重組腺病毒Ad—GFP—C197對3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用研究

鄔賢 黃瑩 李舒婕 段萍萍 米鵬程 陳文瑛

中圖分類號(hào) R966；R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）20-2800-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.14

摘 要 目的：研究以腺病毒載體系統(tǒng)裝載人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C端片段（C197）制成的重組腺病毒Ad-GFP-C197對3種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。方法：采用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增并純化Ad-GFP-C197。采用Ad-GFP-C197分別感染人胃癌細(xì)胞SGC7901、人乳腺癌細(xì)胞MCF7和人結(jié)直腸癌細(xì)胞CaCO2。以空白腺病毒載體（Ad-GFP）為參比，采用Western blot法檢測Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細(xì)胞中C197的蛋白表達(dá)水平；采用MTT法檢測Ad-GFP-C197感染后對3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用，繪制細(xì)胞增殖曲線并計(jì)算增殖抑制率。結(jié)果：Ad-GFP感染的3種腫瘤細(xì)胞中均未檢測到C197蛋白表達(dá)，而Ad-GFP-C197感染的上述細(xì)胞中C197蛋白均有明顯表達(dá)；Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細(xì)胞的增殖曲線隨時(shí)間延長而呈明顯抑制現(xiàn)象，其增殖抑制率最高可達(dá)37.31%～41.42%。結(jié)論：Ad-GFP-C197對SGC7901細(xì)胞、MCF7細(xì)胞、CaCO2細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，且起效迅速，能夠克服其他端粒酶抑制劑起效緩慢的缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；端粒酶抑制劑；重組腺病毒；Ad-GFP-C197；腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞增殖

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of recombinant adenovirus Ad-GFP-C197， which prepared by adenovirus vector system-loading human telomerase reverse transcriptase （hTERT） C fragment （C197）， on the proliferation of 3 kinds of tumor cells in vitro. METHODS： Ad-GFP-C197 was amplified and purified with HEK293 cells. Human gastric cancer cells SGC7901， human breast cancer cells MCF7 and human colorectal cancer cells CaCO2 were infected by Ad-GFP-C197 respectively. Using blank adenovirus carrier （Ad-GFP） as reference， the protein expression of C197 in 3 kinds of tumor cells infected by Ad-GFP-C197 was detected by Western blot assay. The inhibitory effects of Ad-GFP-C197 on 3 kinds of tumor cells were detected by MTT assay. The cell proliferation curve was drawn and the proliferation inhibition rate was calculated. RESULTS： The protein expression of C197 was not detected in 3 kinds of tumor cells infected by Ad-GFP， while significant protein expression of C197 was found in above cells infected by Ad-GFP-C197. The proliferation curves of the 3 kinds of tumor cells infected by Ad-GFP-C197 were significantly inhibited with the time extended， and the proliferation inhibitory rate reached 37.31%-41.42%. CONCLUSIONS： Ad-GFP-C197 shows significant inhibitory effects on the proliferation of SGC7901， MCF7 and CaCO2 cells， which is rapid to make up for the slow effect of other telomerase inhibitors.

KEYWORDS hTERT； Telomerase inhibitor； Recombinant adenovirus； Ad-GFP-C197； Tumor cell； Cell proliferation

端粒是位于染色體末端由串聯(lián)重復(fù)堿基序列（TTAGGG）和端粒結(jié)合蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)。在正常細(xì)胞中，端?？呻S著細(xì)胞分裂而縮短，當(dāng)縮短到一定程度時(shí)染色體末端會(huì)融合或降解，細(xì)胞則繼而發(fā)生衰老和死亡；但在腫瘤細(xì)胞中，端粒不會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而縮短，因此腫瘤細(xì)胞才得以永生化[1-3]。端粒酶是一種由RNA模板和催化蛋白組成的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，能特異性地在染色體DNA末端加上堿基序列TTAGGG片段以防止端?？s短；其在正常細(xì)胞中不表現(xiàn)活性，但在75%～95%的惡性腫瘤（如肺癌、胃癌、肝癌、大腸癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌等）組織中表現(xiàn)出明顯活性，因此被認(rèn)為是惡性腫瘤最為廣泛的分子標(biāo)記物[4]。

人端粒酶主要組成包括模板RNA（hTR）和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT），其以hTR作為模板在hTERT的催化作用下延伸端粒，轉(zhuǎn)染hTERT基因到無端粒酶活性的正常組織細(xì)胞或腫瘤組織細(xì)胞中，可激活細(xì)胞中的端粒酶[5]。因此，hTERT是決定端粒酶活性的主要因素[6]，其已成為腫瘤形成、生長及發(fā)展等多種效應(yīng)的核心調(diào)控分子，是抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[7-8]。hTERT由N端（RNA結(jié)合區(qū)）、逆轉(zhuǎn)錄區(qū)（催化活性區(qū)）和C端3個(gè)功能區(qū)組成，其中C端作為延長端粒的重要功能區(qū)[9]，目前相關(guān)研究較少，故本課題組對hTERT C端進(jìn)行研究。

