膠體金免疫層析法快速檢測(cè)乳制品中重金屬離子鉛

趙小旭　柳家鵬　柴艷兵　張耀廣　楊敏　滕燕　李曼　郭健

[摘要]本研究建立了快速檢測(cè)乳制品中重金屬離子鉛的膠體金免疫層析試紙條分析方法。通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，研究了該方法的靈敏度、重復(fù)性和特異性，結(jié)果表明用免疫膠體金法測(cè)定乳制品中生鮮乳和酸奶的檢出限為25～g/kg，成品奶的檢出限為30μg/kg，奶粉和奶酪的檢出限為300μg/kg，方法重現(xiàn)性較好。使用膠體金免疫層析法和原子吸收光譜法同時(shí)檢測(cè)加標(biāo)樣品，結(jié)果一致。該方法適用于乳制品中重金屬離子鉛的快速檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞]鉛；膠體金免疫層析法；乳制品

中圖分類號(hào)：X836 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180308

鉛是對(duì)人類健康有巨大毒害作用的金屬元素之一，對(duì)人體沒(méi)有任何有益的功能。當(dāng)人體中鉛含量升高時(shí)，會(huì)破壞血紅蛋白的合成，造成貧血、血壓增高、腎損傷，造成孕婦流產(chǎn)和墮胎，破壞神經(jīng)中樞，影響腦發(fā)育，影響生育能力，造成小孩發(fā)育遲緩和行為沖動(dòng)。乳品是一種營(yíng)養(yǎng)成分齊全，含量高并且易被人體吸收的食品，已成為國(guó)民攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要途徑之一。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，重金屬污染日益加重，隨食物鏈進(jìn)入動(dòng)、植物體內(nèi)，使得乳制品受到污染。

目前常見(jiàn)的重金屬離子的檢測(cè)方法主要是石墨爐原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，這些方法需要費(fèi)用高昂的大型儀器設(shè)備、專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室、專業(yè)的操作技術(shù)人員和復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩選檢測(cè)。

目前也有采用膠體金免疫層析法檢測(cè)重金屬離子鉛，但是主要集中于糧食作物，針對(duì)乳制品的研究較少。因此本文基于膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)乳制品中重金屬鉛的含量具有必要性，并且對(duì)于乳品企業(yè)來(lái)說(shuō)具有實(shí)際意義。

1材料與方法

1.1主要儀器

干式加熱器（HMG-GS，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）、膠體金讀數(shù)儀（BMZ6000，北京美正生物科技有限公司）、200μL移液器（賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司）、計(jì)時(shí)器（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）、離心管（50mL、20mL，潔特）、槍頭（BIOFIL）、一次性手套（麥迪康）、離心機(jī)（DM0412，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司）、原子吸收光譜儀（PinAAele900T，perkinelmer公司）、渦旋混合器（TZL-5013，蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、分析天平（PL-602E，梅特勒一托利多分析天平）、20目篩網(wǎng)。

1.2主要試劑

三氯甲烷、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、EDTA等。

1.3方法

1.3.1檢測(cè)原理

重金屬離子鉛定性檢測(cè)試紙條應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制膠體金免疫層析的原理，結(jié)構(gòu)如圖1所示。將金標(biāo)抗體結(jié)合在金標(biāo)墊/微孔中，將抗原（T線）和二抗（C線）固定于NC膜上，當(dāng)待測(cè)樣品加到樣品墊/微孔中后，樣本中抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合，通過(guò)層析作用向前移動(dòng)。當(dāng)移至T線區(qū)域時(shí)，偶聯(lián)抗原和未結(jié)合金標(biāo)抗體結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)線（T線）上，剩余金標(biāo)抗體越過(guò)檢測(cè)線（T線），在質(zhì)控線（c線）處與二抗結(jié)合顯色。通過(guò)可目測(cè)的膠體金標(biāo)記物得到直接的顯色結(jié)果或者配合儀器判讀。

1.3.2檢測(cè)方法

1.3.2.1樣品前處理

（1）生鮮乳：量取生鮮乳10mL，置于50mL離心管中，加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇，振蕩5min，4 00～min離心5min；移取200μL的PBS溶液（0.01M）和200μL的EDTA（0.5M），置于2mL離心管中，加入40μL上清，振蕩均勻，1min內(nèi)待檢。

