白及種子繁育的研究現(xiàn)狀

陳勛 王艷 劉暢宇 陳婭 劉湘丹 周日寶

中圖分類號 R282.71；Q945.34 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）18-2585-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.30

摘 要 目的：為促進白及種子繁育、解決種苗短缺問題提供參考。方法：以“白及種子”“組織培養(yǎng)”“人工種子”“Bletilla striata seed”“Tissue culture”“Artificial seed”等為關鍵詞，組合檢索1990年8月-2018年1月發(fā)表并收錄于中國知網(wǎng)、萬方、PubMed等數(shù)據(jù)庫的相關文獻，就白及種子特點以及共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)、直播萌發(fā)、人工種子等相關研究情況進行歸納，綜述其繁育研究現(xiàn)狀。結果與結論：共檢索到相關文獻98篇，其中有效文獻53篇。白及種子在自然條件下萌發(fā)率低，且長期采用傳統(tǒng)繁殖（塊莖分割）方式可導致其種性退化，故可通過共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)、直播萌發(fā)、人工種子等人工繁育方式來解決白及種苗短缺等問題。其中，白及種子與真菌的共生萌發(fā)可提高種子的萌發(fā)率并促進其后期的生長發(fā)育，共生真菌包括鐮刀菌、叢赤殼屬真菌、擬莖點霉菌等。非共生萌發(fā)包括固體和液體培養(yǎng)兩種方式，種子萌發(fā)的關鍵在于培養(yǎng)基（以固體培養(yǎng)基為主）、激素（6-芐基胺基嘌呤、萘乙酸等）和其他添加物（馬鈴薯、活性炭等）。非共生萌發(fā)的相關研究較多，但所耗人力、物力大，成本較高，需提前煉苗，且所得種苗生長緩慢。直播萌發(fā)的關鍵在于基質土的配比，具有成本較低、煉苗時間短、耗種量大、易出現(xiàn)大量死苗等特點。白及人工種子可以較低成本大量獲取，但其制作過程煩瑣，難以實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。后續(xù)研究應深入發(fā)掘優(yōu)勢基因品種、加強共生真菌篩選及探討共生真菌協(xié)同作用、完善直播萌發(fā)技術，將共生萌發(fā)與直播萌發(fā)相結合，以進一步提高白及種子的萌發(fā)率。

關鍵詞 白及種子；共生萌發(fā)；非共生萌發(fā)；直播萌發(fā)；人工種子

白及為蘭科植物白及[Bletilla striata （Thunb.）Reichb. f.]的干燥塊莖，具收斂止血、消腫生肌之功效，有止血、抗菌、抗腫瘤、促進傷口愈合、抗纖維化、抗氧化、抗?jié)兊人幚碜饔肹1-2]。白及不僅藥效顯著，近年來也逐漸被應用于日化產(chǎn)品（如化妝品、牙膏、高級陶瓷、染布粘合劑、橡膠生產(chǎn)等）；此外，白及的葉態(tài)優(yōu)美、花型獨特、花大色艷、姿態(tài)秀雅，是一種很好的觀賞植物[3]。隨著白及的不斷開發(fā)及利用，其應用范圍越來越廣，市場需求量亦日益增加，但由于無限制地人工采挖，加之生態(tài)環(huán)境惡化，導致白及野生資源嚴重匱乏，該植物已被列為國家珍稀瀕危品種[4]。市場需求的增加推動了白及種植繁育技術的發(fā)展。白及傳統(tǒng)繁殖采用塊莖分割的方式，生產(chǎn)效率與經(jīng)濟效益較低，且長期無性繁殖也易導致種性退化[5]。因此，為滿足白及的市場需求，迫切需要進行人工栽培。白及果實為蒴果，一個蒴果中含有上萬粒種子，利用白及種子進行有性繁殖，可以解決生產(chǎn)中種苗短缺以及無性繁殖中種性退化等問題[5]。為此，筆者以“白及種子”“組織培養(yǎng)”“人工種子”“Bletilla striata seed”“Tissue culture”“Artificial seed”等為關鍵詞，組合檢索1990年8月-2018年1月發(fā)表并收錄于中國知網(wǎng)、萬方、PubMed等數(shù)據(jù)庫的相關文獻。結果，共檢索得到相關文獻98篇，其中有效文獻53篇。現(xiàn)就白及種子特點（性狀、萌發(fā)條件）以及共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)、直播萌發(fā)、人工種子等相關研究情況進行歸納，綜述白及種子繁育研究的現(xiàn)狀，為促進白及種子繁育、解決種苗短缺問題提供參考。