腺病毒載體系統(tǒng)（AdEasy-1）是一種E1區(qū)和E3區(qū)雙缺失的復(fù)制缺陷型載體，主要由穿梭質(zhì)粒（PAdTrack-CMV）和骨架質(zhì)粒（PAdEasy-1）兩部分組成，該載體可通過在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制大大增加治療基因的拷貝數(shù)，使治療基因呈高水平表達(dá)；而且該載體不會(huì)整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，安全性好，是應(yīng)用于臨床的一種優(yōu)良的基因治療載體[10]。本課題組在前期研究中，篩選得到hTERT C端第936～1 132位共197個(gè)氨基酸片段（命名為C197），并利用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的AdEasy-1（命名為Ad-GFP）來構(gòu)建裝載C197的重組腺病毒（命名為Ad-GFP-C197），結(jié)果發(fā)現(xiàn)C197能在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)；同時(shí)，Ad-GFP-C197在體內(nèi)外對腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤組織生長均有抑制作用，且該抑制作用與其抑制端粒酶活性、下調(diào)hTERT蛋白水平、抑制NF-κB通路中p65蛋白和IκBα蛋白的表達(dá)有關(guān)[11]。本研究選取人胃癌細(xì)胞SGC7901、人乳腺癌細(xì)胞MCF7和人結(jié)直腸癌細(xì)胞CaCO2為對象，考察Ad-GFP-C197對上述3種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，為基于端粒酶的腫瘤基因治療提供新的思路，并為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)C197用于腫瘤的生物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BB15型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；Avanti J-30I型超速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；BX43型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；1658003型電泳儀、GelDoc XR+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；TE70XP半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Hoefer公司）；T25培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；Beckman離心管（香港弗科斯科技有限公司）；MD27透析袋（美國Viskase公司）；FFC58暗盒（廣州碧云天有限公司）；JB-CJ-1500FX型超凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑

重組腺病毒Ad-GFP-C197、不含C197的空白腺病毒Ad-GFP（本實(shí)驗(yàn)室自制，液氮保存）；胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）（法國Biowest公司）；氯化銫（CsCl，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；蛋白提取試劑盒（美國Omega公司）；二甲基噻唑藍(lán)（MTT，德國Sigma公司）；鼠抗His抗體、羊抗鼠IgG抗體、內(nèi)參GAPDH抗體（美國Santa Cruz公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8）、顯影粉、定影粉、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（上海史瑞克生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細(xì)胞

人胚胎腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞、人乳腺癌MCF7細(xì)胞和人結(jié)直腸癌CaCO2細(xì)胞均購自上海信然生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取HEK293細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、MCF7細(xì)胞和CaCO2細(xì)胞，在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)液”）中，于37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同），待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 Ad-GFP-C197的擴(kuò)增、純化及滴度測定

2.2.1 Ad-GFP-C197擴(kuò)增 將HEK293細(xì)胞鋪于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為1×106～3×106個(gè)/mL，分別加入培養(yǎng)液2 mL，常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出。取出液氮中保存的Ad-GFP-C197，在冰浴中融化后加入培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日取出培養(yǎng)瓶，在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況（鏡下可見感染病毒的細(xì)胞呈綠色彗星狀）。培養(yǎng)3～5 d后，待1/3的細(xì)胞感染病毒時(shí)，回收細(xì)胞，在4 ℃條件下以1 000 r/min離心10 min；取下層5 mL液體重懸細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞反復(fù)凍融（-80～37 ℃）3次后即得病毒原液。

2.2.2 Ad-GFP-C197純化 取Beckman離心管數(shù)根，用75%乙醇浸泡30 min后，于超凈工作臺(tái)風(fēng)干。在每根Beckman管中先后加入不同濃度的CsCl溶液（4、2 mol/L）2 mL，再在最上層加入“2.2.1”項(xiàng)下制得的病毒原液1 mL，然后在4 ℃條件下以20 000 r/min真空離心2 h。離心后小心取出，在超凈工作臺(tái)中，以5 mL注射器插入至Beckman管乳白色病毒帶處，吸出病毒帶液體。病毒帶液體采用透析袋MD27（分子量：3 500 Da）于4 ℃條件下在600 mL透析液（含10%甘油的0.01 mol/L PBS）中攪拌透析，每6 h更換一次透析液，24 h后收集透析后的純化病毒并分裝，于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹12]。