（2）成品奶、奶粉、酸奶、奶酪樣本處理方法。成品奶取樣方法：量取10mL成品奶，置于50mL離心管中；奶粉取樣方法：稱取1g奶粉，置于50mL離心管中，加入9mL純凈水；酸奶取樣方法：稱取10g酸奶，置于50mL離心管中；奶酪取樣方法：奶酪粉碎，稱取1g粉碎的奶酪，置于50mL離心管中，加入9mL純凈水，震蕩3min。按照上述方法取樣后，加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇震蕩5min，4 000r/min離心5min；移取200μL的PBS溶液（0.01M）和200μL的EDTA（0.5M）于2mL離心管中，加入50μL上清，振蕩均勻，1min內(nèi)待檢。

1.3.2.2檢測(cè)步驟

（1）取所需數(shù)量的微孔和試紙條，并做好標(biāo)記，將微孔置于40%干式加熱器上。

（2）用移液器取200μL待檢樣本加入微孔，并反復(fù)吸打，直至紅色固體充分混勻進(jìn)行孵育，計(jì)時(shí)5min。

（3）將試紙條立即插入微孔中進(jìn)行反應(yīng)，計(jì)時(shí)5min。

（4）取出試紙條，去除下端樣品墊進(jìn)行結(jié)果判讀，實(shí)驗(yàn)完畢后將試紙條放入盒中密封，2℃～8℃保存。

2結(jié)果與分析

2.1結(jié)果判定

試紙條檢測(cè)結(jié)果的判定分為肉眼判定和讀數(shù)儀讀數(shù)判定兩種方式，具體的判定方式可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

2.1.1肉眼判定

膠體金免疫層析法結(jié)果判定如圖2所示。當(dāng)T線和C線同時(shí)出現(xiàn)紅色帶時(shí)，若T線顏色較C線深或者顏色相同，表示樣品中待檢物質(zhì)濃度低于檢測(cè)限，或不含待檢物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果為陰性；若T線顏色較C線淺或T線未顯色，則表示樣品中待檢物質(zhì)濃度高于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；若c線未顯色，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，可能是因?yàn)椴僮鬟^(guò)程不正確或試紙條已失效。

2.1.2讀數(shù)儀讀數(shù)判定

打開(kāi)樣品卡殼，將定量試紙條插入樣品卡殼槽內(nèi)，保證白色NC膜表面的兩條色帶在卡殼視窗中間。將樣品卡殼插入讀數(shù)儀樣品卡槽中，按照儀器操作程序，點(diǎn)擊觸屏“檢測(cè)”鍵或“TEST”按鈕，讀取結(jié)果。當(dāng)樣本不含待測(cè)物或低于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為陰性；當(dāng)樣本所含待檢物介于半檢測(cè)限和檢測(cè)限之間時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為疑似陽(yáng)性；當(dāng)樣本所含待檢物高于檢測(cè)限時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.2檢出限實(shí)驗(yàn)

目前市場(chǎng)上乳制品種類繁多，本實(shí)驗(yàn)選取生鮮乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪5類樣品進(jìn)行檢出限實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。分別取三個(gè)批次的重金屬離子鉛膠體金試紙條進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，生鮮乳、成品奶、酸奶的添加量為25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg。奶粉和奶酪的添加量為200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg。上述加標(biāo)樣品重復(fù)6次進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，生鮮乳和酸奶的檢出限為25μg/kg，成品奶的檢出限為30μg/kg，奶粉和奶酪的檢出限為300μg/kg。由于每個(gè)乳制品生產(chǎn)加工的工藝不同，所以樣品基質(zhì)復(fù)雜多樣，為了保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)和準(zhǔn)確性，所以需要對(duì)每類產(chǎn)品的檢出限進(jìn)行評(píng)定，以確定相應(yīng)樣品的檢出限。從表1可以看出，不同批次的試紙條檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異，所以在進(jìn)行檢出限評(píng)定時(shí)，選擇3個(gè)批次的試紙條進(jìn)行試驗(yàn)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

