左旋肉堿的分析方法

楊曉惠　鄭俠　夏玉

[摘要]左旋肉堿是參與生物體新陳代謝的重要物質(zhì)，具有多種生理功能，而左旋肉堿的含量是衡量其品質(zhì)的重要指標。目前，各研究學(xué)者已經(jīng)開發(fā)了多種分析方法對左旋肉堿的含量進行測定，主要包括酶技術(shù)法、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）和質(zhì)譜法（MS），但這些研究基本上都是實驗性研究，缺少對于這些測定方法的歸納和總結(jié)?；诖?，為了便于檢驗人員操作及選擇，文章對近年來左旋肉堿的分析方法進行歸納總結(jié)，也為其他學(xué)者的進一步研究提供參考。

[關(guān)鍵詞]左旋肉堿；測定方法；酶技術(shù)法；高效液相色譜法

中圖分類號：Q55 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180207

左旋肉堿（L-carnitine），又稱L-肉堿、左卡尼汀、L-肉毒堿或維生素BT，化學(xué)名為β-羥基γ-三甲銨丁酸，分子式為C₇H₁₅NO₃。是1905年由兩位俄國科學(xué)家Gulewitsch和Krimberg在肌肉浸汁中發(fā)現(xiàn)的一種類維生素。

肉堿有左旋（L-廣型）和右旋（D-型）兩種異構(gòu)體。其中只有L-型具有生理活性，而D-型是人工合成物，自然界中不存在，不僅沒有生物活性，而且還對L-肉堿有競爭性抑制作用。通常肉堿所指都是左旋肉堿。

左旋肉堿的來源有兩種：第一，體內(nèi)合成（主要是肝臟和腎臟），第二，膳食攝?。ㄖ饕莿游镄允澄铮?。其主要生理功能是作為載體將長鏈脂肪酸從線粒體膜外輸送到膜內(nèi)促進脂肪酸的β-氧化，從而促進機體脂肪代謝。此外，左旋肉堿還可以抗疲勞；緩解腎衰透析引起的急、慢性并發(fā)癥；改善代謝綜合征的腹部肥胖、血脂異常等臨床癥狀；參與精子運動和成熟過程等。

根據(jù)上述生理功能，加之食用安全、性質(zhì)穩(wěn)定，近年來，左旋肉堿作為一種新型營養(yǎng)強化劑和功能食品原料在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。包括減肥、健美等保健食品；嬰兒食品營養(yǎng)強化劑；運動員、中老年人的營養(yǎng)補充劑、化妝品，此外，左旋肉堿在飼料和醫(yī)療藥物方面也有應(yīng)用。由此可見，左旋肉堿具有廣闊的市場前景。

目前，左旋肉堿的檢測方法主要有：酶技術(shù)法、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法和質(zhì)譜法，其中以酶顯色法、酶熒光法和HPLC法較為常用。但關(guān)于左旋肉堿分析方法的研究主要是實驗性的、缺少總結(jié)和分析性的綜述文章，為了便于進一步研究，現(xiàn)將上述方法綜述如下。

1酶技術(shù)法

酶技術(shù)法是目前測定左旋肉堿較為常用的方法，主要包括酶技術(shù)的分光光度法、放射酶法、自動分析儀法、熒光光度法、酶循環(huán)法等。

1.1分光光度法

（1）酶顯色法。酶顯色法也被稱為2-硝基苯甲酸（DTNB）法，是目前測定左旋肉堿較為常用的方法。該方法最開始是由Marquis和Fritz于1964年建立，檢測了小鼠組織中的游離肉堿，后經(jīng)進一步完善成為現(xiàn)在的方法。該方法的機理為：左旋肉堿與乙酰輔酶A（乙酰CoA）在乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶（CAT）的催化下反應(yīng)生成乙酰肉堿和游離輔酶A（CoASH）。CoASH和2-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，其顏色深淺與CoASH的含量成正比。因CoASH與左旋肉堿是等摩爾反應(yīng)關(guān)系，通過分光光度法測定CoASH生成量即可間接測定左旋肉堿的含量。

