HPLC法同時(shí)測定藥用鹵化丁基膠塞中5種抗氧劑和游離硫的含量

朱碧君 李婷婷 孫會敏 胡星宇 何君怡 羅躍華

中圖分類號 R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）18-2475-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.07

摘 要 目的：建立同時(shí)測定藥用鹵化丁基膠塞中2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、游離硫、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為甲醇-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為220 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：BHT、游離硫、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.592～64.80 μg/mL（r=0.999 9）、2.648～66.20 μg/mL（r=0.999 9）、2.062～51.55 μg/mL（r=0.999 9）、2.654～66.35 μg/mL（r=0.999 9）、2.128～53.20 μg/mL（r=0.999 9）、2.468～61.70 μg/mL（r=0.999 9）；定量限分別為2.073 6、2.118 4、2.749 2、1.061 6、4.436 0、3.090 4 mg/kg，檢測限分別為0.628 4、0.641 9、0.833 1、0.321 7、1.344 2、0.992 4 mg/kg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%；加樣回收率分別為96.57%～99.17%（RSD=0.92%，n=9）、77.47%～86.14%（RSD=2.94%，n=9）、96.11%～98.39%（RSD=0.63%，n=9）、96.22%～98.33%（RSD=0.67%，n=9）、95.59%～99.22%（RSD=1.11%，n=9）、81.54%～88.31%（RSD=2.46%，n=9）。結(jié)論：該方法靈敏快速、操作簡便、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測定藥用鹵化丁基膠塞中5種抗氧劑和游離硫的含量。

關(guān)鍵詞 藥用鹵化丁基膠塞；2，6-二叔丁基對甲酚；游離硫；抗氧劑1010；抗氧劑330；抗氧劑1076；抗氧劑168；高效液相色譜法；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of BHT， free sulfur， antioxidant 1010， antioxidant 330， antioxidant 1076 and antioxidant 168 in pharmaceutical halogenated butyl rubber stopper. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Zorbax SB-C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 25 ℃， and detection wavelength was set at 220 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of BHT， free sulfur， antioxidant 1010， antioxidant 330， antioxidant 1076 and antioxidant 168 were 2.592-64.80 μg/mL （r=0.999 9）， 2.648-66.20 μg/mL （r=0.999 9）， 2.062-51.55 μg/mL （r=0.999 9）， 2.654-66.35 μg/mL （r=0.999 9）， 2.128-53.20 μg/mL （r=0.999 9）， 2.468-61.70 μg/mL （r=0.999 9）， respectively. The limits of quantitation were 2.073 6， 2.118 4， 2.749 2， 1.061 6， 4.436 0， 3.090 4 mg/kg； the limits of detection were 0.628 4， 0.641 9， 0.833 1， 0.321 7， 1.344 2， 0.992 4 mg/kg， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The average recoveries were 96.57%-99.17%（RSD=0.92%， n=9）， 77.47%-86.14%（RSD=2.94%， n=9）， 96.11%-98.39%（RSD=0.63%， n=9）， 96.22%-98.33%（RSD=0.67%， n=9）， 95.59%-99.22%（RSD=1.11%， n=9） and 81.54%-88.31%（RSD=2.46%， n=9）， respectively. CONCLUSIONS： The method is sensitive， rapid， convenient and reproducible， and can be used for simultaneous determination of 5 antioxidant and free sulfur in pharmaceutical halogenated butyl rubber stopper.

KEYWORDS Pharmaceutical halogenated butyl rubber stopper； BHT； Free sulfur； Antioxidant 1010； Antioxidant 330； Antioxidant 1076； Antioxidant 168； HPLC； Content determination

藥用鹵化丁基膠塞是藥品包裝中瓶裝密封材料的重要組成部分，具有吸濕率低、耐化學(xué)性及氣密性好、無生理毒副作用等特點(diǎn)[1]。實(shí)際使用過程中，藥用鹵化丁基膠塞會直接與藥物接觸，而由于其在加工過程中需加入多種添加劑，如抗氧劑2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、抗氧劑1010等來抑制或延緩其氧化過程，此外還需經(jīng)硫化處理，因而不可避免地會在膠塞內(nèi)殘存一些未被化學(xué)鍵合的反應(yīng)剩余物、不參與反應(yīng)的物質(zhì)及熱分解的產(chǎn)物，如游離硫[2]等，這些物質(zhì)可能會通過吸附、吸收、滲透和抽提等方式與藥物發(fā)生反應(yīng)，從而影響和污染藥物[3-10]，隨藥物進(jìn)入人體后可能會引起不良反應(yīng)，危害健康[11-12]。2015年版《國家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》中的“藥品包裝材料與藥物相容性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”指出，鑒于橡膠配方的復(fù)雜性，應(yīng)重點(diǎn)考察其中各種添加物的溶出對藥物的作用、橡膠對藥物的吸附以及填充材料在溶液中的脫落[13]。為此，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-18]，采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定了藥用鹵化丁基膠塞中BHT、游離硫、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168的含量，以為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外可變波長檢測器、二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）； AE-240型電子天平、AEG220型電子天平（日本島津公司）；Milli-Advantage A10超純水裝置（美國密理博公司）。

