HPLC法同時測定溫經(jīng)湯中10種活性成分的含量

邵長森 張國青 韓真真 徐桂紅 林桂濤 盛華剛

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2640-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.11

摘 要 目的：建立同時測定溫經(jīng)湯中10種活性成分（芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚和甘草酸銨）含量的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，雙波長切換檢測（0～25 min為240 nm，檢測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸；25～65 min為275 nm，檢測甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨），柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL。結(jié)果：芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.04～80.80、19.32～368.40、2.62～52.40、17.52～350.40、2.07～41.40、4.02～80.40、0.56～11.20、1.69～33.80、2.18～43.60、72.10～1 442.00 μg/mL（r均≥ 0.999 6），檢測限分別為0.06、0.03、0.04、0.06、0.07、0.05、0.04、0.06、0.07、0.09 μg/mL，定量限分別為0.17、0.09、0.13、0.19、0.20、0.18、0.11、0.15、0.18、0.25 μg/mL，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗的RSD均<3.5%（n=6～7），各種成分的平均加樣回收率為97.72%～100.60%（RSD 為0.80%～2.49%，n=6）。結(jié)論：建立的HPLC法準確可靠、專屬性好，可用于溫經(jīng)湯中芍藥內(nèi)酯苷等10種活性成分含量的同時測定。

關(guān)鍵詞 溫經(jīng)湯；高效液相色譜法；含量測定；活性成分

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 10 active components （albiflorin， paeoniflorin， β-ecdysterone， liquiritin， ferulic acid， liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， paeonol and ammonium glycyrrhetate） in Wenjing decoction. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid water solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min， in dual wavelength switching detection （0-25 min， 240 nm for albiflorin， paeoniflorin， β-ecdysterone， liquiritin， ferulic acid； 25-65 min， 275 nm for liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， paeonol， ammonium glycyrrhetate）. The column temperature was set at 25 ℃， and sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of albiflorin， paeoniflorin， β-ecdysterone， liquiritin， ferulic acid， liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， paeonol and ammonium glycyrrhetate were 4.04-80.80， 19.32-368.40， 2.62-52.40， 17.52-350.40， 2.07-41.40， 4.02-80.40， 0.56-11.20， 1.69-33.80， 2.18-43.60 and 72.10-1 442.00 μg/mL （all r≥0.999 6）， respectively. The limits of detection were 0.06， 0.03， 0.04， 0.06， 0.07， 0.05， 0.04， 0.06， 0.07， 0.09 μg/mL， respectively. The limits of quantitation were 0.17， 0.09， 0.13， 0.19， 0.20， 0.18， 0.11， 0.15， 0.18， 0.25 μg/mL， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （24 h） were all lower than 3.5% （n=6-7）. The average recovery rates were 97.72%-100.60% with the RSDs of 0.80%-2.49% （n=6）. CONCLUSIONS： The established HPLC method is accurate， reliable and specfic， and suitable for simultaneous determination of 10 active components as albiflorin in Wenjing decoction.

KEYWORDS Wenjing decoction； HPLC； Content determination； Active component

溫經(jīng)湯是中醫(yī)“調(diào)經(jīng)止痛”的經(jīng)典名方，出自南宋名醫(yī)陳自明的《婦人大全良方》，現(xiàn)收錄于《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》。該方由當歸、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪術(shù)、人參、甘草、牛膝等9 味中藥組成，具有溫經(jīng)散寒、活血調(diào)經(jīng)的功效，主要用于閉經(jīng)、痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位等證[1-3]。方中，當歸和川芎中的阿魏酸具有明顯的抗氧化、抗炎與抗血小板凝集作用，在心血管疾病的治療中效果顯著[4-5]；白芍中的芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷對人體具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，其中芍藥苷的補血作用目前已有較多報道[6-8]；肉桂中的肉桂酸、桂皮醛具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用，在治療不孕不育方面也很有前景[9-10]；牡丹皮的有效成分丹皮酚具有解痙、抗過敏、活血化瘀等作用，與芍藥苷聯(lián)合應(yīng)用能顯著改善動物血流動力學(xué)參數(shù)[11-12]；甘草中的甘草苷、甘草素、甘草酸銨在機體缺乏雌激素時表現(xiàn)出雌激素樣作用，是甘草治療痛經(jīng)和生殖器官腫瘤的主要活性成分[13]；牛膝中的β-蛻皮甾酮屬于昆蟲生長調(diào)節(jié)激素，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、子宮興奮、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[14-15]。目前，對溫經(jīng)湯的研究多集中在中醫(yī)辨證論治方面，尚未見對溫經(jīng)湯中化學(xué)成分進行定量分析的報道。故本課題組采用高效液相色譜（HPLC）法建立了同時測定以上10種活性成分含量的方法，以期為溫經(jīng)湯的質(zhì)量控制及其后續(xù)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型二極管陣列檢測器、G1316A型柱溫箱和OpenLAB型色譜工作站（美國Agilent公司）；MS105DU型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

