土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗光合特性和保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響

翁可佳　沙爾格　沙馬五?！〗鸸盼橹А●R丹煒

摘要：[目的]探討土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗光合特性和保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響，為揭示土荊芥的入侵機(jī)制提供理論依據(jù)。[方法]采用表皮條分析法和盆栽試驗(yàn)，分析土荊芥腐解液作用下蠶豆幼苗株高、地上部鮮重和干重、葉面積、實(shí)際光化學(xué)效率（ФPsⅡ）和最大光化學(xué)效率（F_v/F_m）等指標(biāo)的變化情況，并檢測保衛(wèi)細(xì)胞的活性及細(xì)胞核異常率。[結(jié)果]土荊芥腐解液處理蠶豆幼苗的葉面積變化不明顯，但地上部生物量和株高顯著下降（P<0.05，下同），且具有時(shí)間和濃度依賴性；土荊芥腐解液處理蠶豆葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)F_v/F_M和ФPsⅡ均發(fā)生不同程度變化，但與對(duì)照（CK）均無顯著差異（P>0.05）。在土荊芥腐解液的作用下，蠶豆葉片的保衛(wèi)細(xì)胞活性降低，細(xì)胞核出現(xiàn)錯(cuò)位、固縮、拉長或降解等畸變特征；隨腐解液濃度的增加，保衛(wèi)細(xì)胞死亡率及細(xì)胞核畸變率顯著升高。[結(jié)論]土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗的光反應(yīng)影響不明顯，但其較強(qiáng)的細(xì)胞毒性能引起葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生畸變，活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致幼苗氣孔運(yùn)動(dòng)受阻，吸收c02的能力下降，光合效率降低而影響幼苗生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：土荊芥腐解液；蠶豆幼苗；化感作用；細(xì)胞毒性；光合特性