1 白及種子性狀及萌發(fā)條件

成熟的白及蒴果呈橄欖形，種子為黃色粉末狀，非常細小。種皮由單層細胞組成，側壁加厚，細胞器及原生質均已消失，為一層半透明的死細胞；胚呈橢圓形，未分化，為原胚階段；胚柄退化，無胚乳，具有薄壁細胞大、核較小、細胞液泡化的特點[6]。上述特點導致白及種子在自然條件下萌發(fā)率低（<5%），生長發(fā)育緩慢[7]。此外，白及種子成熟度對種子萌發(fā)影響較大，在培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑能促進種子的萌發(fā)，但高胚齡種子的啟動率和萌發(fā)率均顯著高于低胚齡種子[8]。研究表明，當白及種子胚齡≥20周時采收最好，此時胚已飽滿成熟，有胚率最高，萌發(fā)迅速，萌發(fā)率高[9-10]；5 ℃是白及鮮果的最佳貯存溫度，其采收年限距離播種時間越近，種子越具有活力，長勢也越佳[11-12]。

2 白及種子共生萌發(fā)

共生萌發(fā)是指在人工基質中播種并接種共生真菌，利用真菌共生來促進種子萌發(fā)以獲得幼苗[13]。共生萌發(fā)可提高白及種子的萌發(fā)率，其依靠菌絲侵入破壁，為種子提供了碳源、氮源和氨基酸等生長所需的多種物質，同時還可提供其他一些與促進種子萌發(fā)、幼苗分化有關的次生代謝產(chǎn)物，如激素類、維生素類、抗生素類等物質[14]。

有研究者將白及種子與真菌共培養(yǎng)，使用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)白及種子表面有稀疏菌絲纏繞，萌發(fā)種子呈綠色，種衣被膨大的胚撐裂，且長出胚根，最高萌發(fā)率可達29.7%[15]。李青風[16]通過原生地播種白及種子，收集種子萌發(fā)后長成的幼苗，利用單菌絲團分離法分離得到種子共生真菌共109株，分屬于半知菌門的6個屬，主要優(yōu)勢菌株類群為鐮刀菌、叢赤殼屬真菌和擬莖點霉菌。韋艷梅等[17]采用組織塊培養(yǎng)法從白及根中分離獲得3種蠟殼菌屬真菌和1種膠膜菌屬真菌。陳曉芳等[18]同樣采用組織塊培養(yǎng)法分離得到Epulorhiza sp.和Sebacina sp.菌根真菌，均能夠與萌發(fā)的白及種子形成菌根共生結構，其萌發(fā)率分別比無菌對照組提高了8.61%和18.43%。國外研究者Johnson SR[19]將白及種子與蘭科杓蘭屬植物粉紅杓蘭（Cypripedium acule Ait.）的共生真菌一同播種，發(fā)現(xiàn)有真菌拌播種子的萌發(fā)率達60%以上，幼苗死亡率不到20%，而無真菌拌播種子的萌發(fā)率和幼苗死亡率分別為34%和45%。有研究利用紫箕小菇等4種真菌與白及種子共生萌發(fā)，不僅可提高種子的萌發(fā)率，同時也對后期原球莖的子葉分化、生長及假根形成有顯著的促進作用[20]。由此可見，分離得到的白及共生真菌種類較多，部分共生真菌可提高白及種子的萌發(fā)率，對其后期生長也有一定的促進作用。

3 白及種子非共生萌發(fā)

非共生萌發(fā)是指將種子直接播種在人工培養(yǎng)基上，且無需真菌侵染就可以使種子萌發(fā)，該法可在短期內(nèi)獲得大量的幼小植株，是有效、快速的繁育方法之一[21]。白及種子具有以下優(yōu)點：（1）數(shù)量眾多；（2）貯藏容易，使用方便；（3）蒴果種子容易消毒，污染率低；（4）培養(yǎng)萌發(fā)速度快，生長快速，幼苗健壯，采用非共生萌發(fā)優(yōu)勢明顯[22]。非共生萌發(fā)所用的培養(yǎng)基是促進和維持植物組織生長并由人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）、維生素和水等。根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可將非共生萌發(fā)分為固體和液體培養(yǎng)兩種方式。

3.1 固體培養(yǎng)

目前，大多數(shù)研究者采用固體培養(yǎng)方式進行白及種子萌發(fā)試驗，基礎培養(yǎng)基包括MS或者1/2 MS、Knudson C（KC）、花寶一號、花寶二號等。其中，MS或者1/2 MS培養(yǎng)基具有無機鹽和離子濃度較高、溶液離子平衡較為穩(wěn)定、養(yǎng)分含量及比例適宜等特點，能夠滿足白及種子營養(yǎng)和生理需要，其應用較其他基礎培養(yǎng)基多。此外，根據(jù)研究的需要，可在基礎培養(yǎng)基中添加不同的激素或添加物，以提高白及種子的萌發(fā)率，相關培養(yǎng)基配方及白及種子萌發(fā)率見表1（表中，IBA為吲哚丁酸，6-BA為6-芐基胺基嘌呤，NAA為萘乙酸，TDZ為噻苯隆，ZT為玉米素，GA3為赤霉素）。