當歸、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪術(shù)、人參、甘草、牛膝等9味中藥材均購于山東省中醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定均為真品；芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110736- 201741、111638-201706、111610-201607、0773-9910、110786-201604、110710-201720、0708-9704、110731- 201619，純度分別為：95.7%、98.4%、93.1%、98%、98.8%、98%、98.5%、93%）；芍藥內(nèi)酯苷對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號：713A022，純度：98%）、甘草素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z20J8X- 40262，純度：98%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（200 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，14%→22%A；25～65 min，22%→42%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～25 min為240 nm（檢測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷和阿魏酸），25～65 min為275 nm（檢測甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚和甘草酸銨）；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 溫經(jīng)湯標準煎液 根據(jù)《婦人大全良方》中記載的溫經(jīng)湯的制備方法[16]，再結(jié)合歷代醫(yī)學(xué)和本草古籍[17-18]，最終確定了以下制法：先將方中各單味藥材粉碎為粗粉，然后稱取當歸、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪術(shù)粉末各1.67 g，人參、甘草、牛膝粉末各3.33 g，加水300 mL，混勻，先用武火加熱至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160 mL左右（標準煎液制備所需要的時間平均為1 h），趁熱濾過，濾液加水定容至250 mL，即得。

2.2.2 混合對照品溶液 精密稱取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨各對照品適量，分別置于不同量瓶中，加入70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含上述10種成分依次為808、1 932、655、2 190、1 035、1 005、560、845、1 090、7 210 μg的單一對照品貯備液。精密吸取上述各對照品貯備液適量，置于同一25 mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得上述10種成分質(zhì)量濃度依次為80.8、386.4、52.4、350.4、41.4、80.4、11.2、33.8、43.6、1 442 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密吸取溫經(jīng)湯標準煎液15 mL，加70%甲醇定容至50 mL，密閉，稱質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：50 kHz）處理10 min，放置過夜，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.25 mL，加70%甲醇稀釋至5 mL；吸取“2.2.3”項下供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾。分別將上述3種溶液在“2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測成分間、待測成分與雜質(zhì)峰間均能達到基線分離，分離度均>1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)以芍藥內(nèi)酯苷峰計不低于5 000，色譜圖詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1、2、4、5 mL，置于不同5 mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，制得6個不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，計算各成分的回歸方程。結(jié)果各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，結(jié)果見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋后，每個質(zhì)量濃度均按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限，結(jié)果見表1。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.63%、0.35%、1.02%、0.28%、0.85%、0.95%、1.13%、0.92%、0.86%、0.61%（n=6），相對保留時間的RSD均小于0.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品6份，按“2.2.3”項下方法平行操作制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨峰面積的RSD均小于2.00%（n=6），相對保留時間的RSD均小于0.60%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.48%、1.57%、2.15%、1.33%、2.27%、1.88%、2.95%、3.48%、2.87%、2.24%（n=7），相對保留時間的RSD均小于0.73 %（n=7），表明樣品在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收試驗

精密吸取已知含量的標準煎液，共6份，每份15 mL，分別置于50 mL的量瓶中，各加入待測成分對照品適量，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄峰面積并計算各成分的加樣回收率和RSD值。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨的平均加樣回收率為97.72%～100.60%，RSD為0.80%～2.49%（n=6），表明該方法準確度良好，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測定

按照“2.2.1”項下方法制備3批溫經(jīng)湯標準煎液，再按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算3批標準煎液中10種成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者試驗前期采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)對10種成分進行光譜掃描，結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨的最大吸收波長分別為228、230、250、245、315、275、285、290、274、255 nm。結(jié)合各成分的光譜圖，發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸在240 nm波長處均有較大的吸收；甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨在275 nm波長處均有較大的吸收。再結(jié)合液相色譜圖，最終將波長設(shè)定為0～25 min為240 nm，25～65 min為275 nm。

3.2 流動相的選擇

筆者首先考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液等常用的流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸水溶液在分離效果上要優(yōu)于其他3個流動相系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上對流動相的濃度和比例進行優(yōu)化，結(jié)果表明以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相時分離效果最好，出峰穩(wěn)定、峰形尖銳，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為本研究的流動相體系。

3.3 標準煎液中多成分同時測定的思考

本研究在建立溫經(jīng)湯標準煎液中多成分同時測定的方法時，僅考察了240、275 nm波長下各成分吸收情況，在此波長條件下，難以全面評價溫經(jīng)湯標準煎液的質(zhì)量。如復(fù)方中的人參皂苷類成分在203 nm波長下響應(yīng)較好，與樣品中其他成分的檢測波長差異較大，一次進樣切換波長不能體現(xiàn)標準煎液中的人參皂苷類成分；但“2.1”項下洗脫程序在203 nm波長下檢測時，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離效果不佳，在兼顧復(fù)方各類成分的分離情況下，沒能體現(xiàn)出人參皂苷類成分對復(fù)方的貢獻，故以后在溫經(jīng)湯標準煎液的質(zhì)量控制中需另選方法測定復(fù)方中的人參皂苷類成分。

綜上所述，本研究建立的含量測定方法適用于經(jīng)典名方溫經(jīng)湯中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷等10種成分含量的同時測定。但復(fù)方中藥味較多，有效成分較復(fù)雜，有些有效成分未能在圖譜中顯示，有些成分的結(jié)構(gòu)也沒能確定，這些問題還需要結(jié)合質(zhì)譜等分析技術(shù)進行深入研究。

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（收稿日期：2018-05-10 修回日期：2018-07-16）

（編輯：林 靜）