中圖分類號(hào)：S643.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0530-06

0引言

[研究意義]土荊芥（Chenopodium ambrosioi—des L.）又名紅澤藍(lán)、殺蟲芥、鵝腳草等，為藜科藜屬一年或多年生芳香性草本植物（Monzote et a1.，2014），廣泛分布于我國20多個(gè)?。▍^(qū)），是當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)中的單優(yōu)種群，對(duì)我國的生態(tài)系統(tǒng)造成了極大威脅（徐海根和強(qiáng)勝，2004）。土荊芥較強(qiáng)的入侵性與其強(qiáng)烈的化感作用密切相關(guān)，其向環(huán)境釋放的化感物質(zhì)干擾周圍植物的代謝過程，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)甚至引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制周圍植物的生長發(fā)育（Jim6nez-Osomio et a1.，1996；胡琬君等，2011；胡忠良等，2015；Chert et a1.，2016）。蠶豆作為蔬菜作物廣泛種植于土荊芥入侵的農(nóng)田（胡琬君等，2012），因此，以蠶豆為受體，分析土荊芥腐解液對(duì)其光合特性和保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響，對(duì)揭示土荊芥的化感作用機(jī)制和入侵機(jī)制具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]目前，針對(duì)土荊芥化感作用的研究主要集中在其揮發(fā)性化感物質(zhì)對(duì)根細(xì)胞的影響方面（胡琬君等，2011；胡忠良等，2015；Chen et a1.，2016），而關(guān)于其對(duì)周圍植物光合特性影響的研究較少。張紅等（2010）、李安奇等（2012）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土荊芥的凋落物數(shù)量較多，其腐解過程釋放的化感物質(zhì)對(duì)周圍植物的生長發(fā)育具有抑制效應(yīng)。王毅和儀慧蘭（2013）、李蕊等（2015）研究認(rèn)為，蠶豆是觀察保衛(wèi)細(xì)胞氣孔活動(dòng)的模式植物，其保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)許多脅迫因子如甲醛、S02和鋁等反應(yīng)十分靈敏，常被用作評(píng)估環(huán)境脅迫的受試系統(tǒng)。孫慧群等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞能靈敏準(zhǔn)確地響應(yīng)環(huán)境脅迫，并通過復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控改變其膨壓，從而使氣孔處于最適宜的開閉狀態(tài)。周健等（2016a，2016b）研究發(fā)現(xiàn)，蠶豆葉片保衛(wèi)細(xì)胞能敏感響應(yīng)入侵植物的化感作用，在土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)和辣子草水浸提液作用下均表現(xiàn)為活性降低，甚至出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。[本研究切入點(diǎn)]植物生長依賴于光合作用制造的有機(jī)物，葉綠素?zé)晒鈪?shù)能直接反映植物光合系統(tǒng)對(duì)光能的吸收和利用情況（王鷹翔等，2017），由于葉片表面的角質(zhì)層幾乎不能透過水分和C02，即氣孔開關(guān)運(yùn)動(dòng)在葉片內(nèi)外的氣體交換尤其是光合作用和蒸騰作用中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用（許大全，2013）。目前，有關(guān)土荊芥腐解物對(duì)與蠶豆生長發(fā)育密切相關(guān)的葉綠素特性和氣孔特性影響的研究鮮見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]運(yùn)用盆栽試驗(yàn)和表皮條分析法，分析土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗生長、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和葉表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的影響，旨在探討土荊芥殘株腐解的化感作用機(jī)制，為揭示土荊芥的入侵機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試土荊芥植株采自四川省成都市錦繡大道附近，陰干后備用。蠶豆種子購自成都市龍泉驛區(qū)大面鎮(zhèn)種子市場，品種為成胡14號(hào)。供試土壤取自四川師范大學(xué)成龍校區(qū)，土壤類型為黃壤。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1腐解液制備 分別稱取土荊芥陰干葉片和土壤各0.15 kg，置于塑料桶中，加入6 L蒸餾水，蓋上蓋子置于25℃的溫室中進(jìn)行腐解處理，處理時(shí)間40 d，其間不定期攪拌。處理結(jié)束后先用32層紗布過濾2次，濾液再用濾紙過濾1次，得到濃度為25.0mg/L的腐解母液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)4個(gè)腐解液濃度梯度，即10.0、15.0、20.0和25.0 mg/L，以蒸餾水處理為對(duì)照（CK）。

1.2.2材料培養(yǎng) 將撿去植物根系、石頭、落葉和枯枝的土壤分裝于小花盆（直徑7 cm，高度6 cm）中；挑選大小均一、飽滿的蠶豆種子，用0.5%KMnO₄溶液消毒15 min，浸種24 h，避光，25℃催芽2～3 d。待種子露白后播種至小花盆中，每盆1粒種子，置于溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照和黑暗各12 h，溫度25℃。

1.2.3幼苗生長指標(biāo)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 材料培養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，分別用不同濃度腐解液和蒸餾水進(jìn)行澆灌，每盆澆灌10 mL，之后不定期補(bǔ)充水分以保持土壤濕潤。每周定期測定植株地上部高度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，4周后測定葉面積、地上部鮮重和干重。植株高度為用直尺測量蠶豆幼苗植株地上部的高度。鮮重和干重測定：試驗(yàn)結(jié)束后，剪取幼苗地上部稱取鮮重，然后置于烘箱中105℃殺青，80℃烘至恒重，稱重，每處理測定10株。葉面積測定：每株選取頂端第2層的1片葉片，采用AM300葉面積測定儀測量葉面積，每處理測定10株。葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定：選取每株蠶豆頂端第2層的1片葉片，暗處理30 min后，采用FMS一2便攜式熒光測定儀測定其實(shí)際光化學(xué)效率（ФPsⅡ）和最大光化學(xué)效率（F_v/F_m）。每組測定10株。