1.2 包材與試劑

BHT對照品（批號：LB68565，純度：99.900%）、硫磺對照品（批號：L01272，純度：99.999%）、抗氧劑1010對照品（批號：MKBC8710V，純度：100%）、抗氧劑330 對照品（批號：05928TI，純度：100%）、抗氧劑1076 對照品（批號：MKBB8963，純度：100%）、抗氧劑168 對照品（批號：MKAA3717，純度：100%）均由美國Sigma-Aldrich公司提供； 藥用鹵化丁基膠塞（江蘇博生醫(yī)用新材料股份有限公司，批號：16051314、16050750、16033014，規(guī)格：20A、32A、20-B2-2；江蘇華蘭藥用新材料股份有限公司，批號：13032246-60，規(guī)格：三叉20-A4-1；南昌市君健橡塑制品有限公司，批號：20150601，規(guī)格：15膠塞；江西高科藥包有限公司，批號：20150712、20150713，規(guī)格均為13.4 mm×2.0 mm；樂清市金泰實(shí)業(yè)有限公司，批號：20160402，規(guī)格：20A；山東省藥用玻璃股份有限公司，批號：S160802703，規(guī)格：13-D2-3）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～9 min，90%A；9～15 min，90% A→100% A；15～50 min， 100%A；50～55 min， 100% A→90% A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：220 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在該色譜條件下，BHT、游離硫、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168峰的理論板數(shù)均大于2 000，保留時(shí)間分別為7.93、16.18、21.25、23.00、31.22、39.13 min；各成分峰之間分離良好，分離度均大于2.0，詳見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取BHT、硫磺、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168對照品各適量，置于同一100 mL量瓶中，加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得BHT、流離硫、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168質(zhì)量濃度分別為0.012 96、0.013 24、0.010 31、0.013 27、0.010 64、0.012 34 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥用鹵化丁基膠塞樣品剪碎，精密稱取5 g，置于具塞錐形瓶中，加入無水乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，于80 ℃加熱回流4 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對照溶液 以無水乙醇為空白對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品貯備液0.2、0.5、1、2、3、5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列線性關(guān)系工作溶液。精密量取上述系列線性關(guān)系工作溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.4 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比10 ∶ l、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，BHT、游離硫、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168的定量限分別為2.073 6、2.118 4、2.749 2、1.061 6、4.436 0、3.090 4 mg/kg，檢測限分別為0.628 4、0.641 9、0.833 1、0.321 7、1.344 2、0.992 4 mg/kg。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，BHT、游離硫、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168峰面積的RSD分別為0.09%、0.33%、0.13%、0.18%、0.11%、0.08%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：S160802703）適量，分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，BHT、游離硫、抗氧劑1010峰面積的RSD分別為1.78%、1.59%、1.62%（n=6），其他成分未檢出，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取剪碎后的樣品（批號：S160802703）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，BHT、游離硫、抗氧劑1010的平均含量分別為17.6、18.5、29.6 μg/g ，RSD分別為1.11%、2.35%、1.29%（n=6），其他成分未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號：S160802703）適量，共9份，分別加入一定量的對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測定

分別取剪碎后的各批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3（注：“-”表示未檢出）。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取BHT、硫磺、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168對照品各適量，分別加入無水乙醇制成每1 mL含10 μg的單一對照品溶液，以無水乙醇為空白，于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果，BHT在221、277 nm波長處，游離硫在220、264 nm波長處，抗氧劑1010在274 nm波長處，抗氧劑330在276 nm波長處，抗氧劑1076在274 nm波長處，抗氧劑168在270 nm波長處有最強(qiáng)吸收。另取供試品溶液和混合對照品溶液分別在220、264、277 nm波長處掃描，結(jié)果，BHT、硫磺、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076、抗氧劑168在220、277 nm波長處均有較強(qiáng)吸收?？紤]到藥用鹵化丁基膠塞中的抗氧劑和流離硫含量較低，在220 nm波長處靈敏度相對較高，故選擇220 nm為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本研究考察了不同體積比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相體系時(shí)的分離度。結(jié)果，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，各待測成分的分離度均較好，且保留時(shí)間適中，故選擇甲醇-水（梯度洗脫）為流動(dòng)相。

3.3 樣品處理方法的確定

取藥用鹵化丁基膠塞樣品剪碎，精密稱取5 g，置于具塞錐形瓶中，加入無水乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，分別以超聲（30 min、1 h）和80 ℃（考慮到硫磺分子S8在高溫下易分解[19]）加熱回流（30 min、1 h）處理，冷卻后用無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，進(jìn)樣時(shí)發(fā)現(xiàn)超聲處理樣品的峰面積較小，與回流處理的樣品相比提取不充分。另取處理后的樣品進(jìn)樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加熱回流4 h可基本提取完全，故選擇加熱回流時(shí)間為4 h。

綜上所述，本方法靈敏快速、操作簡便、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測定藥用鹵化丁基膠塞中5種抗氧劑和游離硫的含量。

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（收稿日期：2018-04-22 修回日期：2018-07-11）

（編輯：陳 宏）