肝纖維化在臨床表現(xiàn)為肝臟內纖維結締組織異常增生，是一個動態(tài)過程，如不及時阻斷或逆轉，最終會導致肝硬化甚至肝癌，是我國人群的主要死亡原因之一[1-2]。因此，抗肝纖維化治療具有重要的臨床意義。

祖國醫(yī)學認為，“肝藏血，主疏泄”，肝有主導全身氣血升降、脾胃消化的功能。肝纖維化屬肝癖、鼓脹、黃疸、肝積等范疇，邪毒蘊結肝絡是其病機要點，致病因素包括六淫疫毒、蟲獸外傷、飲食勞倦等外因，以及正氣虧虛、先天不足、內傷七情等內因[3]。肝受邪必將導致血運異常、血滯經脈，而氣為血之帥，氣旺有助于血液運行，因此中醫(yī)治療肝纖維化以祛除邪實、行氣活血為主，扶正補虛為輔[4-7]。

柔肝寶顆粒是由重慶市中醫(yī)院自主研發(fā)的中藥制劑，其處方來源于該院肝病科劉華寶主任中醫(yī)師的經驗方“肝硬化1號方”。臨床實踐發(fā)現(xiàn)，“肝硬化1號方”可改善氣虛血瘀型肝硬化患者的臨床癥狀體征、肝功能指標、肝纖維化程度等，但由于該方以湯劑形式使用，運輸、攜帶不便且穩(wěn)定性不佳，故本課題組將其開發(fā)成方便攜帶、運輸、貯存和服用的中藥復方顆粒劑——柔肝寶顆粒。為考察該方改變劑型后的治療效果，本課題組采用皮下注射四氯化碳（CCl4）聯(lián)合高脂+酒精飲食建立大鼠肝纖維化模型，以初步研究柔肝寶顆粒對模型大鼠肝功能和肝纖維化的改善作用，旨在為該制劑的進一步研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

EVOS-FL型倒置顯微鏡[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Fresco 17型離心機（美國Bio-Rad Laboratories公司）；Synergy HTX型酶標儀（香港Gene Company Limited公司）。

1.2 藥物與試劑

柔肝寶顆粒（重慶市中醫(yī)院藥劑科自制）；扶正化瘀膠囊（陽性對照藥，上海黃海制藥有限責任公司，批準文號：國藥準字Z20020073，批號：160618，規(guī)格：0.3 g/粒）；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、透明質酸（HA）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型膠原前體（Ⅲ-PC）試劑盒均由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；其余試劑均為分析純，水為高壓滅菌水。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，購于重慶市中藥研究所動物實驗中心，生產許可證號：SCXK（渝）2007-0001。

2 方法

2.1 大鼠分組、造模與給藥

取大鼠45只，適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分成正常組、模型組、陽性對照組（扶正化瘀膠囊組）與柔肝寶顆粒高、低劑量組，每組9只。正常組大鼠給予標準飼料和水喂養(yǎng)；其余各組大鼠均皮下注射CCl4（臨用時配制成體積分數(shù)為40%的橄欖油溶液；首次注射5 mL/kg，之后每3天注射3 mL/kg），同時給予80%的玉米面、19.5%的動物油、0.5%的膽固醇組成的飼料以及15%乙醇溶液喂養(yǎng)，連續(xù)造模12周。

造模結束后立即給藥。陽性對照組大鼠給予扶正化瘀膠囊內容物（以水制成質量濃度為0.08 g/mL的藥液）0.4 g/kg（按藥品說明書劑量計算）；柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠分別給予柔肝寶顆粒（以水制成質量濃度為0.85 g/mL的藥液）16.8、8.4 g/kg（按生藥計算），每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥12周。正常組和模型組大鼠灌胃給予相應體積的水。

2.2 大鼠肝組織病理學觀察

給藥結束后，全部大鼠禁食不禁水24 h，然后以10%水合氯醛麻醉大鼠，經腹主動脈采血，并取肝左葉相同部位組織。肝組織采用中性福爾馬林液固定、脫水、石蠟包埋，然后進行切片（厚度5 ?m）、蘇木精-伊紅（HE）染色。在倒置顯微鏡下觀察肝細胞、中央靜脈和纖維組織等情況。

