不同穩(wěn)定化方法對(duì)麥胚抗氧化活性的影響研究

許蓓蓓　王振濤　黃永軍　周建新

[摘要]本研究以還原力、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo)，比較不同穩(wěn)定化方法對(duì)麥胚抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，不同穩(wěn)定化方法處理麥胚蛋白的抗氧化活性均隨質(zhì)量濃度的提高而增加，同一麥胚蛋白濃度時(shí)，還原力和DPPH自由基清除率差別較小，且與未處理后的麥胚蛋白較為接近，超氧陰離子自由基清除率均有降低趨勢(shì)，且低于未處理麥胚蛋白。麥胚蛋白酶解有助于提高抗氧化活性。

[關(guān)鍵詞]穩(wěn)定化方法；麥胚；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180309

麥胚是面粉生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物之一，具有高達(dá)30%的蛋白質(zhì)含量，而且麥胚蛋白是一種全價(jià)蛋白，能滿足人體所必需的8種氨基酸，還蘊(yùn)含著許多具有生理活性的氨基酸序列。目前，脫脂麥胚的抗氧化活性已被很多研究證實(shí)，Adom等研究了麥粒各部分的體外抗氧化活性，結(jié)果表明麥胚抗氧化活性明顯強(qiáng)于麥粒的其他部分。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分子質(zhì)量在1500以下的麥胚蛋白水解物顯示的各種體外抗氧化活性指標(biāo)均較高。麥胚中具有抗氧化活性作用的主要是肌肽和谷胱甘肽，以及蛋白質(zhì)被酶解之后獲得的抗氧化肽。麥胚的抗氧化性提取物可以作為某些功能食品的基料，或者直接食用，起到增強(qiáng)人體免疫力、延緩機(jī)體衰老、減少一些自由基對(duì)機(jī)體損傷的作用。目前已被證實(shí)具有抗氧化活性的天然肽大多都是通過酶解蛋白質(zhì)獲得的，水解脫脂蛋白能顯著提高麥胚的抗氧化活性。

本研究通過測(cè)定還原力、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率等指標(biāo)，比較酶解前后，不同穩(wěn)定化方法處理麥胚水解物的抗氧化活性。

1材料與方法

1.1材料與試劑

小麥胚：淮安市新象面粉有限公司；福臨門一級(jí)大豆油：中糧集團(tuán)；氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、SDS、正己烷等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

JR-Y10臭氧滅菌箱：南京金仁環(huán)保科技有限公司；HG101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；P70D20TL-D4微波爐：格蘭仕微波爐電器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；722光柵分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SYQ-DSX-280B不銹鋼壓力蒸氣滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；IKAT18高速分散機(jī)：北京中聯(lián)科儀科技有限公司；酶標(biāo)儀：美國Bio Tek公司。

1.3麥胚穩(wěn)定化處理方法

烘烤處理：料層厚1～2em，110℃烘干30min，待溫度自然降到室溫后用聚乙烯自封袋包裝；微波處理：料層厚1～2em，600W處理2min，待溫度自然降到室溫后用聚乙烯自封袋包裝；高壓蒸汽處理：料層厚1～2em，0.1MPa處理20min，冷風(fēng)干燥20min；臭氧處理：雙層紗布包裝麥胚置于臭氧滅菌箱的滾筒內(nèi)，80mg/mL處理15min，取出，用聚乙烯自封袋包裝。

1.4脫脂麥胚蛋白的制備

穩(wěn)定化處理后的麥胚用80%乙醇清洗，45℃烘干12h，置于錐形瓶中，按1：5（M/V）的比例加入正己烷，恒溫振蕩箱浸泡12h，倒掉上清液，再按1：3（M/V）的比例加入正己烷，恒溫振蕩箱浸泡12h，倒掉上清液，低溫烘干，獲得脫脂麥胚。粉碎，全部過80目篩，將細(xì)化的樣品按料水比為1：20（g/mL）攪拌均勻，用0.5mol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)至9.0，攪拌浸提30min，浸提液3 500dmin離心20min，取上清液，然后用1.0mol/L的HCl溶液將上清液的pH值調(diào)至6.3，加入適量的淀粉酶，并置于60℃的水浴鍋中，酶解至遇碘不呈藍(lán)色為止，將溶液pH值調(diào)為4.0，然后離心去上清液，冷凍干燥得脫脂麥胚蛋白。

