響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶對沙棘低聚糖提取率影響的研究

張磊　薛雨菲　王琳　孫乾　張愛琴　孔令明

[摘要]本試驗(yàn)以沙棘粕為原料，加入適量纖維素酶經(jīng)酶解反應(yīng)后得沙棘低聚糖，以低聚糖提取率為測定指標(biāo)，同時(shí)采用單因素及響應(yīng)面對酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：酶解pH為6，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為4.5h，纖維素酶添加量條件為0.4%，在此條件下測得沙棘低聚糖的提取率為42.81%，沙棘低聚糖的含量為84%。通過試驗(yàn)，對沙棘提取低聚糖工藝進(jìn)行深入研究，利用響應(yīng)面優(yōu)化得出確定最佳條件，為進(jìn)一步開放沙棘低聚糖的提取提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]沙棘粕；低聚糖；纖維素酶；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：TS249 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180320

沙棘屬胡頹子科，又名黑刺、酸刺、沙棗。作為一種抗沙化植物，主要分布在我國西北、西南、華北等地區(qū)。沙棘具有抗腫瘤、抗心血管疾病和免疫調(diào)節(jié)等藥用價(jià)值。在沙棘加工過程中，沙棘粕為沙棘籽脫脂后的工業(yè)廢料，一般被丟棄，造成資源浪費(fèi)。沙棘粕中含有較多纖維素，蛋白質(zhì)含量為20%左右，糖分含量為11.35%左右，脂肪含量為10.9%左右，除此之外含有維生素、氨基酸等成分。沙棘粕中仍然富含黃酮、原花青素等物質(zhì)，具有清除自由基、抗氧化等作用。如今，沙棘越來越引起學(xué)者們的關(guān)注，但目前有關(guān)于沙棘低聚糖提取工藝的研究較少，低聚糖作為生理活性物質(zhì)，廣泛用于營養(yǎng)保健、疾病防治、植物生長等方面。降解低聚糖的方法主要有化學(xué)法和酶解法兩種?；瘜W(xué)法對反應(yīng)的進(jìn)程不易控制，且利用此方法的產(chǎn)物不適宜直接應(yīng)用在食品領(lǐng)域，而酶解法條件溫和。文章在單因素的基礎(chǔ)上研究了響應(yīng)面分析纖維素酶協(xié)同提取沙棘粕低聚糖，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為沙棘籽粕中低聚糖資源更好地開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

沙棘粕，沙棘籽經(jīng)提油后剩余物；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司，酶活力200 000U/g；DNS試劑，上海生工生物工程有限公司；葡萄糖，苯酚；檸檬酸，硫酸。所用試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1810PC型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JB-3A型恒溫磁力加熱攪拌器，雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；AL204-1C型分析天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司；TU-1810PC型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1原料預(yù)處理

低溫脫脂后的沙棘粕多次洗滌除去其水溶性雜質(zhì)，將原料烘干后干燥粉碎，過60目篩備用。

1.3.2低聚糖的制備

將粉碎過篩的沙棘粕粉加入一定體積的檸檬酸緩沖溶液，配制成底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的懸濁液，調(diào)節(jié)其pH值后，加入適量的纖維素酶，在設(shè)定溫度下選用磁力攪拌器攪拌加速酶解一定的時(shí)間，高溫滅酶15min，冷凍干燥得到沙棘低聚糖粗提物。

1.3.3低聚糖總糖含量的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。采用苯酚硫酸法測樣品中總糖含量，采用DNS法樣品還原糖含量。

苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖10mg于100mL容量瓶中，配成0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，搖勻后加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，震蕩搖勻冷卻，在室溫條件下放置20min后于490nm測吸光值，以2.0mL水做空白，繪制苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線。

DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線：將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）0.2mL、0.4mL、0.6mL，0.8mL、1.0mL于15mL試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1.0mL，分別準(zhǔn)確加入DNS試劑2mL，沸水浴加熱2min，流水冷卻，用水補(bǔ)足到15mL刻度。在540nm波長下測定吸光度，繪制DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品測定。沙棘低聚糖粗提物質(zhì)量測定低聚糖提取率，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出總糖含量以及還原糖質(zhì)量，根據(jù)以下公式計(jì)算得出低聚糖含量。

1.4酶法提取低聚糖粗提物的單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)選取了纖維素酶解過程中的酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量為單因素，測定其低聚糖的提取率，在此單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，以低聚糖的提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)的低聚糖提取工藝。

2結(jié)果與分析

2.1苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為標(biāo)品測得苯酚硫酸法標(biāo)曲，如圖1所示，可得線性回歸方程：

2.2DNS葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為標(biāo)品測得DNS葡萄糖法標(biāo)曲，如圖2所示，可得線性回歸方程：

2.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1酶解pH對沙棘低聚糖提取率的影響

在其他條件不變的情況下，即酶解溫度為50%，酶解時(shí)間為3h，酶添加量為0.3%的條件下，改變酶解的pH值，沙棘低聚糖的提取率變化如圖3所示。從圖3中可以看出，沙棘的提取率隨著pH的增大有大幅度的提高，但是在pH超過5.5后，提取率有所下降，可能是由于pH的過大會(huì)影響纖維素酶的酶活，從而降低了沙棘低聚糖的提取率，因此為了得到較高的提取率，酶解pH應(yīng)控制在5.5左右。

2.3.2酶解溫度對沙棘低聚糖提取率的影響

保持其他的影響因素不變，酶解pH為5，酶解時(shí)間3h，纖維素酶添加量為0.3%，測在不同溫度下沙棘低聚糖的提取率，結(jié)果如圖4所示。纖維素酶在溫度為50%時(shí)，沙棘低聚糖的提取率達(dá)到最大值，在大于50%后提取率有劇烈的下降，主要是由于纖維素酶的溫度高于60 qC易變性失活，導(dǎo)致低聚糖的提取率下降。