2.3 大鼠血清相關指標檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）進行指標檢測。取“2.2”項下血樣，靜置凝固后取上層血清，按照試劑盒說明書操作，以酶標儀檢測肝功能指標（ALT、AST、ALB）與肝纖維化指標（HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC）。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況

正常組大鼠毛色光亮，活動靈敏，飲食飲水正常，體質量增加較快；模型組及給藥組大鼠均出現(xiàn)毛色暗淡、喜蜷懶動、飲食減少及體質量增加減慢的現(xiàn)象。其中模型組和陽性對照組各死亡大鼠1只。

3.2 柔肝寶顆粒對大鼠肝組織病理學的影響

在倒置顯微鏡下可見，正常組大鼠肝細胞排列整齊，未見組織學異常；中央靜脈清晰可見，未見擴張與萎縮。與正常組比較，模型組大鼠肝組織匯管區(qū)、中央靜脈周圍可見大量彌漫性肝細胞空泡變性（占70%～80%）、較多纖維組織增生（占30%～40%），中央靜脈萎縮或消失。陽性對照組大鼠肝組織匯管區(qū)、中央靜脈周圍可見少量肝細胞水腫（占10%～20%）、部分肝細胞空泡變性（占20%～30%）、部分纖維組織增生（占20%～30%），中央靜脈清晰可見，未見擴張與萎縮。柔肝寶顆粒高劑量組大鼠肝組織匯管區(qū)、中央靜脈周圍可見少量肝細胞水腫（占10%～20%）、部分肝細胞空泡變性（占20%～30%）、少量纖維組織增生（占5%～10%），中央靜脈清晰可見，未見擴張與萎縮。柔肝寶顆粒低劑量組大鼠肝組織匯管區(qū)、中央靜脈周圍可見部分肝細胞水腫（占20%～30%）、部分肝細胞空泡變性（占20%～30%）、部分纖維組織增生（占20%～30%），中央靜脈清晰可見，未見擴張與萎縮。肝組織病理觀察結果顯示，柔肝寶顆粒能減少彌漫性肝細胞空泡變性的產生和纖維組織增生，延緩肝纖維化的進程，以高劑量組作用更為顯著。各組大鼠肝組織病理切片觀察結果見圖1（注：病變部位見箭頭所示之處）。

3.3 柔肝寶顆粒對大鼠血清肝功能指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST水平均顯著升高，ALB水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組大鼠血清中AST水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而ALT、ALB水平差異均無統(tǒng)計學意義；柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠血清中ALT、AST水平均顯著降低，ALB水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠血清中ALB水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），而ALT、AST水平差異均無統(tǒng)計學意義。各組大鼠血清中ALT、AST、ALB水平測定結果見表1。

3.4 柔肝寶顆粒對大鼠血清肝纖維化指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組大鼠血清中HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；柔肝寶顆粒高劑量組大鼠血清中HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；柔肝寶顆粒低劑量組大鼠血清中LN、Ⅲ-PC水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），而HA、Ⅳ-C水平雖有下降但差異無統(tǒng)計學意義。與陽性對照組比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠血清中4個指標水平差異均無統(tǒng)計學意義。各組大鼠血清中HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC水平測定結果見表2。

4 討論

CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型在形態(tài)學和病理學上與人體肝纖維化較為相似，兩者均出現(xiàn)肝組織匯管區(qū)、中央靜脈周圍肝細胞壞死及纖維組織增生，最后形成小結性肝硬化[8]。有研究報道，CC14進入肝臟后經氧化酶作用生成的三氯甲基自由基具有細胞毒性，可使細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應，嚴重損傷細胞；多次注射CC14可造成肝纖維化[9]。乙醇長時間作用也會引起肝纖維化，這是由于促纖維化因子的增多和/或膠原蛋白酶等抑纖維化因子相對不足而導致的酒精性肝纖維化，而高脂飲食亦可加重肝損傷[10]。因此，本課題組采用CCl4皮下注射聯(lián)合高脂+酒精飲食對大鼠進行多因素造模，以考察柔肝寶顆粒對其肝功能和肝纖維化的改善作用。