選取生鮮乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪分別進(jìn)行檢測(cè)本底樣品、1倍檢出限和2倍檢出限加標(biāo)樣品，選取3個(gè)批次的產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本使用不同批次的試紙條同時(shí)檢測(cè)6次，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，用3個(gè)批次的重金屬離子鉛檢測(cè)本底樣品時(shí)，結(jié)果均為陰性，當(dāng)添加量為1倍檢出限和2倍檢出限時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。通過(guò)檢測(cè)結(jié)果可知，結(jié)果一致，產(chǎn)品重復(fù)性好。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

選取上述5類樣品中的一種代表性樣品，分別添加重金屬離子鉛標(biāo)準(zhǔn)品，制成陽(yáng)性樣品。然后用3個(gè)批次的重金屬離子鉛的膠體金試紙條分別平行檢測(cè)2次，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)上述樣品用相同的方法連續(xù)檢測(cè)7天，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明重金屬離子鉛膠體金試紙條日內(nèi)、日問(wèn)的穩(wěn)定性較好，試紙條保存在2℃～8℃，12個(gè)月保質(zhì)期內(nèi)仍可以特異性檢出陽(yáng)性，并且靈敏度沒(méi)有降低。

2.5特異性實(shí)驗(yàn)

為了檢測(cè)重金屬鉛膠體金試紙條對(duì)其他重金屬離子的識(shí)別能力及檢測(cè)特異性，將常見(jiàn)的重金屬離子汞、離子鉻、離子銅、離子鎘添加到上述5類樣品中，與重金屬鉛膠體金免疫層析試紙條做交叉反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果顯示，重金屬鉛膠體金試紙條能夠清晰地識(shí)別鉛離子，與其他幾種重金屬離子沒(méi)有交叉反應(yīng)，試紙條的特異性良好。

2.6與儀器法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

膠體金試紙條的檢出限與儀器法的檢出限存在一定的差異，目前我國(guó)食品中重金屬的檢測(cè)方法大部分企業(yè)采用GB 5009.12-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測(cè)定》石墨爐原子吸收光譜法（該方法的檢出限為0.02mg/kg，定量限為0.04mg/kg檢測(cè)乳制品中的重金屬離子鉛。為比對(duì)兩種測(cè)定方法，選擇陰性樣品和添加量為0.5mg/kg的陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，這樣能夠有效地保證在標(biāo)準(zhǔn)之下兩種方法均能有效檢出，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，表明試紙表3試紙條法和原子吸收光譜法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比條可用于生鮮乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪中重金屬離子鉛的快速篩選檢測(cè)。

2.7注意事項(xiàng)

為了杜絕檢測(cè)過(guò)程中一些不適宜因素導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)異常，需要注意以下幾點(diǎn)：（1）不同批次試紙條、微孔、射頻卡均不能混用。（2）產(chǎn)品為一次性消耗品，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用。（3）請(qǐng)勿觸摸試紙條中央白色膜區(qū)。（4）微孔打開(kāi)時(shí)不要用力過(guò)猛，以免有粉末飛出，打開(kāi)后請(qǐng)盡快使用，以免影響檢測(cè)結(jié)果。（5）所檢測(cè)樣本必須為均勻液體，不能有結(jié)塊、發(fā)酵、酸敗、沉淀等現(xiàn)象。（6）所有溶液使用前需搖勻，試劑B會(huì)有沉淀出現(xiàn)，但不影響結(jié)果。（7）溶液移取時(shí)請(qǐng)帶保護(hù)性手套及口罩進(jìn)行操作。（8）建議一次檢測(cè)數(shù)量不要超過(guò)8個(gè)，超過(guò)8個(gè)可分批檢測(cè)。（9）檢測(cè)時(shí)避免陽(yáng)光直射和電風(fēng)扇直吹。（10）請(qǐng)勿用自來(lái)水、純水及蒸餾水做陰性對(duì)照。（11）如發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果需要使用法定的確證方法進(jìn)行確證。

3結(jié)論

通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，重金屬離子鉛膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)時(shí)間在15min內(nèi)，生鮮乳和酸奶的檢出限為25μg/kg，成品奶的檢出限為30μg/kg，奶粉和奶酪的檢出限為300μg，kg。批間重復(fù)性和批內(nèi)重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果與儀器法檢測(cè)結(jié)果一致。方法簡(jiǎn)便，對(duì)人員專業(yè)技能要求相對(duì)較低，并且其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等均達(dá)到了食品中污染物快速檢測(cè)的要求，非常適用于乳品企業(yè)前期的篩選工作。