Box—Behnken設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法優(yōu)化山楂的醇沉工藝

萬丹娜 饒倩如 俞夢瑩 劉榮華 權(quán)赫秀 楊明 邵峰

摘 要 目的：優(yōu)化山楂的醇沉工藝，為含山楂制劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供參考。方法：通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)考察攪拌速度、加醇速度、醇沉?xí)r間、加入乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇料比、醇沉前濃縮液密度和靜置溫度等工藝參數(shù)對(duì)山楂總黃酮保留率的影響，然后采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：山楂醇沉關(guān)鍵工藝參數(shù)最優(yōu)值為醇沉前濃縮液密度1.04 g/mL、醇料比2.86 ∶ 1（mL/g）、攪拌速度185 r/min。經(jīng)驗(yàn)證，最優(yōu)工藝參數(shù)下山楂總黃酮平均保留率為89.74%（n=3），與預(yù)測值91.40%的相對(duì)誤差為1.85%。結(jié)論：運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化了山楂的醇沉工藝，該法簡單、可行。

關(guān)鍵詞 山楂；醇沉工藝；總黃酮；Plackett -Burman設(shè)計(jì)；Box-Behnken響應(yīng)面法

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the ethanol precipitation technology of Crataegus pinnatifida and provide reference for the production process control of C. pinnatifida preparation. METHODS： Plackett-Burman design was used to investigate the effects of technology parameters on retention rate of total flavonoids of C. pinnatifida， such as stirring speed， flow speed of ethanol， ethanol precipitation time， ethanol volume fraction， ethanol-solid ratio， density of concentration liquid before ethanol precipitation and static temperature. Box-Behnken response surface methodology was used to optimize critical technology parameters， and validation test was also conducted. RESULTS： The optimal key parameters for ethanol precipitation technology of C. pinnatifida included density of concentration liquid before ethanol precipitation 1.04 g/mL， ethanol-solid ratio 2.86 ∶ 1（mL/g）， stirring speed 185 r/min. After validation， under the optimal technology parameters， average retention rate of total flavonoids of C. pinnatifida was 89.74%（n=3）， relative error of which to predicted value 91.40% was 1.85%. CONCLUSIONS： Box-Behnken response surface methodology optimize ethanol precipitation technology of C. pinnatifida. It is simple and feasible.

KEYWORDS Crataegus pinnatifida； Ethanol precipitation technology； Total flavonoid； Plackett-Burman design； Box-Behnken response surface methodology

山楂為薔薇科山楂屬植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge var. major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥成熟果實(shí)，味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食健胃、行氣散瘀之功效[1]。山楂含黃酮類、有機(jī)酸類、三萜類及氨基酸類等多種化學(xué)成分[2]，其中黃酮類成分在抗心肌缺血再灌注損傷[3]、降血脂[4]及抗腫瘤[5]等方面均具有顯著的生物活性。益心舒片（丸、顆粒、膠囊）以及銀丹心腦通軟膠囊、荷丹片等含山楂復(fù)方制劑廣泛用于治療冠心病、心絞痛、高血脂等疾病，且上述復(fù)方提取物在制劑生產(chǎn)過程中均采用醇沉除雜技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)在確保療效的同時(shí)減小服用量。然而，目前在醇沉操作過程中長期依賴主觀經(jīng)驗(yàn)，生產(chǎn)企業(yè)按各自對(duì)制劑“制法”的理解進(jìn)行工藝參數(shù)設(shè)定，缺乏科學(xué)系統(tǒng)的研究[6]。

近年來，響應(yīng)面法因其具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測值精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于丹參[7]、黨參[8]、六味地黃方[9]及熱毒寧注射液中金銀花和青蒿（金青）[10]等醇沉除雜工藝優(yōu)化中，并取得了良好的效果。故本研究擬以山楂總黃酮保留率作為考察指標(biāo)，首先通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定攪拌速度、醇料比、醇沉前濃縮液密度等工藝參數(shù)，再運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對(duì)山楂醇沉關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，為含山楂制劑醇沉工藝參數(shù)的科學(xué)設(shè)定提供一定的參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；BT100S型蠕動(dòng)泵（保定弗雷流體科技有限公司）；JJ-3型恒溫電動(dòng)攪拌器（常州國華電器有限公司）；BT 124S型萬分之一電子分析天平、BT 25S型十萬分之一電子分析天平[德國賽多利斯（北京）科技有限公司]。