近年來，治療肝纖維化和肝硬化的中藥類以扶正化瘀膠囊研究較多，自2002年批準上市以來，該藥已廣泛用于臨床治療肝纖維化和肝硬化，療效明確，受到了醫(yī)患認可[11]。因此，本實驗選用扶正化瘀膠囊作為陽性對照藥進行對比研究。

柔肝寶顆粒源于劉華寶主任中藥師的經驗方“肝硬化1號方”，他認為，治療肝病應遵循“土疏泄，蒼氣達，陽和布化，陰氣乃隨，生氣淳化，萬物以榮……”和“木德周行，陽舒陰布，五化宣平，其氣端，其性隨，其用曲直，其化生榮……”之理[12]。柔肝寶顆粒主要由黃芪、柴胡、黃芩、白蒺藜、防風、丹參、郁金、桃仁、仙靈脾、鱉甲、茯苓、白術、當歸、白芍、佛手、知母等18味中藥組方制備而成。該方以黃芪為君藥，具有補肝氣、助肝升之功。柴胡、黃芩、防風、白蒺藜共為臣藥，既可助肝之升，又有監(jiān)肝升太過、升已而降之意；其中柴胡與黃芩相伍，能升清陽、降濁陰，調轉厥陰少陽、燮理陰陽升降之樞機；防風、白蒺藜一升一降，燮理氣機。丹參、郁金、桃仁等化瘀輕劑為佐藥，能強化和絡逐瘀之功效。還有仙靈脾溫肝助肝，鱉甲軟堅散結，茯苓、白術健脾和胃，當歸、白芍補肝養(yǎng)肝，佛手疏肝理氣，知母苦寒以監(jiān)制黃芪之溫，共為佐使之用[13]。

本研究病理學觀察結果顯示，與模型組比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠肝細胞空泡變性現(xiàn)象和肝組織纖維化程度明顯改善，中央靜脈清晰可見，未見擴張與萎縮，以高劑量組效果更為明顯。

當肝臟受到損傷時，肝細胞膜通透性會增強，大量的ALT、AST從細胞內滲出，導致血液中ALT、AST急劇增加，所以ALT和AST的水平能反映肝組織損傷及修復程度；肝細胞是合成蛋白的主要場所，而ALB由肝臟合成，是血清總蛋白的主要蛋白質成分，在維持血液膠體滲透壓、體內代謝物質運輸和營養(yǎng)等方面均起著很重要的作用，當肝細胞受損時其合成蛋白的功能降低，故也常將ALB的水平作為反映肝功能的靈敏指標，并用于協(xié)助診斷肝臟疾病[14]。本實驗結果顯示，與模型組比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠血清中ALT、AST水平均顯著降低，ALB水平均顯著升高，表明柔肝寶顆粒能改善肝功能；與陽性對照藥物（扶正化瘀膠囊）比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠血清中ALB水平均顯著升高，但ALT、AST水平差異均無統(tǒng)計學意義，說明柔肝寶顆粒的保肝作用與扶正化瘀膠囊相當，但在升高ALB方面效果更為顯著。

肝纖維化4項檢查指標包括HA、Ⅳ-C、LN、Ⅲ-PC，其與細胞外基質堆積、膠原交聯(lián)成纖維的過程密切相關，可反映細胞外基質的累積程度，因此臨床常通過檢測血清中這4項指標水平以判斷肝纖維化進展及評價治療效果[15]。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠這4項指標水平均顯著升高，說明造模成功；與模型組比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠這4項指標水平均有不同程度的下降，其中以高劑量組效果更為顯著；與陽性對照組比較，柔肝寶顆粒高、低劑量組大鼠這4項指標水平差異均無統(tǒng)計學意義，表明柔肝寶顆粒延緩肝纖維化進展的作用與扶正化瘀膠囊相當。

柔肝寶顆粒由臨床上已獲得確切療效的“肝硬化1號方”改進劑型而制成，經本研究初步證實，其對肝纖維化模型大鼠具有改善肝功能、延緩肝纖維化進程的作用。這提示該制劑在治療肝纖維化領域具有一定的市場潛力，有待本課題組進一步深入研究。

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（收稿日期：2017-12-14 修回日期：2018-05-08）

（編輯：段思怡）