該方法操作經(jīng)濟、快捷，且該方法中催化反應(yīng)的CAT酶對于左旋肉堿和乙酰輔酶A之間的反應(yīng)具有專一性，從而可以排除右旋肉堿的干擾，故靈敏度較高，檢出限為0.6mg/100g，重復(fù)性和回收率較好，回收率在96.2%～104.7%之間。而且與化學(xué)法（通過比色法測定肉堿和溴酚藍反應(yīng)生成的有色物質(zhì)來測定肉堿）相比，此法不受樣品中所含季胺類物質(zhì)的影響。國家標準《GB 29989嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》中使用的便是此方法。

該方法也有不足，由于DTNB還能與待測樣品中其他的硫醇類（-SH）物質(zhì)起反應(yīng)，且DTNB與CoASH不能完全反應(yīng)，從而影響測定的準確度。因此，為了消除SH物質(zhì)的干擾，Marquis在測定前將樣品置于90℃，pH8.5的環(huán)境中處理5min；也有人用H₂O₂氧化樣品中含硫醇基的物質(zhì)。

（2）2-酮戊二酸脫氫酶（OGDH）法。Jochen Schafer和Heinz Reichmann（1989）對原方法進行改進，在測定游離輔酶A時用2-酮戊二酸取代DTNB，在2-酮戊二酸脫氫酶（OGDH）催化下與CoASH反應(yīng)，生產(chǎn)琥珀酰輔酶A和還原型輔酶I（NADH），NADH在340nm處有強吸收。與原方法相比，OGDH與CoASH反應(yīng)的專一性更強，反應(yīng)更加完全，且不受其他SH的影響。該方法靈敏度高至nmol級，肉堿回收率在103%～115%之間，適合低肉堿含量的樣品。

1.2放射酶法

由于分光光度法敏感度較低，Cederblad和Lindstedt（1972）叫提出了用放射性同位素法來檢測少量血清樣品中皮摩爾級左旋肉堿的含量，其原理是將乙酰CoA用C14標記，即[C14]乙酰CoA+肉堿一[C14]乙酰肉堿+CoASH，將乙酰肉堿從乙酰CoA中分離出來，并測定肉堿的含量。由于可逆反應(yīng)使反應(yīng)不完全，導(dǎo)致只有加入超過量的乙酰CoA才能得到線性標準曲線。J.Denis Mc Garry和Daniel W.Foster（1976）對Cederblad和Lindstedt的方法進行了改進和簡化，結(jié)果顯示，不需要過量的標記乙酰CoA即可獲得比較寬的線性范圍；除此之外，即使在過量乙酰肉堿的存在下，也可以檢測非常少量的肉堿。

1.3自動分析儀法

Lijun Wan和Richard W.Hubbard（1998）用全自動生化分析儀代替普通分光光度計，對血清中游離和結(jié)合的左旋肉堿進行測定。與原方法相比，使用全自動生化分析儀在1小時內(nèi)即可完成檢驗，大大縮短了分析時間，而且可以降低人工操作及實驗材料引起的分析成本。此方法不僅適用大型醫(yī)院，也適用做臨床研究的小型實驗室。Gitten Cederblad等（1986）也曾用生物離心式分析儀對生物組織中的左旋肉堿進行測定。結(jié)果顯示，與原分光光度法相比，該方法具有試劑成本低、操作簡單、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，但與放射酶法相比，其靈敏度和精準度不如放射酶法，且在血漿、透析液、尿液和肌肉組織中的檢測值比放射酶法偏高10%～25%。