1.2 藥品與試劑

山楂藥材于2016年10月采自山東沂蒙山區(qū)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉榮華教授鑒定為山里紅的干燥成熟果實(shí)；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100396-200301，純度：98%）購于中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純，水為自制雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 山楂供試品溶液 稱取2.3 kg的山楂藥材，與水按1 ∶ 8的比例回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液并減壓濃縮，得到山楂濃縮液。將山楂濃縮液置于燒杯中，在攪拌的同時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的醇料比勻速加入乙醇溶液，靜置，濾過，得醇沉上清液。取一定量的醇沉上清液減壓旋干，用30%乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中，備用。

2.1.2 蘆丁對(duì)照品溶液 精密稱取蘆丁對(duì)照品4.91 mg，置于10 mL量瓶中，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.491 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 線性關(guān)系考察

2.2.1 總黃酮含量檢測波長的選擇 精密吸取一定量的蘆丁對(duì)照品溶液和山楂供試品溶液于不同10 mL量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，然后加入4%NaOH溶液4.0 mL，最后用30%乙醇定容至刻度，靜置15 min。以相應(yīng)試劑做空白，按文獻(xiàn)方法[11-12]顯色后，于300～800 nm波長下掃描。結(jié)果表明，溶液吸光度在508 nm波長處較大且無干擾，故選擇508 nm為測定總黃酮含量的檢測波長。紫外-可見光譜圖見圖1。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍考察 分別精密吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL蘆丁對(duì)照品溶液于10 mL量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后，采用紫外-可見分光光度計(jì)測定各樣品在508 nm波長處的吸光度。以蘆丁對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=9.430 6x-0.0146（r=0.999 6），蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.014 73～0.044 19 mg/mL。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液0.6 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作測定吸光度，重復(fù)測定6次。結(jié)果，吸光度的RSD為0.106%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性 按照“2.1.1”項(xiàng)方法平行制備6份山楂供試品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作測定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD為1.08%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性 精密吸取山楂供試品溶液適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，考察室溫條件下放置120 min內(nèi)的穩(wěn)定性（每20 min測定1次）。結(jié)果，吸光度的RSD為2.64%（n=7），表明山楂供試品溶液在室溫條件下放置120 min穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加樣回收率 精密稱取已知總黃酮含量的山楂藥材10.0 g，共6份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備山楂供試品溶液。精密吸取一定量的山楂供試品溶液于10 mL量瓶中，分別加入一定量的蘆丁對(duì)照品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作后測定吸光度，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為95.8%，RSD為2.80%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.4 總黃酮含量的測定

取“2.1.1”項(xiàng)下山楂供試品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后，分別測定醇沉前濃縮液和醇沉上清液中總黃酮含量，計(jì)算總黃酮保留率：總黃酮保留率（%）=醇沉上清液中總黃酮含量/醇沉前濃縮液中總黃酮含量×100%。

2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選條件

以總黃酮保留率為考察指標(biāo)，采用Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響醇沉工藝的因素——攪拌速度（A）、加醇速度（B）、醇沉?xí)r間（C）、加入乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）、醇料比（E）、醇沉前濃縮液密度（F）及靜置溫度（G）等進(jìn)行篩選，確定主要影響因素。根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素設(shè)計(jì)高、低兩個(gè)水平，分別以1、-1表示。因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

根據(jù)表2結(jié)果，通過Minitab 17.0軟件對(duì)各因素與總黃酮保留率的關(guān)系進(jìn)行擬合，得到回歸方程為：Y[總黃酮保留率（%）]=75.33+4.73A-2.16B-1.45C-1.23D+4.63E-12.32F-0.73G（R2=0.959 9），模型的P<0.05，表明回歸方程擬合度好且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表3可知，A、E、F 3個(gè)因素對(duì)總黃酮保留率均有顯著影響（P<0.05），影響大小依次為F>A>E，其他因素的影響則不顯著（P>0.05）。故確定攪拌速度、醇料比、醇沉前濃縮液密度3個(gè)因素為山楂醇沉的關(guān)鍵工藝參數(shù)。

2.6 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化關(guān)鍵工藝因素

2.6.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在Plackett-Burman試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，以總黃酮保留率為考察指標(biāo)，運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法進(jìn)一步對(duì)攪拌速度（X1）、醇料比（X2）和醇沉前濃縮液密度（X3）這3個(gè)關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過Design-Expert 8.0軟件得到15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，每個(gè)因素共設(shè)計(jì)高、中、低3個(gè)水平，分別用1、0、-1表示。因素與水平見表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