固體培養(yǎng)基具有通氣條件好、便于觀察研究的優(yōu)點，但由于白及種子較為細小，撒播時難以保證每粒種子均與培養(yǎng)基充分接觸，可能會造成其在同一條件下生長差異較大；同時，在撒播過程中也容易將種子撒到一起，使得萌發(fā)后瓶內(nèi)幼苗太過緊湊，在后期轉換培養(yǎng)基時易導致幼苗受到傷害[44]。為此，有研究者在1/2 MS基礎培養(yǎng)基中添加了1.0 mg/L NAA，并將白及種子與瓊脂粉按照質量比1 ∶ 3的比例混合均勻后播種，結果發(fā)現(xiàn)，白及種子萌發(fā)速度快，幼苗分散均勻。提示該種方式不僅可減少白及種子培育時的轉接次數(shù)、最大限度降低繁育過程中的污染率，同時還可降低后期轉接過程對白及幼苗的損傷，甚至可以達到一次成苗的效果[45]。

3.2 液體培養(yǎng)

液體培養(yǎng)是一種借助液體培養(yǎng)基進行繁育的方式。液體培養(yǎng)基是指不添加瓊脂且處于液體狀態(tài)的培養(yǎng)基類型。與固體培養(yǎng)基相比，液體培養(yǎng)基能與白及種子充分接觸，種子的萌發(fā)速度更快、活力更強、萌發(fā)率更高，且發(fā)芽速度一致[44，46]。有研究者建立了白及種子液體培養(yǎng)快速繁殖體系，使用添加了激素的液體培養(yǎng)基，在胚萌發(fā)初期起到了一定的促進作用，但在后期出現(xiàn)了不同程度的玻璃化現(xiàn)象，抑制了白及的生長，而未添加激素的MS液體培養(yǎng)基中的白及原球莖長勢最好[47]。張宇思等[48]利用液體/固體培養(yǎng)基對白及種子進行分段培養(yǎng)（即種子萌發(fā)階段在液體培養(yǎng)基中進行，原球莖分化到生根過程則在固體培養(yǎng)基上進行），并篩選了最佳液體培養(yǎng)條件。結果發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)的最佳液體培養(yǎng)條件為1/4 MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+100 g/L馬鈴薯汁，用搖床進行振蕩培養(yǎng)，白及種子萌發(fā)后不易結團；同時該研究還發(fā)現(xiàn)，采用液體/固體分段培養(yǎng)模式可使白及種子從種子萌發(fā)到原球莖分化、生根階段均可充分接觸到營養(yǎng)物質；與全程固體培養(yǎng)比較，分段培養(yǎng)模式加快了種子萌發(fā)和原球莖生長發(fā)育的速度，且白及幼苗葉片寬大肥厚、葉色濃綠。

現(xiàn)有研究提示，白及種子的非共生萌發(fā)主要包含固體和液體培養(yǎng)兩種方式，種子萌發(fā)關鍵在于無菌人工培養(yǎng)基、激素和其他添加物。其中，培養(yǎng)基以固體培養(yǎng)基為主，基礎成分為1/2 MS和MS，添加的激素主要為6-BA、NAA等，添加物包括馬鈴薯、活性炭等。白及種子非共生萌發(fā)的相關研究較多，但培養(yǎng)所耗人力、物力大，成本較高，需提前煉苗，且所得種苗生長緩慢。

4 白及種子直播萌發(fā)

有少量研究探討了白及種子的直播萌發(fā)。研究者將白及種子適當處理后，播種到人工配制的基質土中，后期經(jīng)人工管理，從而提高種子的萌發(fā)率。這種方式可極大程度地降低繁育成本，且所得幼苗具有較強的生存能力和抗逆能力[5，7，49]。有研究者簡化了無菌接種培養(yǎng)流程，將白及種子放在濕毛巾上，置于薄膜下，將溫度控制至20 ℃，促使種子發(fā)芽[49]?；|土的配比是白及種子直播萌發(fā)的關鍵因素之一，將營養(yǎng)土、蛭石、珍珠巖按體積比9 ∶ 1 ∶ 1的比例作為白及種子直播萌發(fā)的基質土，用高錳酸鉀對基質土滅菌，將白及種子與活性炭按體積比1 ∶ 30的比例拌種后撒播，成苗數(shù)可達每平方厘米9棵[5]。?？》宓萚7]選擇樹皮粉、腐殖質、營養(yǎng)土、雞糞和草炭土按體積比15 ∶ 20 ∶ 8 ∶ 1 ∶ 5的比例配成育苗基質土，將白及種子經(jīng)NAA水溶液浸泡后，再拌NAA和滑石粉撒播，控制溫度為20～35 ℃、濕度為60%～80%，并在種子萌發(fā)的不同階段定期噴灑相應的營養(yǎng)液，通過直播萌發(fā)的方式克服白及種子在自然狀態(tài)下難以萌發(fā)的難題，將萌發(fā)率提高至70%。直播萌發(fā)的成本較低，煉苗時間短，但耗種量大，且同時存在易出現(xiàn)大量死苗等現(xiàn)象[4]。