1.2.4細(xì)胞毒性試驗(yàn) 采用表皮條分析法，參照周健等（2016a）的方法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。分別取不同濃度土荊芥腐解液6μL，加入裝有5 mL表皮緩沖液[50 mmol/L KCl，0.1 mmol/L CaCl₂，0.1 mol/LTris，10 mmol/L 2-（N-morpholino）ethane sulfonicacid（MES），pH 7.0]的EP管中；取生長4～5周蠶豆幼苗完全展開的頂端葉片，用鑷子撕取1.0 cm×0.5 cm的下表皮浸入處理液中，每個(gè)EP管放置8片，每處理重復(fù)5次，以浸泡蒸餾水為對(duì)照（CK），置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，分別采用AO/EB染色法和孚爾根染色法檢測保衛(wèi)細(xì)胞的活性和核異常率（周健等，2016a，2016b）。具有綠色熒光的為活細(xì)胞，具有橘紅色熒光的為死細(xì)胞。

細(xì)胞死亡率（%）=死細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100

細(xì)胞核異常率（%）=核異常細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0對(duì)測定參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較（LSD），以Excel2007制圖。

2結(jié)果與分析

2.1土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗生長的影響

由表1可知，從第2周起，20.0 mg/L腐解液處理蠶豆幼苗的株高均顯著低于CK（P<0.05，下同），處理后第4周，15.0 mg/L腐解液處理蠶豆幼苗的株高也顯著低于CK，說明隨著處理時(shí)間的延長，15.0和20.0 mg/L土荊芥腐解液均能顯著抑制蠶豆幼苗苗高生長。隨腐解液濃度的增加，蠶豆幼苗葉面積呈先增大后縮小的變化趨勢，當(dāng)腐解液濃度達(dá)25.0mg/L時(shí)，葉面積較CK下降了7.67%，但各腐解液處理及CK間差異不顯著（P>0.05，下同），說明土荊芥腐解液對(duì)蠶豆葉片生長的影響不明顯。在土荊芥腐解液作用下，蠶豆幼苗地上部生物量發(fā)生不同程度的變化，其中15.0 mg/L腐解液處理蠶豆幼苗的地上部鮮重和干重均顯著小于CK，分別為CK的81.23%和85.71%，其他濃度的腐解液處理蠶豆幼苗地上部鮮重和干重與CK差異不顯著，說明15.0 mg/L土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗地上部生長具有抑制效應(yīng)。

2.2土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表2可知，不同濃度土荊芥腐解液處理蠶豆幼苗的F_v/F_m和ФPsⅡ在不同處理時(shí)間段存在一定差異，但相互問及與CK的差異不顯著，說明土荊芥腐解液對(duì)蠶豆幼苗的原初光能轉(zhuǎn)化效率影響不明顯。

2.3土荊芥腐解液對(duì)蠶豆葉片保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響

從圖1可看出，經(jīng)土荊芥腐解液處理的蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞，其細(xì)胞核呈橘紅色的保衛(wèi)細(xì)胞比例明顯高于CK，CK的大部分保衛(wèi)細(xì)胞核呈亮綠色，說明土荊芥腐解液處理的蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞以死細(xì)胞居多。統(tǒng)計(jì)保衛(wèi)細(xì)胞死亡率發(fā)現(xiàn)，土荊芥腐解液處理蠶豆葉片的保衛(wèi)細(xì)胞死亡率總體上隨土荊芥腐解液濃度的增加而顯著升高（圖2-A），說明其細(xì)胞活性均明顯低于CK，呈濃度依賴關(guān)系即土荊芥腐解液可誘導(dǎo)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡。

從圖3可看出，25.0 mg/mL土荊芥腐解液處理蠶豆的保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，表現(xiàn)為核錯(cuò)位、固縮、拉長或降解等畸變特征，保衛(wèi)細(xì)胞核畸變率隨腐解液濃度的增加而顯著升高（圖2-B）；而CK的保衛(wèi)細(xì)胞核位于細(xì)胞中間，形態(tài)規(guī)則。說明土荊芥腐解液對(duì)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)具有顯著影響。

