UPLC法同時測定野菊花中8種活性成分的含量

范帥帥 田偉 王相 高樂 田宇柔 牛麗穎

摘 要 目的：建立同時測定野菊花中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素8種活性成分含量的方法。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18，流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，檢測波長為335 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為1 μL，樣品室溫為8 ℃。結果：新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷和芹菜素進樣量檢測線性范圍分別為0.140～1.680、2.211～26.532、0.178～2.136、0.056～0.672、0.460～5.520、1.260～15.120、2.725～32.700、0.120～0.144 ng（r>0.999 6）；檢測限分別為0.02、0.02、0.02、0.01、0.01、0.01、0.04、0.01 ng，定量限分別為0.06、0.07、0.07、0.03、0.04、0.04、0.13、0.02 ng；精密度、穩(wěn)定性（10 h）、重復性試驗的RSD均<2%（n=6），平均加樣回收率為97.05%～102.04%（RSD為1.03%～1.65%，n=9）。結論：建立的方法分析速度快、靈敏度和分辨率較高、重復性好、結果準確，可用于野菊花中8種活性成分含量的同時測定。

關鍵詞 野菊花；超高效液相色譜法；活性成分；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 8 active components in Dendranthema indicum， such as neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， caffeic acid， isochlorogenic acid C， luteolin， monososide and apigenin. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was set at 335 nm and column temperature was maintained at 35 ℃. The sample size was 1 μL and sample room temperature was 8 ℃. RESULTS： The linear range of neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， caffeic acid， isochlorogenic acid C， luteolin， monososide and apigenin were 0.140-1.680， 2.211-26.532， 0.178-2.136， 0.056-0.672， 0.460-5.520， 1.260-15.120， 2.725-32.700， 0.120-0.144 ng （r>0.999 6）， respectively. The limits of detection were 0.02， 0.02， 0.02， 0.01， 0.01， 0.01， 0.04， 0.01 ng， and the limits of quantitation were 0.06， 0.07， 0.07， 0.03， 0.04， 0.04， 0.13， 0.02 ng， respectively. RSDs of precision， stability （10 h） and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. Average recoveries were 97.05%-102.04%（RSD=1.03%-1.65%， n=9）. CONCLUSIONS： The established method has high analysis speed， high sensitivity， high resolution， good repeatability and accurate results. It can be used for simultaneous determination of 8 active components in D. indicum.

KEYWORDS Dendranthema indicum； UPLC； Active components； Content determination

野菊花是常用的中藥，為菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L .） 的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、瀉火平肝的功效，常用于疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈等癥狀[1]。野菊花主治范圍廣泛，而且兩千多年臨床應用已證實其清熱解毒、瀉火平肝之功甚佳，是野菊花栓、野菊花復方降壓顆粒以及感冒靈顆粒等清熱解毒類中成藥和多種涼茶的主要原料藥材。野菊花主要含有機酸類、黃酮類、萜類等化合物[2-5]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，其清熱解毒的活性成分主要是黃酮和有機酸類化合物[6-7]。黃酮類化合物主要包括蒙花苷、芹菜素、槲皮素、木犀草素等[8]，具有抗炎免疫、保肝、抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)、抗菌等多種藥理作用[9-13]；有機酸類化合物主要包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C等，具有較好的抗炎、抗氧化、抗菌等作用[14]。