1.5脫脂麥胚蛋白的酶解

利用堿性蛋白酶在50%、pH8.0、加酶量6.0%、底物濃度4.0%的條件下進(jìn)行酶解3h，沸水浴滅酶10min，冷卻后冷凍干燥備用。

1.6還原力的測(cè)定

取冷凍干燥后的脫脂麥胚蛋白，配制質(zhì)量濃度為0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL、lO.Omg/mL的脫脂麥胚蛋白液，取0.8mL各濃度液，分別加入1.6mI&2mol/L（pH6.6）的磷酸鹽緩沖液，2.0mL1%的鐵氰化鉀溶液，混合后于50℃恒溫水浴中反應(yīng)20min，取出冷卻，再加入2.0mL10g/mL的三氯乙酸溶液，混合均勻后3 500r/min離心10min，取2.0mL上清液，并加入2.0mL蒸餾水和0.4mL0.1g/mL的三氯化鐵溶液，混合均勻，室溫靜置30min，在波長700nm處測(cè)定吸光度A，以相同質(zhì)量濃度的V_C做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.7DPPH自由基清除率的測(cè)定

取冷凍干燥后的脫脂麥胚蛋白，配制質(zhì)量濃度分別為0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL的梯度液，取ZOnaL，加入2.0mL1.0×10^-4md/L的DPPH自由基無水乙醇溶液，混合均勻，室溫下避光反應(yīng)20min，取出，4 000r/min離心10min，取上清液在波長517nm處測(cè)定吸光度A_i，以2.0mL樣品和2.0mL無水乙醇溶液，測(cè)定其吸光度A_j，以相同質(zhì)量濃度的V_C做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。DPPH自由基清除率計(jì)算見公式（1）。

（1）

式中，A₀為未加樣品的DPPH自由基的吸光度；A_i為加樣品后的DPPH自由基的吸光度；A_j為樣品與無水乙醇混合后的吸光度。

1.8超氧陰離子自由基（O₂^-）清除率

取干燥潔凈的試管，向試管中依次加入1.0mLO.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，1.0mL0.001mol/L的EDTA溶液，再加入0.4mL質(zhì)量濃度分別為0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.Omg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL的脫脂麥胚蛋白液以及1.0mL0.000 4mol/L的鄰苯三酚溶液，混合均勻后，靜置反應(yīng)10min，再加入30μL0.1mol/L的二硫蘇糖醇溶液終止反應(yīng)，測(cè)定溶液在波長325nm處的吸光度A，以相同質(zhì)量濃度的V_C做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，樣品對(duì)O₂^-的清除能力，見公式（2）。

（2）

式中，An為鄰苯三酚與溶劑混合液的吸光度；A₁為鄰苯三酚與樣品反應(yīng)的吸光度；A₂為樣品與溶劑混合液的吸光度。

1.9數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)為三次平行試驗(yàn)的平均值，測(cè)定結(jié)果用EXCEL作圖，并進(jìn)行回歸分析。

2結(jié)果與分析

2.1穩(wěn)定化處理后脫脂麥胚蛋白酶解前抗氧化活性分析

2.1.1還原力

抗氧化劑是通過自身的還原作用來清除自由基，抗氧化活性正相關(guān)于還原力，700nm波長處吸光度的高低可以間接反映抗氧化劑的抗氧化活性，吸光度越大，還原力越強(qiáng)，說明抗氧化活性越高。由圖1可知，麥胚蛋白在酶解前，麥胚還原力隨蛋白濃度增加而升高，但是還原力水平較低，不同穩(wěn)定化處理麥胚蛋白的吸光度值相差很小，說明不同處理方法對(duì)未酶解麥胚蛋白的還原力影響較小。

2.1.2DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率是抗氧化性的一種反映，清除率越高，說明抗氧化活性越強(qiáng)。由圖2可知，V _C具有很高的DPPH自由基清除率，當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)達(dá)到了93.86%，不同穩(wěn)定化處理的麥胚蛋白的清除率不同，但其DPPH清除率均隨蛋白濃度的增加而升高，在低濃度時(shí)，不同處理麥胚蛋白的清除率比較接近，隨著蛋白濃度的增大增加較快，當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg，mL時(shí)，均能達(dá)到60%左右，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0mg/mL時(shí)，微波和臭氧處理后的麥胚顯示了較好的DPPH清除率，其清除率均高于未處理麥胚，反映在此濃度時(shí)其處理下的麥胚蛋白具有較高的抗氧化活性。

