改進(jìn)HPLC法測定門冬氨酸鳥氨酸原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

陳宇堃 陳華 梁蔚陽

中圖分類號 R927.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）18-2509-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.15

摘 要 目的：改進(jìn)測定門冬氨酸鳥氨酸原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Phenomenex Luna NH2（兩根串聯(lián)），流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 5.6）-乙腈（40 ∶ 60，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為205 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為5.398～26.992 ?g/mL（r=0.999 1）、5.204～26.021 ?g/mL（r=0.999 3）、5.149～25.749 ?g/mL（r=0.999 6）、5.174～25.874 ?g/mL（r=0.999 3）、5.164～25.823 ?g/mL（r=0.999 3）、5.194～25.973 ?g/mL（r=0.999 5）；定量限分別為0.22、0.53、51.50、103.50、0.26、8.31 ng，檢出限分別為0.13、0.26、10.30、20.70、0.13、2.08 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均不超過2%；加樣回收率分別為99.30%～102.31%（RSD=1.02%，n=9）、99.88%～100.89%（RSD=0.37%，n=9）、99.36%～101.53%（RSD=0.70%，n=9）、99.13%～102.65%（RSD=1.15%，n=9）、100.18%～101.45%（RSD=0.38%，n=9）、99.39%～100.81%（RSD=0.58%，n=9）。6批樣品均未檢出馬來酸、琥珀酸和β-門冬氨酰門冬氨酸；3-氨基-2-哌啶酮含量為0.006%～0.056%，蘋果酸含量為0.014%～0.071%，富馬酸含量為0.000 5%～0.003 4%，最大未知雜質(zhì)含量為0.013%～0.110%，未知雜質(zhì)總含量為0.013%～0.120%。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于門冬氨酸鳥氨酸原料藥中有關(guān)物質(zhì)的測定。

關(guān)鍵詞 門冬氨酸鳥氨酸；高效液相色譜法；馬來酸；3-氨基-2-哌啶酮；琥珀酸；蘋果酸；富馬酸；β-門冬氨酰門冬氨酸；有關(guān)物質(zhì)

ABSTRACT OBJECTIVE： To improve the determination method of related substances in ornithine aspartate raw material. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Phenomenex Luna NH2 column （two series- connected） with mobile phase consisted of 0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution （pH 5.6）-acetonitrile （40 ∶ 60， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 205 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of maleic acid， 3-amino-2-piperidinone， succinic acid， malic acid， fumaric acid and β-aspartyl-aspartic acid were 5.398-26.992 ?g/mL（r=0.999 1）， 5.204-26.021 ?g/mL（r=0.999 3）， 5.149-25.749 ?g/mL （r=0.999 6）， 5.174-25.874 ?g/mL（r=0.999 3）， 5.164-25.823 ?g/mL（r=0.999 3）， 5.194-25.973 ?g/mL（r=0.999 5）. The limits of quantitation were 0.22， 0.53， 51.50， 103.50， 0.26 and 8.31 ng； the limits of detection were 0.13， 0.26， 10.30， 20.70， 0.13 and 2.08 ng. RSDs of precision， stability， and reproducibility tests were no more than 2%. The average recoveries were 99.30%-102.31%（RSD=1.02%，n=9）， 99.88%-100.89%（RSD=0.37%，n=9）， 99.36%-101.53%（RSD=0.70%，n=9）， 99.13%-102.65%（RSD=1.15%，n=9）， 100.18%-101.45%（RSD=0.38%，n=9）， 99.39%-100.81%（RSD=0.58%，n=9）. Neither maleic acid， succinic acid and β-aspartyl-aspartic acid were found in 6 batches of samples. The contents of 3-amino-2-piperidinone were 0.006%-0.056%； the contents of malic acid were 0.014%-0.071%； the contents of fumaric acid were 0.000 5%-0.003 4%； the contents of maximal unknown impurity were 0.013%-0.110%； total contents of unknown impurity were 0.013%-0.120%. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and can be used for the determination of the related substances in ornithine aspartate raw material.