5 白及人工種子

人工種子是人為制造的種子，是含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素以及其他成分的人工膠囊，具有培養(yǎng)基用量少、體積小、繁殖快、發(fā)芽成苗快、運輸及貯存方便的特點，可克服營養(yǎng)繁殖造成的病毒積累，快速繁殖脫毒苗[50]。現(xiàn)有研究指出，白及蒴果中含有大量種子，為人工種子提供了良好的種胚；且白及種子有天然的種皮包被，可實現(xiàn)長期保存[5-6]。白及種子沒有胚乳，自然條件下難以萌發(fā)，若給其加上人工胚乳，就能以較低的成本獲得大量的白及人工種子；但其制作過程煩瑣，難以實現(xiàn)大批量生產(chǎn)[51]。陳娜等[52]在固體MS培養(yǎng)基中將萌發(fā)21 d的單個白及鮮綠色原球莖進行包埋，人工胚乳組分為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+30 g/L馬鈴薯汁，人工種皮組分為3%海藻酸鈉+0.4 mol/L氯化鈣+10 g/L納米二氧化硅，培育后白及種子的萌發(fā)率可達93.1%。該研究還發(fā)現(xiàn)，在胚乳中添加馬鈴薯汁對成苗的影響最為顯著，其形成的試管苗假鱗莖大、葉色深綠、體形健壯。李偉平等[53]在1/2 MS液體培養(yǎng)基中將萌發(fā)10 d后的白及原球莖進行包埋，人工胚乳組分為MS+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L細胞分裂素（KT），人工種皮組分為4.0%海藻酸鈉+0.2 mol/L氯化鈣+0.4 mg/L青霉素+0.3%多菌靈粉劑+0.2%苯甲酸鈉，培育后白及種子的萌發(fā)率可超過95%。

6 結語

綜上所述，白及具有較高的藥用價值和觀賞價值，市場需求量大。白及種子在自然條件下萌發(fā)率低，且長期采用傳統(tǒng)繁殖（塊莖分割）方式可導致其種性退化，故可通過共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)、直播萌發(fā)、人工種子等人工繁育方式來解決白及種苗短缺等問題。其中，白及種子與真菌的共生萌發(fā)可提高種子的萌發(fā)率并促進其后期的生長發(fā)育，共生真菌包括鐮刀菌、叢赤殼屬真菌、擬莖點霉菌等。非共生萌發(fā)是將白及種子直接播種至人工培養(yǎng)基中，且無需真菌侵染，包括固體和液體培養(yǎng)兩種方式，種子萌發(fā)的關鍵在于培養(yǎng)基（以固體培養(yǎng)基為主）、激素（6-BA、NAA等）和其他添加物（馬鈴薯、活性炭等）。非共生萌發(fā)的相關研究較多，但所耗人力、物力大，成本較高，需提前煉苗，且所得種苗生長緩慢。直播萌發(fā)是將白及種子處理后，播種到人工配制的基質土中，通過后期人工調(diào)控來提高種子的萌發(fā)率。該方法的關鍵在于基質土的配比，具有成本較低、煉苗時間短、耗種量大、易出現(xiàn)大量死苗等特點。白及人工種子是含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素及其他成分的人工膠囊，可以較低成本大量獲取，但其制作過程煩瑣，難以實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。

為解決白及種苗短缺問題，滿足市場需求，筆者認為白及種苗繁育還可在以下幾個方面進行深入研究：（1）發(fā)掘白及種子資源中具有優(yōu)勢基因的品種，為白及繁育提供優(yōu)質的種源；（2）加強白及種子萌發(fā)共生真菌的篩選，同時開展白及種子共生萌發(fā)是否需要多種真菌協(xié)同作用的研究；（3）白及直播萌發(fā)的技術還不夠成熟，可在提高直播成苗方面進行深入探討；（4）白及種子共生萌發(fā)能提高種子萌發(fā)率，直播萌發(fā)能增強幼苗的生存能力和環(huán)境適應能力，將兩者相結合可能是白及種子繁育研究的一個新方向。

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（收稿日期：2018-02-03 修回日期：2018-05-30）

（編輯：張元媛）