2.2.3 病毒滴度的測定 取純化后Ad-GFP-C197和Ad-GFP，用PBS分別稀釋10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個(gè)梯度（即分別稀釋1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107倍）。將HEK293細(xì)胞鋪于24孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分為Ad-GFP-C197組和Ad-GFP組，分別加入不同梯度的Ad-GFP-C197溶液和Ad-GFP溶液（50 μL/孔），繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h。各個(gè)梯度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)完畢后，在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)視野中的熒光細(xì)胞，每孔計(jì)數(shù)3個(gè)視野，以每個(gè)視野20～50個(gè)熒光細(xì)胞為最佳[13]。根據(jù)熒光細(xì)胞數(shù)，按照公式計(jì)算病毒滴度：滴度（PFU/mL）=（每個(gè)視野的熒光細(xì)胞數(shù)×每個(gè)孔的視野數(shù)）/（加入的病毒液體積×稀釋梯度）。根據(jù)滴度測定結(jié)果，按實(shí)際需要的感染復(fù)數(shù)（MOI），以PBS將病毒稀釋至相應(yīng)濃度，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細(xì)胞中C197蛋白的表達(dá)水平檢測

采用Western blot法測定C197蛋白的表達(dá)水平。試驗(yàn)分為SGC7901細(xì)胞組、MCF7細(xì)胞組和CaCO2細(xì)胞組，將上述3種細(xì)胞分別鋪于培養(yǎng)瓶中，每瓶2×106個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h；按MOI為100，分別采用Ad-GFP-C197和Ad-GFP感染上述細(xì)胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集感染后的3組腫瘤細(xì)胞，分別用蛋白提取試劑盒提取收集細(xì)胞蛋白，再經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h；先后加入一抗（鼠抗His抗體，1 ∶ 2 000）、內(nèi)參GAPDH抗體（1 ∶ 2 000）和二抗（羊抗鼠IgG抗體，1 ∶ 3 000），于4 ℃孵育1 h后，用PBS洗脫3次。在暗室中用暗盒進(jìn)行壓片，經(jīng)顯影后曝光得膠片，晾干后拍照保存。采用Image J 1.48軟件分析目標(biāo)蛋白條帶的灰度值以表示蛋白表達(dá)水平，重復(fù)分析3次，繪制柱狀圖。

2.4 Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率檢測

采用MTT法[14]測定細(xì)胞增殖抑制率。按“2.3”項(xiàng)下分組，將SGC7901細(xì)胞、MCF7細(xì)胞和CaCO2細(xì)胞分別鋪于96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，每種細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，共鋪7塊板。按MOI為100，分別采用Ad-GFP-C197和Ad-GFP感染上述細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。每隔24 h取1塊板，棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)溶液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。采用酶標(biāo)儀在495 nm波長處測定吸光度（OD值），并對OD值-時(shí)間繪制細(xì)胞增殖曲線圖，其中OD值越低，則表明細(xì)胞增殖受抑制程度越高；同時(shí)，按公式計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率[抑制率（%）=（ODAd-GFP-ODAd-GFP-C197）/ ODAd-GFP×100%]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Ad-GFP-C197擴(kuò)增、純化及滴度測定結(jié)果

3.1.1 擴(kuò)增結(jié)果 Ad-GFP-C197感染HEK293細(xì)胞后第2天，顯微鏡下可見彗星狀綠色熒光細(xì)胞（見圖1），表明感染成功，Ad-GFP-C197能在細(xì)胞中復(fù)制；第5天時(shí)能觀察到有三分之一的細(xì)胞被感染。

3.1.2 純化結(jié)果 經(jīng)超速離心后，可在離心管中明顯觀察到一條清晰的乳白色病毒條帶。

3.1.3 滴度測定結(jié)果 經(jīng)檢測，Ad-GFP-C197的滴度為3.14×1011 PFU/mL，Ad-GFP的滴度為2.10×1011 PFU/mL。

3.2 Ad-GFP-C197感染后腫瘤細(xì)胞內(nèi)C197蛋白表達(dá)情況

Ad-GFP感染的SGC7901細(xì)胞、MCF7細(xì)胞和CaCO2細(xì)胞中均未檢測到C197蛋白的表達(dá)，而Ad-GFP- C197感染的上述3種腫瘤細(xì)胞中C197蛋白均有明顯表達(dá)。蛋白表達(dá)電泳圖見圖2，灰度值柱狀圖見圖3（注：由于Ad-GFP感染細(xì)胞的C197蛋白表達(dá)均為陰性結(jié)果，因此只提供SGC7901細(xì)胞感染后的結(jié)果）。