KEYWORDS Ornithine aspartate； HPLC； Maleic acid； 3-amino-2-piperidinone； Succinic acid； Malic acid； Fumaric acid； β-aspartyl-aspartic acid； Related substance

門冬氨酸鳥氨酸由德國麥?zhǔn)洗笏帍S于20世紀(jì)60年代研發(fā)成功，其注射液于70年代應(yīng)用于臨床。該藥于1991年收載入《德國藥典》[1]，同時(shí)被美國FDA批準(zhǔn)用于治療肝性腦病[2]。在2014年《美國肝病協(xié)會和歐洲肝病協(xié)會慢性肝炎致肝性腦病實(shí)踐指南》中，門冬氨酸鳥氨酸被推薦用于肝性腦病的治療[3]。谷氨酰胺是氨的解毒產(chǎn)物，也是氨的儲存與運(yùn)輸形式；氨的主要代謝途徑是在肝臟中通過尿素循環(huán)合成尿素而排出體外。在正常生理和病理?xiàng)l件下，尿素及谷氨酰胺的合成會受到鳥氨酸和其他二羧基化合物的影響。門冬氨酸鳥氨酸進(jìn)入血液后可分解為鳥氨酸和門冬氨酸。鳥氨酸可激活尿素合成過程中的鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨基甲酰磷酸合成酶，并通過肝臟中的鳥氨酸循環(huán)來加速尿素合成，促進(jìn)氨的代謝，迅速降低血氨水平，由此可促進(jìn)肝細(xì)胞自身的修復(fù)和再生，從而有效地改善肝功能，以恢復(fù)機(jī)體的能量平衡[4-5]。門冬氨酸可參與肝細(xì)胞內(nèi)核酸的合成，促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)，并可間接參與肝細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)，提供能量代謝的中間產(chǎn)物，從而增強(qiáng)肝臟功能[5]。國外研究發(fā)現(xiàn)，門冬氨酸能夠激活N-甲基-D-門冬氨酸（NMDA）受體，使β-arrestin-2信號分子活性增強(qiáng)，調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）活性，從而減輕肝臟炎性反應(yīng)，改善肝臟炎性病變[6]。近年來研究表明，門冬氨酸鳥氨酸在治療肝性腦病、脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝硬化和藥物性肝損傷等方面均有明顯療效[7]。

2015年版《中國藥典》（二部）采用高效液相色譜法（HPLC），以氨基鍵合硅膠為色譜柱填充劑、0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 5.6）-乙腈（40 ∶ 60，V/V）為流動相對門冬氨酸鳥氨酸原料藥中5種已知雜質(zhì)[馬來酸、富馬酸、精氨酸、3-氨基-2-哌啶酮和門冬氨酸縮合物（β-門冬氨酰門冬氨酸）]進(jìn)行含量測定，并利用自身對照法測定未知雜質(zhì)的含量[8]。筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在該色譜條件下，溶劑峰與馬來酸峰存在重疊情況；精氨酸峰響應(yīng)值較低，靈敏度不高；自身對照溶液的門冬氨酸鳥氨酸質(zhì)量濃度為4 μg/mL，該濃度下鳥氨酸峰響應(yīng)值較低。《美國藥典》（40版）收載的門冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)中除規(guī)定馬來酸和富馬酸的限度分別為0.05%和0.10%外，還規(guī)定了蘋果酸的限度為0.20%[9]；另外，琥珀酸亦為門冬氨酸生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物。因此，有必要對2015年版《中國藥典》（二部）中的色譜條件進(jìn)行改進(jìn)，并增加對蘋果酸、琥珀酸的含量測定。而目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測定門冬氨酸鳥氨酸原料藥中馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸含量的方法。因此，本研究參考2015年版《中國藥典》（二部）門冬氨酸鳥氨酸原料藥中有關(guān)物質(zhì)測定的色譜條件[8]，以兩根氨基色譜柱串聯(lián)的方式，建立了同時(shí)測定門冬氨酸鳥氨酸原料藥中上述6種已知雜質(zhì)含量的方法，以為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

E2695型HPLC儀，包括紫外檢測器、Empower 3數(shù)據(jù)處理軟件等（美國Waters公司）；MS205DU型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；PB-10型pH計(jì)（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

