HPLC法同時(shí)測(cè)定3種紅景天藥材中5種化學(xué)成分的含量

呂秀梅 范芳芳 文檢 范剛 張靜 張藝

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）18-2515-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.16

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定大花紅景天、狹葉紅景天和長(zhǎng)鞭紅景天藥材中沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸含量的方法，并比較3種紅景天藥材中5種化學(xué)成分的含量差異。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定含量，色譜柱為WondaSil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸溶液（梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL；采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和Tukeys多重比較。結(jié)果：沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.020 48～0.614 4 ?g（r=0.999 7）、0.118～3.54 ?g（r=0.999 5）、0.010 84～0.325 2 ?g（r=0.999 7）、0.008 48～0.254 4 ?g（r=0.999 5）、0.004 1～0.123 ?g（r=0.999 5）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；加樣回收率分別為99.62%～104.92%（RSD=1.68%，n=9）、96.55%～100.69%（RSD=1.67%，n=9）、98.91%～103.39%（RSD=1.48%，n=9）、100.93%～104.98%（RSD=1.37%，n=9）、97.71%～103.89%（RSD=1.99%，n=9）。大花紅景天中沒食子酸、紅景天苷、酪醇和咖啡酸含量均顯著高于長(zhǎng)鞭紅景天，大花紅景天中的紅景天苷、咖啡酸含量均顯著高于狹葉紅景天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01或P<0.001）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便可行、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定大花紅景天、狹葉紅景天和長(zhǎng)鞭紅景天藥材中沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸的含量。3種常見紅景天藥材中的化學(xué)成分含量存在較大差異，大花紅景天中紅景天苷的含量最高。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；單因素方差分析；Tukeys多重比較；紅景天；沒食子酸；紅景天苷；酪醇；咖啡酸；對(duì)香豆酸；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of gallic acid， salidroside， tyrosol， caffeic acid and p-coumaric acid in Rhodiola crenulata， R. kirilowii and R. fastigiata， and to compare the content difference of 5 chemical components in 3 kinds of R. rosea. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on WondaSil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 275 nm， and the column temperature was 25 ℃. Sample size was 10 μL. GraphPad Prism 5.0 software was used for single factor variance analysis and Tukeys multiple comparison of content determination results. RESULTS： The linear ranges of gallic acid， salidroside， tyrosol， caffeic acid and p-coumaric acid were 0.020 48-0.614 4 ?g（r=0.999 7）， 0.118-3.54 ?g（r=0.999 5）， 0.010 84-0.325 2 ?g（r=0.999 7）， 0.008 48-0.254 4 ?g（r=0.999 5） and 0.004 1-0.123 ?g（r=0.999 5）， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 99.62%-104.92%（RSD=1.68%，n=9）， 96.55%-100.69%（RSD=1.67%，n=9）， 98.91%-103.39%（RSD=1.48%，n=9）， 100.93%-104.98%（RSD=1.37%，n=9）， 97.71%-103.89%（RSD=1.99%，n=9）， respectively. The contents of gallic acid， salidroside， tyrosol and caffeic acid in R. crenulata were higher than R. fastigiata； the contents of salidroside and caffeic acid in R. crenulata were significantly higher than R. kirilowii， with statistical significance （P<0.05，P<0.01 or P<0.001）. CONCLUSIONS： The method is simple， feasible and accurate， and can be used for simultaneous determination of gallic acid， salidroside， tyrosol， caffeic acid and p-coumaric acid in R. crenulata， R. kirilowii and R. fastigiata. There was great difference in the contents of chemical components in 3 kinds of common R. rosea， the content of salidroside is the highest in R. crenulata.

KEYWORDS HPLC； Single factor variance analysis； Tukeys multiple comparison； Rhodiola rosea； Gallic acid； Salidroside； Tyrosol； Caffeic acid； p-coumaric acid； Content

紅景天為藏醫(yī)臨床常用藥材，始載于《四部醫(yī)典》[1]，藏語稱為“索羅瑪布”?！毒е楸静荨穂2]中記載：“大株紅景天治瘟病時(shí)疫，清肺熱，治脈病?！庇醒芯勘砻?，紅景天具有抗缺氧、抗衰老、抗氧化等功效[3-7]，其有效活性成分主要為紅景天苷、紅景天素、沒食子酸、酪醇等[8-10]。近年來，隨著紅景天的需求量激增，市場(chǎng)上出現(xiàn)許多近緣品種代用的現(xiàn)象。紅景天及其常用近緣品種雖具有相似的化學(xué)成分，如紅景天苷、酪醇等，但含量存在著差異[11-12]。

2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[13]規(guī)定大花紅景天 [Rhodiola crenulata （Hk. f. et Thoms.） H. Ohba]為基源藥材，2014年版《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》[14]中收載了狹葉紅景天[R. kirilowii （Regel） Maxim]，而長(zhǎng)鞭紅景天[R. fastigiata （Hk. f. et Thoms.） S. H. Fu]野生資源儲(chǔ)量相當(dāng)豐富，且此3種紅景天藥材在四川省草原科學(xué)研究院紅原縣紅景天種植基地均有規(guī)范化種植。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定上述3種紅景天藥材中沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸含量的方法，并對(duì)不同藥材樣品中各成分含量進(jìn)行了比較，以為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030型HPLC儀，包括脫氣單元、泵單元、低壓梯度單元、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器及紫外-可見分光檢測(cè)器（日本島津公司）；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；TDZ5-W型臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；BSA124S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 試劑

沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201204，純度：>98%）、紅景天苷對(duì)照品（批號(hào)：110818-201206，純度：>98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；酪醇對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15080501，純度：>98%）、對(duì)香豆酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15091503，純度：>98%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)：0211-0020，純度：>98%）；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

大花紅景天、狹葉紅景天、長(zhǎng)鞭紅景天藥材樣品各16批，均由本課題組野外實(shí)地采集所得，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定分別為景天科紅景天屬植物大花紅景天[R. crenulata （Hk. f. et Thoms.） H. Ohba]、狹葉紅景天[R. kirilowii （Regel） Maxim]、長(zhǎng)鞭紅景天[R. fastigiata （Hk. f. et Thoms.） S. H. Fu]的根與根莖。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，7% A；10～20 min，7% A→14% A；20～30 min，14% A→15% A；30～50 min，15% A→20% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。在該色譜條件下，各成分峰之間分離度均大于1.5，理論板數(shù)以沒食子酸峰計(jì)應(yīng)不低于4 000，色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別稱取沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸對(duì)照品各適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，分別加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.512、1.180、0.542、0.848、0.205 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述各單一對(duì)照品貯備液2、5、1、0.5、1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸質(zhì)量濃度分別為20.48、118、10.84、8.48、4.1 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25、30 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分的進(jìn)樣量（x，?g）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸峰面積的RSD分別為0.96%、0.44%、1.23%、0.72%、0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸峰面積的RSD分別為1.83%、1.78%、1.89%、1.91%、1.63%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取藥材樣品（編號(hào)：S1）細(xì)粉約0.5 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸平均含量分別為1.393、11.313、1.043、1.194、0.347 mg/g，RSD分別為1.53%、1.61%、1.73%、1.76%、1.95%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的藥材樣品（編號(hào)：S1）細(xì)粉約0.25 g，共9份，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品貯備液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.8 樣品含量測(cè)定

分別取各批藥材樣品細(xì)粉適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4（注：“-”表示含量低于0.001 mg/g）。

采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和Tukeys多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，大花紅景天中的沒食子酸、紅景天苷、酪醇和咖啡酸含量均顯著高于長(zhǎng)鞭紅景天，大花紅景天中的紅景天苷、咖啡酸含量均顯著高于狹葉紅景天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01或P<0.001）；其中，紅景天苷含量大花紅景天>狹葉紅景天>長(zhǎng)鞭紅景天，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.001），詳見圖2（注：“*”為P<0.05，“**”為P<0.01，“***”為P<0.001）。

3 討論

本研究建立了采用HPLC法同時(shí)測(cè)定大花紅景天、狹葉紅景天及長(zhǎng)鞭紅景天藥材中沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸含量的方法，該方法簡(jiǎn)便可行，可為其質(zhì)量控制提供參考。單因素方差分析和Tukeys多重比較結(jié)果顯示，大花紅景天、狹葉紅景天及長(zhǎng)鞭紅景天中5種化學(xué)成分含量存在顯著差異，大花紅景天中沒食子酸、紅景天苷、酪醇和咖啡酸含量均顯著高于長(zhǎng)鞭紅景天，大花紅景天中的紅景天苷、咖啡酸含量均顯著高于狹葉紅景天。

同一品種紅景天藥材不同產(chǎn)地的化學(xué)成分含量也存在較大差異，如四川省甘孜州白玉縣（S28）及德格縣（S29）所產(chǎn)狹葉紅景天中紅景天苷含量明顯高于其他批次，說明產(chǎn)地對(duì)藥材質(zhì)量具有重要影響。另外，長(zhǎng)鞭紅景天中紅景天苷的含量普遍很低，若臨床應(yīng)用中出現(xiàn)品種混用的情況，其療效難以得到保證。

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液等流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相（梯度洗脫）時(shí)的色譜峰分離效果良好，故選擇此流動(dòng)相體系。此外，通過對(duì)不同檢測(cè)波長(zhǎng)（230、275、308、330 nm）、不同柱溫（20、25、30 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同色譜柱（ZORBAX SB-C18、WondaSil C18、CAPCELL PAK C18）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)色譜柱為WondaSil C18，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 mm，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min時(shí)5種成分均能達(dá)到基線分離。

筆者又通過對(duì)不同提取方式（超聲、冷浸、回流）、不同提取時(shí)間（15、30、45 min）、不同提取溶劑（50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、乙醇、70%甲醇溶液、甲醇）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)以70%乙醇溶液超聲處理30 min時(shí)5種成分的提取效果最好。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便可行、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定大花紅景天、狹葉紅景天和長(zhǎng)鞭紅景天藥材中沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸、對(duì)香豆酸的含量。3種常見紅景天藥材中的化學(xué)成分含量存在較大差異，尤以大花紅景天中紅景天苷的含量最高。

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（收稿日期：2018-03-28 修回日期：2018-06-18）

（編輯：陳 宏）