1.4熒光光度法

Mitsuo Maehara等（1988）采用一種簡單的熒光法對血清中游離肉堿進行測定，測定原理與分光光度法基本類似。肉堿與乙酰CoA在CAT的催化下反應(yīng)生成乙酰肉堿和CoASH，CoASH與BIPM耦合生產(chǎn)強熒光物質(zhì)CoA-BIPM，熒光強度與肉堿的含量成正比。通過測定熒光強度，可以得知血清中的肉堿含量。該方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）分別為5.2%和2.6%，肉堿回收率在98%～113%之間。與顯色法的測定結(jié)果相比具有良好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r>0.90）。該方法靈敏度較高，最低檢測限為10 μmol/L。

Kojiro Matsumoto等（1990）開發(fā)了熒光流動注射法對丙戊酸治療的患者血清中的肉堿進行測定。該方法使用了肉堿脫氫酶（CDH）和硫辛酰胺脫氫酶（DS）兩種固定化酶催化兩步反應(yīng)，第一步是肉堿和氧化型輔酶I（NAD+）在CDH的催化下反應(yīng)生成還原型輔酶I（NADH），第二步是NADH和刃天青（C12H7NO4）在DS的催化下反應(yīng)生成熒光物質(zhì)試鹵靈（C12H7NO3、），試鹵靈的熒光強度與肉堿的含量成正比。用該方法檢測肉堿時，肉堿的標準曲線在0.1～1.0nmol范圍內(nèi)呈線性，檢測的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為560nm和580nm。該方法適用于臨床試驗中對肉堿缺乏癥的檢測。

由于熒光法的測定結(jié)果容易受到樣品中內(nèi)源性熒光物質(zhì)的影響，因此在測定過程中要對每一份樣品設(shè)置空白。

1.5酶循環(huán)法

Mamoru Takahashi等（1994）開發(fā)了一種使用肉堿脫氫酶（CDH）測定血清中左旋肉堿的高靈敏度方法。該方法是一個還原型輔酶I（NADH）、硫代氧化型輔酶I（Thio-NAD+）和肉堿脫氫酶（CDH）共同參與的新型酶循環(huán)技術(shù)，原理是左旋肉堿在CDH和Thio-NAD+的存在下轉(zhuǎn)化為脫氫肉堿，同時生成硫代還原型輔酶I（Thio-NADH），脫氫肉堿又在CDH和NADH的存在下轉(zhuǎn)化為左旋肉堿，同時生成NAD+，此反應(yīng)每循環(huán)一次，將生成與左旋肉堿等當(dāng)量的Thio-NADH，因此在一定時間內(nèi)，循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)便是Thio-NADH生成相當(dāng)于左旋肉堿的倍數(shù)，通過測定Thio-NADH積累而引起415nm處的光吸收增量，即可得知左旋肉堿的含量，還可以提高左旋肉堿的n倍靈敏度。

用該方法測定血清中L-肉堿時，L-肉堿的標準曲線在5～250μmol/L范圍內(nèi)呈線性，回收率在96.5%～106%之間，批內(nèi)與批間的變異系數(shù)（CV）分別為在0.66%～4.33%之間和1.02%～2.56%之間。該方法不受膽紅素、血紅蛋白、各種酯酰DL-肉堿和抗壞血酸鹽的干擾，且操作過程簡單、快速、精確、自動。

2高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）是近年來發(fā)展起來的先進方法，主要有酶聯(lián)高效液相法、衍生高效液相法。

2.1酶聯(lián)高效液相法

酶分光光度法的準確度較差，且由于乙酰CoA長時間在pH7.8條件下容易發(fā)生水解，故不適合肝臟組織的檢測，Naoshi Takeyama等（1989）開發(fā)了酶聯(lián)高效液相色譜法解決了上述問題。該方法采用高效液相色譜儀來檢測左旋肉堿與乙酰CoA生成的CoASH，而不使用DTNB，平均檢測1個樣品時間為60min，靈敏度可達nmol級。