門冬氨酸鳥氨酸原料藥（生產(chǎn)企業(yè)1，批號：17371、17372、17373，純度：99.9%、100.2%、100.1%；生產(chǎn)企業(yè)2，批號：67911、67912、67913，純度：100.0%、100.6%、100.1%）；門冬氨酸鳥氨酸對照品（日本協(xié)和發(fā)酵生化株式會社，批號：163561，純度：99.7%）；3-氨基-2-哌啶酮對照品（東京化成工業(yè)株式會社，批號：P1195896，純度：98.1%）；馬來酸對照品（批號：LKK1196，純度：99.6%）、琥珀酸對照品（批號：LKM6297，純度：99.9%）、蘋果酸對照品（批號：LKH3957，純度：99.9%）、富馬酸對照品（批號：LKL0807，純度：99.8%）均由日本和光純藥工業(yè)株式會社提供；β-門冬氨酰門冬氨酸對照品（上?？戮S化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：DH110298，純度：98.2%）；乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、濃氨溶液均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna NH2（150 mm×4.6 mm，3 μm），兩根串聯(lián)；流動相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（取磷酸二氫鉀2.72 g，加水500 mL溶解，加濃氨溶液5 mL，用水稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.6）-乙腈（40 ∶ 60，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：205 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 稀釋液 以0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（取磷酸二氫鉀2.72 g，加水500 mL溶解，加濃氨溶液5 mL，用水稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.6）-乙腈（60 ∶ 40， V/V）為稀釋液。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用混合對照品溶液 分別精密稱取門冬氨酸鳥氨酸、馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸對照品各適量，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg和馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸各10 μg的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用混合對照品溶液。

2.2.3 混合對照品貯備液 分別精密稱取馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸對照品各適量，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解，制成每1 mL中含馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸各0.5 mg的混合對照品貯備液。

2.2.4 混合對照品溶液 精密量取“2.2.3”項(xiàng)下混合對照品貯備液適量，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液制成每1 mL中含馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸各10 μg的混合對照品溶液。

2.2.5 供試品溶液 精密稱取樣品適量，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的供試品溶液。

2.2.6 對照溶液 精密量取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液適量，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 μg的對照溶液。

2.2.7 陰性對照溶液 以“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液為陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用混合對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，各成分均能達(dá)到基線分離，溶劑、馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、門冬氨酸、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、鳥氨酸、β-門冬氨酰門冬氨酸峰的分離度均大于1.58；馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、門冬氨酸、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、鳥氨酸、β-門冬氨酰門冬氨酸峰的理論板數(shù)均不小于6 237。

2.4 破壞性試驗(yàn)

2.4.1 未破壞樣品溶液 取樣品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的溶液。

2.4.2 酸破壞樣品溶液 取樣品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入2 mol/L鹽酸溶液2 mL，放置30 min后，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL中和，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的溶液。

2.4.3 堿破壞樣品溶液 取樣品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，放置30 min后，加入2 mol/L鹽酸溶液2 mL中和，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的溶液。

2.4.4 氧化破壞樣品溶液 取樣品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入30%過氧化氫溶液2 mL，放置30 min后，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的溶液。

2.4.5 高溫破壞（固體）樣品溶液 取樣品適量，置于120 ℃下放置5 d，精密稱取100 mg，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的溶液。

2.4.6 光照破壞樣品溶液 取樣品適量，置于4 500 lx光照下20 d，精密稱取100 mg，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的溶液。

2.4.7 高溫破壞（液體）樣品溶液 取樣品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入少量“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液溶解，沸水浴中加熱30 min，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液稀釋至刻度，制成每1 mL中含門冬氨酸鳥氨酸10 mg的溶液。