3.3 Ad-GFP-C197感染后腫瘤細(xì)胞的增殖抑制情況

與Ad-GFP比較，Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細(xì)胞的增殖曲線均表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象，SGC7901細(xì)胞、MCF7細(xì)胞均在第2天開始表現(xiàn)出受到抑制，CaCO2細(xì)胞在第3天開始表現(xiàn)出受到抑制；3種腫瘤細(xì)胞的OD值分別從第4、5、4天開始組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖4。此外，隨作用時(shí)間的延長，3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率均呈升高趨勢；第3、4天時(shí)，CaCO2細(xì)胞增殖抑制率較其他2種細(xì)胞顯著更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；第6、7天時(shí)，MCF7細(xì)胞增殖抑制率較其他2種細(xì)胞顯著更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率最高可達(dá)37.31%～41.42%，詳見表1。以上結(jié)果表明，Ad-GFP-C197對3種腫瘤細(xì)胞均有顯著的增殖抑制作用。

4 討論

腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的最大區(qū)別之一是90%以上的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出端粒酶活性，而端粒酶可以延長端粒，使腫瘤細(xì)胞得以永生，因此其成為區(qū)別腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的重要標(biāo)志之一[15-16]。端粒酶除了能通過延長端粒促進(jìn)腫瘤生長外，還能通過與Wnt信號(hào)通路的β-catenin及轉(zhuǎn)錄因子Brg1結(jié)合，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生相關(guān)靶基因（如c-myc）表達(dá)[17-18]、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[19]、抑制活性氧簇（ROS）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]等作用。

人端粒酶主要由hTR、有逆轉(zhuǎn)錄活性的hTERT和端粒相關(guān)蛋白組成，hTERT是人端粒酶活性的限速酶，其表達(dá)異常增加通常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的前期標(biāo)志[21]。hTERT含有1 132個(gè)氨基酸，主要有3個(gè)功能部分，即與hTR結(jié)合的N端、逆轉(zhuǎn)錄區(qū)、與DNA結(jié)合的C端。hTERT C端是端粒酶與染色體末端DNA 3′ 端懸突結(jié)合的功能區(qū)，是端粒酶活性的重要部分[22]。與高度保守的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)不同，C端同源性較弱、保守性較低，是hTERT與其他逆轉(zhuǎn)錄酶的主要區(qū)別之一，也是特異性抑制端粒逆轉(zhuǎn)錄酶的重要靶位[23]。hTERT的C端含有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和定位區(qū)，也是其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行端粒末端復(fù)制所必需的結(jié)構(gòu)域，因此筆者推測，當(dāng)C197在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)后，因?yàn)槠浜邢鄳?yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，能競爭性與hTERT的底物DNA 3′端懸突結(jié)合，從而抑制細(xì)胞內(nèi)hTERT活性，使細(xì)胞內(nèi)的hTERT無法結(jié)合到Wnt通路啟動(dòng)子上，使該通路受到抑制，進(jìn)而起到抗腫瘤作用?；诖?，本課題組選擇C197進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制作用研究。

目前抑制端粒酶活性的抗腫瘤化合物有很多，如端粒酶抑制劑GRN163L、G-四聯(lián)體穩(wěn)定劑Telomestatin等。其中GRN163L已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，但進(jìn)展緩慢，效果也難以令人滿意，這是因?yàn)槎肆Ｃ敢种苿┳饔糜诙肆Ｃ负笮枰^長的時(shí)間才能表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這一過程一般需要20 d左右，而在體內(nèi)給藥時(shí)這一過程更長[24]。在這個(gè)漫長的過程中，許多腫瘤細(xì)胞的端粒依然得以維持或代償，使得上述抗腫瘤化合物難以發(fā)揮抑制端粒酶的理想效果[25]。

本課題組前期研究對Ad-GFP-C197的表達(dá)載體進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，在C197的N端加上了6個(gè)His標(biāo)簽，這不但有利于檢測C197基因片段的表達(dá)，而且便于后續(xù)的蛋白純化[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ad-GFP-C197感染后，C197在SGC7901細(xì)胞、MCF7細(xì)胞、CaCO2細(xì)胞中均能高水平地表達(dá)；而且上述3種細(xì)胞的增殖均受到顯著抑制，且從第2～3天起即開始表現(xiàn)出增殖抑制現(xiàn)象，起效迅速。這表明，Ad-GFP-C197克服了其他端粒酶抑制劑起效慢的缺點(diǎn)，能夠迅速發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，Ad-GFP-C197能夠在SGC7901細(xì)胞、MCF7細(xì)胞、CaCO2細(xì)胞中高水平表達(dá)C197，且對3種腫瘤細(xì)胞均有顯著且迅速的增殖抑制作用。但C197能否對腫瘤細(xì)胞中hTERT的表達(dá)也產(chǎn)生影響尚不完全明確，其抗腫瘤作用機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-01-24 修回日期：2018-08-24）

（編輯：段思怡）