目前，對野菊花的質(zhì)量控制主要集中在總黃酮及黃酮類成分的測定[15-16]，而有機酸類成分則只測定了其中綠原酸的含量，2015年版《中國藥典》（一部）[1]中野菊花項下是以蒙花苷作為其質(zhì)量控制指標，指標成分比較單一，不能充分體現(xiàn)野菊花的藥效物質(zhì)基礎，不利于野菊花的質(zhì)量控制。此外，野菊花的入藥方式為水煎液，因此水煎液中所含有的活性成分才是其臨床有效成分。而轉移率作為藥材飲片中活性成分在水提工藝中能否實現(xiàn)預期療效的定量指標，可以反映從藥材飲片入藥到水煎液中活性成分的溶解、解吸和轉移的程度，所以活性成分轉移率的高低就會直接影響其臨床藥效。本試驗采用超高效液相色譜（UPLC）法，以野菊花藥材以及相應的水煎液為分析對象，系統(tǒng)比較了野菊花藥材和水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素8種活性成分的含量差異和轉移率，通過對比研究，明確野菊花藥材和水煎液活性成分之間的量值傳遞關系，為野菊花質(zhì)量標準的完善和臨床應用提供可借鑒的方法和思路。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)，包括四元溶劑管理器、自動進樣樣本管理器、二極管陣列檢測器、高溫柱溫箱、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；BSA224S-CW電子天平（北京賽多利斯有限公司）；JY10001電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-250超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BJH-W200F陶瓷自動中藥煲（廣東天際電器股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

新綠原酸對照品（批號：PY20170220，純度：99.78%）、綠原酸對照品（批號：PY20170216，純度：99.96%）、隱綠原酸對照品（批號：PY20170224，純度：99.79%）、異綠原酸C對照品（批號：PY20170303，純度：91.88%）均購自南京普怡生物科技有限公司；蒙花苷對照品（批號：111528-201509，純度：97.50%）、咖啡酸對照品（批號：110885-200102，純度：100.00%）、木犀草苷對照品（批號：11720-201106，純度：99.30%）、芹菜素對照品（批號：111901-201102，純度：99.60%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

10批野菊花藥材均由神威藥業(yè)集團有限公司提供，經(jīng)河北省藥品檢驗院的孫寶惠主任中藥師鑒定為菊科植物野菊的干燥頭狀花序，藥材信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，10%→13%B；3～8 min，13%B；8～12 min，13%→15%B；12～15 min，15%→30%B；15～17 min，30%B；17～19.5 min，30%→70%B；19.5～21 min，70%B；21～21.1 min，70%→10%B；21.1～25 min，10%B）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：335 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL；樣品室溫：8 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素對照品1.86、2.01、1.11、2.25、1.40、1.84、5.45、1.35 mg，分別置于2、2、1、2、2、2、50、10 mL量瓶中，加75%甲醇使溶解并定容，搖勻，制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素質(zhì)量濃度分別為0.93、1.01、1.11、1.13、0.70、0.92、0.11、0.14 mg/mL的單一對照品溶液。再分別取上述單一對照品溶液各15、220、16、5、180、50、2 500、9 μL，置于同一10 mL量瓶中，加75%甲醇使溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.2 野菊花水煎液 稱取野菊花飲片100 g，煎煮2次，一煎加水12倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min，120目篩網(wǎng)趁熱過濾；二煎加水10倍，武火煮沸，文火保持微沸15 min，120目篩網(wǎng)趁熱過濾并適當壓榨藥渣。合并2次煎液，迅速冷卻，50 ℃真空減壓濃縮定容至500 mL，即得質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的野菊花原藥材溶液。

2.2.3 供試品溶液 ①取野菊花原藥材溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，靜置20 min，分出上清液，即得野菊花水煎液供試品溶液。②取野菊花原藥材粉末（過三號篩）約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，稱質(zhì)量，加75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，即得野菊花藥材供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液和供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，待測指標成分新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素色譜峰與相鄰峰均都能達到基線分離且分離度良好，峰形對稱，理論板數(shù)按蒙花苷峰及綠原酸峰計分別不低于12 000、10 000。對照品和供試品色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 μL，按“2.1”項下色譜條件測定。以進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。結果，8個被測化合物在各自標準曲線范圍內(nèi)線性關系良好，見表2。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄各峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限。結果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素的檢測限分別為0.02、0.02、0.02、0.01、0.01、0.01、0.04、0.01 ng，定量限分別為0.06、0.07、0.07、0.03、0.04、0.04、0.13、0.02 ng。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素峰面積的RSD，結果分別為1.41%、1.19%、1.21%、1.55%、1.21%、1.20%、1.13、1.35%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取野菊花水煎液（批號：1609151）適量，6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，記錄峰面積，計算含量。結果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素平均含量的RSD分別為1.63%、1.39%、1.49%、1.05%、1.19%、0.84%、1.21%、1.56%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份野菊花水煎液（批號：1609151），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、1、2、3、4、10 h，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素峰面積的RSD，結果分別為1.45%、0.65%、0.82%、1.22%、1.07%、1.60%、0.56%、1.56%（n=6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的野菊花水煎液（批號：1609151）9份，每份0.5 mL，分別按樣品中目標成分含量的80%、100%、120% 加入各對照品貯備液，每個水平平行測定3份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。分別計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素的平均回收率，各成分的平均加樣回收率依次為101.51、97.05、98.60、101.45、97.84、100.67、99.86、102.04，RSD依次為1.48%、1.65%、1.32%、1.09%、1.22%、1.57%、1.25%、1.03%（n=9），表明本方法的準確度良好。