3討論

化感作用是外來植物成功入侵的機(jī)制之一（Ci-pollini et a1.，2012），擴(kuò)散到新生境的入侵植物個(gè)體比原產(chǎn)地具有更強(qiáng)的化感作用，入侵植物通過根系分泌、淋溶、揮發(fā)和腐解等途徑將化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中，改變周圍植物的多種生理過程，抑制周圍植物生長發(fā)育（zhou and Yu，2006），從而在競爭中占據(jù)優(yōu)勢地位（cauaway et a1.，2011）。土荊芥為一年生或多年生草本植物，其地上部凋落后必然會(huì)進(jìn)入土壤中腐解并釋放化感物質(zhì)。張紅等（2010）研究表明，土荊芥去精油殘?jiān)庖簩?duì)受體幼苗生長具有抑制效應(yīng)，但隨著處理時(shí)間延長，抑制效應(yīng)逐漸減弱。本研究結(jié)果與其略有不同，在土荊芥腐解液作用下，蠶豆幼苗的葉面積變化不明顯，植株高度和生物量整體降低，地上部生長受到抑制，且隨處理時(shí)間的延長，抑制效應(yīng)明顯增強(qiáng)，可能是本研究供試腐解液來自未經(jīng)處理的凋落物，其化感物質(zhì)成分不同所致。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)能很好地反映植物與逆境脅迫的關(guān)系。ФPsⅡ是判斷植物光合能力的重要指標(biāo)，是光化學(xué)途徑中的激發(fā)能占進(jìn)入PSⅡ總激發(fā)能的比例，而F_v/F_m是PsⅡ的最大光化學(xué)效率（孫園園等，2015），常用來度量葉片PSⅡ反應(yīng)中心捕獲激發(fā)能的效率。本研究結(jié)果表明，土荊芥腐解液雖然對(duì)蠶豆葉片F(xiàn)_v/F_m和ФPsⅡ具有不同程度的影響，但與CK的差異均不顯著。因此，土荊芥腐解液對(duì)蠶豆葉的光反應(yīng)影響不明顯。

CO₂和水分是植物光合作用的原料，任何影響植物體內(nèi)CO₂濃度和水分含量的因素都會(huì)影響植物的光合效率。氣孔對(duì)植物C02吸收和水分蒸騰具有調(diào)節(jié)功能，因此，任何改變氣孔功能的因素均會(huì)影響光合作用過程和植物產(chǎn)量。侯利欽等（2016）、周健等（2016a）研究發(fā)現(xiàn)，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞可對(duì)多種環(huán)境刺激作出反應(yīng)，當(dāng)受到土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)脅迫時(shí)，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞活性降低，細(xì)胞核出現(xiàn)畸變現(xiàn)象。本研究結(jié)果與其相似，蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞在土荊芥腐解液的作用下，其活性隨著腐解液濃度的增加而顯著下降，死亡率急劇上升，且細(xì)胞核出現(xiàn)錯(cuò)位、固縮、拉長或降解等畸變特征。

根據(jù)本研究結(jié)果推測，土荊芥腐解過程中釋放的化感物質(zhì)主要通過影響蠶豆葉片氣孔運(yùn)動(dòng)而改變其體內(nèi)的CO₂濃度，從而抑制蠶豆幼苗的生長。

4結(jié)論

土荊芥腐解過程中釋放的化感物質(zhì)對(duì)蠶豆幼苗的光反應(yīng)影響不明顯，但其較強(qiáng)的細(xì)胞毒性能引起葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生畸變，活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致幼苗氣孔運(yùn)動(dòng)受阻，吸收CO₂的能力下降，光合效率降低而影響其生長發(fā)育。

致謝：本研究在試驗(yàn)階段得到四川師范大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)研究生周健和黃素的大力幫助，謹(jǐn)表謝忱！

（責(zé)任編輯 思利華）