2.3.3酶解時(shí)間對沙棘低聚糖提取率的影響

在一定條件下，酶解的時(shí)間越長，酶解的程度越徹底，酶解的效果也會(huì)越好。保持酶解的其他條件不變，酶解溫度為50%，酶解pH為5，纖維素酶的添加量為0.3%，逐漸增加酶解的時(shí)間，得到沙棘低聚糖提取率隨酶解時(shí)間的變化如圖5所示，但在酶解時(shí)間在4h后，隨著酶解時(shí)間的延長，沙棘低聚糖的提取率提高不明顯，可能是由于4h纖維素幾乎都已酶解，考慮選4h為最佳酶解時(shí)間。

2.3.4酶添加量對沙棘低聚糖提取率的影響

保持其他的酶解條件不變，酶解溫度為50%，酶解pH為5，酶解時(shí)間4h，調(diào)節(jié)纖維素酶的添加量，沙棘低聚糖的提取率如圖6所示?？芍诘孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，添加的纖維素酶越多，酶解越快，酶解的越徹底，但是纖維素酶添加到一定程度后，足以滿足底物的酶解而達(dá)到平衡，過多的添加反而是一種浪費(fèi)，并沒有提高沙棘低聚糖的提取率，因此綜合考慮纖維素酶的添加量應(yīng)為0.4%。

2.4響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1響應(yīng)面試驗(yàn)的建立

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，以酶解pH（X₁）、酶解溫度（X₂）、酶解時(shí)間（X₃）、酶添加量（X₄）為自變量，以沙棘低聚糖的提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1所示。

2.4.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

采用Design-expert8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出的回歸方程為：

方程決定系數(shù)（R²）為0.945 1，說明了該回歸方程適用于沙棘低聚糖提取率的理論預(yù)測。響應(yīng)面分析結(jié)果如表2所示，對所得方程做顯著性檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果如表3所示。

從表3可以得知該模型影響是極顯著的（P<0.000 1），因變量和自變量之間線性關(guān)系顯著，模型決定系數(shù)為0.945 1，說明模型能解釋94.51%的響應(yīng)值變化，擬合程度較好。失擬項(xiàng)P=0.237 0>0.05，不顯著，說明其二次回歸方程高度顯著，能很好地對響應(yīng)面進(jìn)行預(yù)測。

從表3中可以看出該模型的一次項(xiàng)pH（X₁）、溫度（X₂）、時(shí)間（X₃）影響極顯著，酶添加量（X₄）影響不顯著；二次項(xiàng)X₂²、X₃²、X₄²影響極顯著，二次項(xiàng)X₁²影響顯著；交互項(xiàng)X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃<0.05，影響顯著，交互項(xiàng)X₁X₄、X₂X₄、X₃X₄影響不顯著。說明在試驗(yàn)中pH、溫度、時(shí)間與酶的添加量交互作用小，無基本影響。各因素的影響順序?yàn)閜H>溫度>時(shí)間>酶添加量。

2.4.3響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)面和等高線圖，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，反應(yīng)各因素之間的交互作用，分析各因素對響應(yīng)值的影響，結(jié)果如圖7～圖10所示。

響應(yīng)面的曲面斜度確定兩者對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，說明兩因素交互作用越顯著。等高線的形狀可以反映交互項(xiàng)的影響大小，等高線越密集，呈橢圓形，則表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示兩因素交互作用不明顯。

由圖7可以看出，隨著pH和溫度的增加，低聚糖提取率也隨之上升，從等高線可以看出，呈現(xiàn)橢圓狀，說明pH和溫度因素相互作用顯著，與回歸方差分析結(jié)果相符。由圖8可以看出，沙棘粕低聚糖提取率隨著時(shí)間和pH的增加逐漸升高，時(shí)間和pH較高時(shí)，提取率的曲面較陡峭，從等高線圖觀察可知曲線呈橢圓狀，說明時(shí)間與pH交互作用顯著。由圖9可以看出，曲面在添加量方向上升后下降，曲面未呈現(xiàn)傘狀，說明添加量與pH的交互作用不顯著。由圖10可以看出，隨著溫度與時(shí)間的增加，曲面呈現(xiàn)陡峭上升，等高線呈現(xiàn)十分明顯橢圓狀，說明溫度與時(shí)間的交互作用明顯。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出最優(yōu)條件為：酶解pH為5.95，酶解溫度為49.83℃，酶解時(shí)間為4.51h，纖維素酶添加量為0.42%，在此條件下最大提取率42.95%。

3結(jié)論

根據(jù)苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線與DNS葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對沙棘粕低聚糖粗提物的總糖與還原糖進(jìn)行測定，以低聚糖提取率為指標(biāo)，應(yīng)用Design-expert8.0軟件，采用Box-Behnken建立了酶解pH（X₁）、酶解溫度（X₂）、酶解時(shí)間（X₃）、酶添加量（X₄）之間數(shù)學(xué)模型，即：

所得回歸模型與實(shí)際情況擬合度較高，具有實(shí)用價(jià)值。通過顯著性試驗(yàn)，各因素的影響順序?yàn)椋簆H>溫度>時(shí)間>酶添加量。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定沙棘粕低聚糖最佳提取條件為酶解pH為6，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為4.5h，纖維素酶添加量條件為0.4%，在此條件下測得沙棘低聚糖的提取率為42.81%，沙棘低聚糖的含量為84%。與模型預(yù)測值相差不大，提取效果較好。