通過Design-Expert 8.0軟件對(duì)表5結(jié)果進(jìn)行分析，得到各因素與總黃酮保留率（Y，%）之間的回歸擬合方程為：Y=2.04X1+5.67X2-12.19X3-1.94X1X2-0.012X1X3+1.01X2X3-2.08X12-2.08X22-0.90X32+78.15（R2=0.959 9）。由表6可知，該模型的P<0.01，表明回歸方程擬合度好且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型失擬項(xiàng)的P>0.05，說明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾很小。因素X1對(duì)總黃酮保留率具有顯著影響（P<0.05），因素X2、X3對(duì)總黃酮保留率具有極顯著影響（P<0.001），其余各項(xiàng)的影響均不顯著（P>0.05），且X1、X2、X3對(duì)總黃酮保留率的影響均不具有顯著的交互性（P>0.05）。

2.6.2 響應(yīng)面優(yōu)化與結(jié)果驗(yàn)證 采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，得到各因素對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖2。

由圖2A可知，當(dāng)X2一定時(shí)，總黃酮保留率隨著X1的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；同樣，當(dāng)X1一定時(shí)，總黃酮保留率隨著X2的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。由圖2B可知可知，當(dāng)X3一定時(shí)，總黃酮保留率隨著X1的增加呈現(xiàn)出先增加后趨于平緩的趨勢；當(dāng)X1一定時(shí)，總黃酮保留率隨著X3的增加呈現(xiàn)出減小趨勢。由圖2C可知，當(dāng)X2一定時(shí)，總黃酮保留率隨X3的增加呈現(xiàn)出減小的趨勢；當(dāng)X3一定時(shí)，總黃酮保留率隨X2的增加呈現(xiàn)出先增加后趨于平緩的趨勢。通過分析3者的交互作用，發(fā)現(xiàn)因素X1與X2的相互作用對(duì)總黃酮保留率影響最大。

通過Design-Expert 8.0軟件預(yù)測得到最佳醇沉工藝參數(shù)為醇沉前濃縮液密度1.04 g/mL，醇料比2.86 ∶ 1（mL/g），攪拌速度184.49 r/min，總黃酮保留率預(yù)測值為91.40%。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件對(duì)該工藝參數(shù)進(jìn)行修正，即醇沉前濃縮液密度1.04 g/mL，醇料比2.86 ∶ 1（mL/g），攪拌速度185 r/min。按修正后工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總黃酮保留率的平均值為89.74%，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為1.85%，表明該模型優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 討論

醇沉工藝因其具有操作過程簡單、溶劑安全性高和除雜效果好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于中藥制劑的生產(chǎn)中，到目前為止，一些新技術(shù)（如膜分離[13-14]、絮凝[15]、及高速離心[16]等）也未能將其完全取代，醇沉工藝在制劑純化過程中仍有較為廣泛的應(yīng)用。因此，系統(tǒng)地開展醇沉工藝優(yōu)化研究，對(duì)中藥資源高效利用與制劑質(zhì)量提升具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

中藥醇沉過程的控制涉及到攪拌速度、加醇速度、醇沉?xí)r間、加入乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇料比、醇沉前濃縮液密度及靜置溫度等諸多工藝參數(shù)。本研究采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)上述重要醇沉工藝參數(shù)進(jìn)行考察，經(jīng)方差分析確定攪拌速度、醇料比、醇沉前濃縮液密度是山楂醇沉的關(guān)鍵工藝參數(shù)。乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化對(duì)有效成分在上清液中的溶解程度具有重要的作用。另外，在本試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，攪拌速度和醇沉前濃縮液密度均直接影響沉淀物的形態(tài)。而沉淀物的形態(tài)變化與有效成分包裹、損失程度又有著直接的聯(lián)系。為從提取液中盡可能多的得到山楂總黃酮，筆者進(jìn)一步采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)上述3個(gè)山楂醇沉關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，通過驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)測值與預(yù)測值的相對(duì)誤差為1.85%，表明該方法預(yù)測性好、精度高，這為含山楂制劑的醇沉工藝研究提供了一定參考。但是，各復(fù)方制劑中所用藥材和輔料均有差別，其適用性有待進(jìn)一步考察。

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（收稿日期：2018-02-01 修回日期：2018-04-17）

（編輯：林 靜）