取上述各樣品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖2。由圖2可知，在上述試驗(yàn)條件下，產(chǎn)生的所有降解產(chǎn)物峰均能與主成分峰實(shí)現(xiàn)有效分離，在高溫破壞（固體）條件下可產(chǎn)生3-氨基-2-哌啶酮，在酸破壞和堿破壞條件下可產(chǎn)生蘋果酸，在高溫破壞（液體）條件下可產(chǎn)生3-氨基-2-哌啶酮和富馬酸，在氧化破壞條件下可產(chǎn)生琥珀酸。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.3”項(xiàng)下混合對照品貯備液0.5、0.7、1、2、2.5 mL，分別置于50 mL量瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液稀釋至刻度，取適量按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，?g/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.6 定量限與檢出限考察

分別精密量取“2.2.4”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢出限。結(jié)果，馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸的定量限分別為0.22、0.53、51.50、103.50、0.26、8.31 ng，檢出限分別為0.13、0.26、10.30、20.70、0.13、2.08 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.4”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸峰面積的RSD分別為0.1%、0.3%、0.9%、0.7%、0.3%、1.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液（批號：17371）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，3-氨基-2-哌啶酮、蘋果酸、富馬酸峰面積的RSD分別為1.01%、1.35%、1.56%（n=5），其他成分未檢出，表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號：17371）適量，共12份，分別按“2.2.5”及“2.2.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對照溶液各6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中各雜質(zhì)的含量。結(jié)果，3-氨基-2-哌啶酮、蘋果酸、富馬酸、最大未知雜質(zhì)、未知雜質(zhì)總量的平均含量分別為0.053%、0.061%、0.003 3%、0.097%、0.118%，RSD分別為0.5%、1.5%、0.9%、1.5%、2.0%（n=6），其他成分未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號：17371）約0.2 g，精密稱定，共9份，分別置于20 mL量瓶中，加入一定量的混合對照品貯備液，加入“2.2.1”項(xiàng)下稀釋液稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取各批樣品適量，分別按“2.2.5”及“2.2.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中各已知雜質(zhì)的含量，以自身對照法計(jì)算最大未知雜質(zhì)與未知雜質(zhì)總量，結(jié)果見表3。

2.12 不同方法測定樣品有關(guān)物質(zhì)的比較

采用本研究方法與2015年版《中國藥典》（二部）方法，分別測定各批樣品中各雜質(zhì)的含量，結(jié)果見表4、表5。結(jié)果表明，本研究方法測定的3-氨基-2-哌啶酮、富馬酸的含量與2015年版《中國藥典》（二部）方法的測定結(jié)果相近，而本研究所用方法可檢出蘋果酸的含量。

3 討論

3.1 雜質(zhì)來源

門冬氨酸鳥氨酸是以門冬氨酸與鹽酸鳥氨酸為原料，經(jīng)成鹽等工序合成制得[10]。門冬氨酸以富馬酸為原料，可經(jīng)蛋白酶催化及純化等過程制備[11]。馬來酸為富馬酸的順式異構(gòu)體，而蘋果酸和琥珀酸為富馬酸在生產(chǎn)反應(yīng)中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。門冬氨酸在制備或存放過程中可能會發(fā)生氨基酸脫水縮合反應(yīng)，生成β-門冬氨酰門冬氨酸。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，采用化學(xué)合成法，利用馬來酸酐和氨水為主要原料合成門冬氨酸，其生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生馬來酸[12]。鳥氨酸在存放過程中會產(chǎn)生自身縮合物3-氨基-2-哌啶酮。故本試驗(yàn)選擇馬來酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、β-門冬氨酰門冬氨酸6種雜質(zhì)進(jìn)行含量測定。

3.2 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與名稱

2015年版《中國藥典》（二部）收載的門冬氨酸鳥氨酸原料藥中雜質(zhì)Ⅱ?yàn)殚T冬氨酸縮合物[8]。門冬氨酸含有2個(gè)羧基和1個(gè)氨基，根據(jù)其結(jié)構(gòu)式和氨基酸脫水縮合反應(yīng)原理推測，發(fā)生脫水縮合反應(yīng)時(shí)應(yīng)有2種構(gòu)型，分別為α-門冬氨酰門冬氨酸（物質(zhì)數(shù)字識別號碼：58471-53- 7）和β-門冬氨酰門冬氨酸（物質(zhì)數(shù)字識別號碼：60079- 22-3）。根據(jù)2015年版《中國藥典》（二部）收載的門冬氨酸鳥氨酸原料藥雜質(zhì)Ⅱ的結(jié)構(gòu)式推測為β-門冬氨酰門冬氨酸。