2.1.3超氧陰離子自由基（O₂^-）清除率

脂質(zhì)過氧化過程是一個(gè)產(chǎn)生自由基和自由基參與的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程，超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞損傷的一個(gè)重要方面就是使細(xì)胞的膜相系統(tǒng)發(fā)生過氧化，對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果反映了物質(zhì)的抗氧化能力。由圖3可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～10mg/mL時(shí)，V_C和不同穩(wěn)定化處理的麥胚蛋白水解

圖2不同穩(wěn)定化處理后麥胚蛋白酶解前的DPPH清除率物對(duì)自由基清除率不同，且隨著蛋白濃度的增加而不斷升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，V_c對(duì)O₂^-的清除率達(dá)到98.3 1%，未處理麥胚蛋白在此時(shí)顯示出較高的清除率，高于臭氧處理和不同熱處理下的麥胚蛋白的O₂^-清除率，說明經(jīng)過不同處理后的麥胚蛋白超氧陰離子自由基清除率反映的抗氧化活性均有所降低。

2.2穩(wěn)定化處理后脫脂麥胚蛋白酶解后抗氧化活性分析

2.2.1還原力

不同穩(wěn)定化方法處理后，脫脂麥胚蛋白酶解后的還原力如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～10mg/mL時(shí)，不同處理后的酶解麥胚蛋白的還原力先緩慢增加后逐漸增大，但遠(yuǎn)低于V_C。在低濃度時(shí)，臭氧和微波處理后的麥胚蛋白的還原力與未處理麥胚相差較小，隨著麥胚蛋白濃度的增加，未處理和臭氧處理的麥胚蛋白的還原力增加較高，高于微波處理的麥胚蛋白，說明臭氧處理對(duì)麥胚蛋白的還原力影響較小。

2.2.2DPPH自由基清除率

不同穩(wěn)定化處理后脫脂麥胚酶解后的DPPH自由基清除率如圖5所示。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～10mg/mL時(shí)，V_C和不同方法處理的麥胚蛋白水解物對(duì)DPPH的清除率均隨質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，但不同處理麥胚蛋白水解物變化過程有所不同。臭氧處理麥胚蛋白水解物清除率變化趨勢(shì)與未處理麥胚蛋白較為相似，當(dāng)質(zhì)量濃度為5mg/mL時(shí)趨于平緩，分別達(dá)到84.48%、84.89%。微波處理麥胚蛋白水解物清除率則在1.0mg/mL后趨于平緩，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時(shí)，其清除率已達(dá)到81.87%，當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，V_C、未處理麥胚水解物、臭氧處理麥胚水解物、微波處理麥胚水解物對(duì)DPPH自由基的清除率分別達(dá)到93.86%、84.89%、84.16%、82.74%，說明不同處理對(duì)麥胚DPPH自由基清除率影響差別不大。

2.2.3超氧陰離子自由基（O₂^-）清除率

麥胚蛋白水解物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率如圖6所示?？梢钥闯?，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.1～10mg/mE時(shí)，V_C以及不同處理的麥胚蛋白水解物對(duì)O₂^-的清除率均隨質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，但不同處理麥胚蛋白水解物變化過程有所不同。當(dāng)質(zhì)量濃度低于1.0mg/mL時(shí)，微波處理麥胚蛋白的水解物的清除率與未處理麥胚蛋白較為接近，臭氧處理麥胚蛋白水解物的清除率均低于未處理和微波處理的麥胚蛋白水解物。當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，V_C、未處理麥胚水解物、微波處理麥胚水解物、臭氧處理麥胚水解物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別達(dá)到88.31%、63.56%、52.99%、48.85%。

3結(jié)論

以還原力、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo)，比較不同穩(wěn)定化方法處理后麥胚的抗氧化活性。研究表明，酶解后麥胚的抗氧化活性明顯高于酶解之前，不同穩(wěn)定化方法處理麥胚的抗氧化活性變化趨勢(shì)基本一致，均隨質(zhì)量濃度的增加而不斷增加。同一麥胚蛋白濃度時(shí)，其還原力和DPPH自由基清除率差別較小，且與未處理麥胚較為接近，超氧陰離子自由基清除率均有降低趨勢(shì)，且低于未處理麥胚，說明以還原力和DPPH自由基清除率表現(xiàn)的抗氧化活性受不同穩(wěn)定化方法的影響較小，超氧陰離子自由基清除率表現(xiàn)的抗氧化活性受不同處理方法影響較大。通過比較不同穩(wěn)定化方法下麥胚抗氧化活性指標(biāo)，明確了不同穩(wěn)定化方法對(duì)麥胚抗氧化活性的影響，對(duì)麥胚蛋白開發(fā)利用時(shí)選擇合適的處理方法提供依據(jù)。