2.2衍生高效液相法

衍生法最開始是由Minkler等（1984）研究的反相離子對高效液相法，將肉堿衍生為4-bromophenaeyl ester，于254nm檢測肉堿含量，肉堿檢測結(jié)果在10～100nmol/mL范圍內(nèi)呈線性。為了避免衍生時生產(chǎn)的副產(chǎn)物影響測定結(jié)果，在樣品預(yù)處理時應(yīng)盡量去除其中的氯離子和多余的衍生劑。該方法的靈敏度適用于測定尿液中的肉堿，但不適用測定血漿中的肉堿，且不能區(qū)分開兩個異構(gòu)體L-型和D-型。

Ke Li等（2010）用衍生高效液相-紫外檢測法對人血清中的游離肉堿和總?cè)鈮A進行測定，將肉堿衍生為酯，于260nm檢測肉堿含量。該方法可同步測定血清中游離肉堿和總?cè)鈮A的含量。檢測肉堿的線性范圍為5～400μmol/L，批內(nèi)游離肉堿和總?cè)鈮A的相對標準差分別為3.36%和1.97%；批間游離肉堿和總?cè)鈮A的相對標準差分別為3.34%和1.77%。游離肉堿和總?cè)鈮A的平均回收率分別為98.2%和96.3%。

國內(nèi)趙亞明等（2006）建立了衍生高效液相色譜法檢測血漿中左旋肉堿的方法。研究發(fā)現(xiàn)左旋肉堿經(jīng)過衍生化處理后，在波長260nm處有一強的吸收波，說明衍生化反應(yīng)可以提高左旋肉堿的檢測靈敏度。該方法精密度RSD<4%、加樣回收率>70%，穩(wěn)定性良好，適用于臨床血漿左旋肉堿濃度的監(jiān)測。

李紅艷等、（2013）研究了衍生高效液相色譜-熒光檢測法測定乳制品中左旋肉堿含量的分析方法。左旋肉堿經(jīng)提取后經(jīng)L-丙酰胺-β-萘胺衍生后，于激發(fā)波長280nm、發(fā)射波長328nm下測定。該方法得到的乳粉檢出限為4.0mg/kg、液體乳檢出限為0.5mg/kg，檢測的L-肉堿在0.2～20.0mg/L范圍內(nèi)呈線性，相關(guān)系數(shù)為0.9990，回收率在80%～90%，相對標準偏差RSD小于10%。該方法靈敏度高，準確性好，適用于乳制品中L-肉堿的含量測定。

3離子色譜法（IC）

陳軍等（2013）提出了離子色譜法（IC）測定減肥食品中左旋肉堿含量的方法。以IonPac CSl7柱為離子交換柱，采用非抑制電導(dǎo)檢測器進行檢測。該方法測定左旋肉堿的質(zhì)量濃度在10～1000mg，L范圍內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，檢出限為1mg/g，回收率在95.4%～101%，測定值的相對標準偏差在0.9%～6.6%。

4質(zhì)譜法（MS）

三組研究人員分別研究了串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS）測定血清中肉堿的方法。Hardy等（2001）開發(fā)的MS/MS法需要在質(zhì)譜分析前對肉堿進行衍生，在衍生過程中乙酰肉堿會發(fā)生部分水解，從而影響測定的準確度。Stevens等（2000）研究的MS/MS法不需要衍生反應(yīng)，但為了避免電噴霧電離過程中的載體干擾，樣品在質(zhì)譜分析前需要棉纖濾紙過濾和一定濃度的甲醇溶液洗脫。Chung Shun Ho等（2003）提出使用液相色譜（LC）來減少載體干擾，研發(fā)發(fā)現(xiàn)LCMS/MS法操作方便，不需要衍生化，不存在衍生過程的水解問題，且液相色譜可以消除載體干擾因素，適合于血清中游離肉堿和總?cè)鈮A的測定。竺琴等（2012）建立了嬰幼兒配方奶粉中高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用測定方法。在優(yōu)化條件下，樣品在10min內(nèi)完成分析，左旋肉堿在0.40～10.0mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回收率在87%～106%，檢出限和定量下限分別為39.0ng、116.9ng。該方法操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、分析速度快，更適用于大量樣品的集中快速檢測。