2.10 含量測定及轉移率

取不同批號野菊花藥材0.1 g和相應野菊花水煎液1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，測定各待測成分的含量和轉移率，結果見表3、表4、表5。表5中的轉移率（%）=W/M×100%，其中W表示煎液中成分的量（mg），M表示飲片中成分的量（mg）。

3 討論

3.1 分析對象的選擇

目前對野菊花的質(zhì)量研究比較單一，都是對其藥材進行含量測定，但實際的應用過程中主要是野菊花水煎液，因此本研究以水煎液與藥材為分析對象，通過含量測定和轉移率來作對比研究，探究臨床應用的煎煮方法對野菊花活性成分的提取效果，發(fā)現(xiàn)野菊花中有機酸類成分在水煎液中的轉移率較高，黃酮類成分次之，說明從藥材到水煎液的過程中，多種活性成分可以被有效提取出來，揭示了傳統(tǒng)用藥的科學性，為評價野菊花水煎液物質(zhì)基礎提供參考依據(jù)。

3.2 指標成分的選擇

野菊花中不僅含有以蒙花苷為代表的黃酮類化合物，而且含有以綠原酸為代表的有機酸類成分[17-21]，藥材和水煎液中有機酸的總量高于黃酮類，而且研究表明有機酸類活性成分有很強的藥理活性，是野菊花中不可或缺的成分，但在含量測定中有機酸類都沒有質(zhì)量控制。野菊花本身含有的活性成分比較多，僅僅測定其中黃酮類成分作為其質(zhì)量優(yōu)劣評價的好壞，顯然是不適合的，難以完整地反映野菊花化學組分特征，也不符合野菊花的臨床療效。因此本試驗采用UPLC法，快速、準確地對野菊花藥材和水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素8種活性成分進行同時測定，克服了單一成分信息量不全的缺點，可以更加全面可靠地來控制野菊花藥材的質(zhì)量，為野菊花的質(zhì)量標準和臨床用藥提供科學的數(shù)據(jù)和多角度的研究思路。

3.3 色譜條件的選擇

大多數(shù)對野菊花的分析研究依然是選擇傳統(tǒng)的HPLC，本法采用UPLC，較普通HPLC方法節(jié)約了時間，溶劑的消耗更少；應用PDA全波長掃描的方式，考察了不同波長下的色譜情況，結果在335 nm下得到的色譜圖譜峰信息最多，多種化合物可以同時定量測量；同時，利用其較低的樣品溫度來檢測有機酸中不太穩(wěn)定的活性成分，使對野菊花的質(zhì)量控制更加精準科學。

3.4 測定結果分析

含量測定結果表明，不同產(chǎn)地的野菊花藥材和水煎液中各成分含量差異較大，即使是同一產(chǎn)地的質(zhì)量也參差不齊。因此，在選擇野菊花的時候，應最大限度地控制產(chǎn)地，固定道地產(chǎn)區(qū)，這樣才能從源頭控制其質(zhì)量。大多數(shù)產(chǎn)地中新綠原酸、隱綠原酸和咖啡酸的轉移率超過100%，相比冷浸醇提工藝，可能是在水煎煮的過程中，有機酸互相轉化或者受熱分解而得到。

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（收稿日期：2018-03-28 修回日期：2018-06-05）

（編輯：余慶華）