3.3 流動相的選擇

本研究采用氨基鍵合硅膠為色譜柱填充劑，以0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液[不同pH（5.6、6.3、6.25、6.2、6.15）]-乙腈（40 ∶ 60，V/V）為流動相進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)流動相的pH值對出峰順序及峰形影響較大，其pH值變化會使各物質(zhì)的出峰順序、時(shí)間和峰形產(chǎn)生明顯變化。供試品溶液中門冬氨酸峰后有一倒峰，調(diào)整流動相pH后該倒峰變?yōu)檎澹c門冬氨酸峰相連，但不影響其他雜質(zhì)分離。最初一溶劑峰（保留時(shí)間約為5.2 min）與馬來酸峰較難分離，通過一系列試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，該溶劑峰與流動相中的乙腈有關(guān)，使用水分含量較低或者質(zhì)譜級別的乙腈可以減少溶劑峰數(shù)量，且可使溶劑峰與馬來酸峰達(dá)到完全分離。

3.4 測定方法比較

2015年版《中國藥典》（二部）門冬氨酸鳥氨酸原料藥標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下同時(shí)測定了馬來酸、富馬酸、精氨酸、3-氨基-2-哌啶酮和β-門冬氨酰門冬氨酸的含量[8]。采用該色譜方法測定樣品時(shí)，溶劑峰與馬來酸峰存在重疊的現(xiàn)象，通過調(diào)整流動相比例、pH及更換色譜柱等均無法分開，以致無法測定樣品中馬來酸的含量。為此，本研究在參考上述色譜方法的基礎(chǔ)上，改用兩根氨基柱Phenomenex Luna NH2（150 mm×4.6 mm，3 μm）串聯(lián)后進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)溶劑峰與馬來酸峰分離效果良好，分離度符合要求。

采用本研究方法與2015年版《中國藥典》（二部）方法測定精氨酸的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在兩種色譜條件下的響應(yīng)值均較低，定量限與檢出限分別為8、4 ng；6批樣品中精氨酸均未檢出。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用柱前衍生化RP-HPLC法，以9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）為柱前衍生化試劑，對鳥氨酸鹽酸鹽中潛在的12種氨基酸類雜質(zhì)的衍生物進(jìn)行測定，所建立的方法靈敏度、準(zhǔn)確度高[13]。本研究亦嘗試采用柱前衍生化RP-HPLC法，以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC）為柱前衍生化試劑，對門冬氨酸鳥氨酸原料藥進(jìn)行衍生化處理后測定其中各雜質(zhì)含量，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，精氨酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.032～20.658 ?g/mL（r=0.999 9）；定量限與檢出限分別為0.5、0.3 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；加樣回收率為95.33%～98.17%（RSD=1.9%，n=9）。生產(chǎn)企業(yè)1的3批樣品中精氨酸含量分別為0.000 5%、0.001 0%、0.000 8%，生產(chǎn)企業(yè)2的3批樣品中精氨酸均未檢出。3-氨基-2-哌啶酮、富馬酸和β-門冬氨酰門冬氨酸的含量與2015年版《中國藥典》（二部）方法測定結(jié)果相近。

3.5 樣品中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果比較

2家生產(chǎn)企業(yè)的樣品質(zhì)量存在一定差異，生產(chǎn)企業(yè)1的各雜質(zhì)含量均比生產(chǎn)企業(yè)2高，特別是未知雜質(zhì)的含量，已高于2015年版《中國藥典》（二部）門冬氨酸鳥氨酸原料藥中未知雜質(zhì)的限度標(biāo)準(zhǔn)（0.1%）[8]。其原因可能與企業(yè)的生產(chǎn)工藝有關(guān)，故建議有關(guān)企業(yè)改進(jìn)其工藝。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于門冬氨酸鳥氨酸原料藥中有關(guān)物質(zhì)的測定。

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（收稿日期：2018-02-28 修回日期：2018-06-19）

（編輯：陳 宏）