廣西南寧巨峰葡萄果實溢糖性霉斑病病原菌鑒定

李瑋　陳國品　謝蜀豫　黃秋鳳　丁蘇　白先進(jìn)　曹慕明

摘要：[目的]分離、鑒定廣西南寧葡萄園中引發(fā)巨峰葡萄果實溢糖性霉斑的病原菌，為該病的防治提供參考依據(jù)。[方法]采用5點采樣法在發(fā)病葡萄園區(qū)進(jìn)行溢糖性霉斑發(fā)病情況調(diào)查和癥狀觀察；隨機(jī)選擇100個具有典型形態(tài)特征的單一霉斑，挑取病原菌孢子進(jìn)行菌株分離和純化培養(yǎng)，根據(jù)柯赫氏法則分別驗證其形成霉斑的致病力，并通過形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)手段對病原菌進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]被調(diào)查葡萄園中，2015年冬季果、2016年夏季和冬季果的葡萄果實溢糖性霉斑發(fā)病率分別達(dá)86.00%、87.32%和89.33%，發(fā)病指數(shù)分別為52.80、62.40和58.27。從100個霉斑樣本中分離獲得的優(yōu)勢菌株均具有相似的菌落形態(tài)，隨機(jī)選取其中8株菌株進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8株菌株均具有形成霉斑的致病力。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確認(rèn)分離所得的病原菌為橘青霉（Penicilliumcitrinum）。[結(jié)論]橘青霉（P. citrinum）是引起廣西南寧巨峰葡萄果實溢糖性霉斑的病原菌之一，當(dāng)前應(yīng)從栽培技術(shù)人手做好綜合防控工作。

關(guān)鍵詞：葡萄；果實溢糖性霉斑；橘青霉；真菌病害；廣西南寧

中圖分類號：S432.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095—1191（2018）03-0495-06

0引言

[研究意義]自2003年以來，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院在南方葡萄一年兩收栽培研究方面取得突破（白先進(jìn)等，2008；尹玲等，2017），促使廣西葡萄栽培產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，但氣候因素使得廣西葡萄栽培過程中病害頻發(fā)，如何有效防控病害成為廣西葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵性問題之一（李順輝等，2012；林玲等，2016）。自2011年以來，本研究團(tuán)隊在廣西中部和南部多個葡萄園區(qū)發(fā)現(xiàn)一種新病害，該病在果實接近成熟時發(fā)病，病果果皮表面布滿雪花狀霉斑，雖然果實發(fā)病后并無進(jìn)一步潰爛或落粒等現(xiàn)象，但因外觀品質(zhì)嚴(yán)重受損，使病果喪失商品價值。目前尚未有關(guān)于該現(xiàn)象的系統(tǒng)研究報道，業(yè)內(nèi)習(xí)慣性的將該現(xiàn)象稱為葡萄果實溢糖性霉斑，該新型病害已對廣西葡萄產(chǎn)業(yè)構(gòu)成巨大威脅，急需對其開展系統(tǒng)研究，而確定該病的病原菌更是首要問題。[前人研究進(jìn)展]關(guān)于葡萄微生物病害的病原鑒定工作一直是葡萄學(xué)科的研究熱點，炭疽病、穗軸褐枯病、酸腐病等主要葡萄果實微生物病害的病原菌鑒定已有較多報道。鄧維萍等（2013）利用形態(tài)鑒定與特異性引物分子檢測相結(jié)合的方法對從云南省主要葡萄產(chǎn)區(qū)采集的60株炭疽病菌菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，引起云南葡萄主產(chǎn)區(qū)炭疽病的病原為膠孢炭疽菌；供試膠孢炭疽菌對紅提葡萄均有致病力，但菌株致病力差異明顯，對番茄和草莓存在交叉侵染能力，且對多菌靈的敏感性較尖孢炭疽菌高。Pisani等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉和碳黑曲霉在引發(fā)葡萄酸腐病的過程中會形成一種新的子實體結(jié)構(gòu)，為揭示葡萄酸腐病的發(fā)病進(jìn)程提供了新理論。吳代東等（2016）研究表明，引起毛葡萄穗軸潰瘍病的主要病原為小新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum）；防治藥劑篩選結(jié)果顯示，30%氟硅唑微乳劑、64%嗯霜·錳鋅可濕性粉劑、70%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑、22.2%抑霉唑乳油、70%丙森鋅可濕性粉劑和60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑等7種藥劑對該病病原的抑制作用較強(qiáng)，抑菌率均達(dá)100%，可作為備選藥劑進(jìn)行田問防治試驗。馬仲文（2017）根據(jù)ITS序列的差異，建立了快速檢測葡萄灰霉病菌的PCR檢測方法，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作便捷等優(yōu)點，可用于帶菌土壤及發(fā)病組織中葡萄灰霉病菌的檢測。[本研究切入點]目前對于葡萄果實溢糖性霉斑病的研究仍處于空白狀態(tài)，對引發(fā)該病的原因尚不清楚。[擬解決的關(guān)鍵問題]對葡萄果實溢糖性霉斑發(fā)病園區(qū)的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，初步了解該病的發(fā)病規(guī)律；挑取典型霉斑進(jìn)行優(yōu)勢微生物分離、純化、回接致病性驗證及生物學(xué)鑒定，以確定引發(fā)該病的病原菌，為葡萄果實溢糖性霉斑病的防治提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1病害調(diào)查與癥狀觀察

田問病害調(diào)查于2015年12月、2016年7和12月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院巨峰葡萄一年兩收示范基地進(jìn)行。采用5點取樣法，每點取果穗30穗，共150穗。

按果穗上果皮表面霉斑分布面積分5級記錄。分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，全穗無霉斑；I級，果穗上果皮表面霉斑分布面積占總面積比例≤20%；Ⅱ級，20%<果穗上果皮表面霉斑分布面積占總面積比例≤40%；Ⅲ級，40%<果穗上果皮表面霉斑分布占總面積比例≤60%；Ⅳ級，60%<果穗上果皮表面霉斑分布占總面積比例≤80%；V級，果穗上果皮表面霉斑分布占總面積比例>80%。

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計算病穗率和病情指數(shù)，計算公式如下：

1.2病原微生物分離

從采樣園內(nèi)選取巨峰葡萄的典型發(fā)病果穗，采用5點取樣法，每點取果穗5穗，共25穗。整穗采集后置于無菌樣品袋中于當(dāng)日帶回實驗室。無菌條件下，從每穗樣品上選取4個位置相對獨立、形態(tài)典型性較好、表面形成肉眼可見孢子束的單一霉斑作為取樣對象，共100個霉斑，用接種環(huán)挑取霉斑表面孢子，在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離純化，置于28℃下培養(yǎng)72 h。隨機(jī)從培養(yǎng)基上挑取形成的絲狀菌單菌落進(jìn)行平板劃線二次純化，再挑取所得單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于28℃下培養(yǎng)72 h，觀察斜面上長滿孢子后將培養(yǎng)物置于4℃保藏。

1.3病原微生物鑒定

保藏的菌株用新鮮的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)性狀，并在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。同時，采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.O試劑盒提取各分離菌株的基因組DNA，用Fungi Identification PCR Kit真菌鑒定試劑盒自帶引物擴(kuò)增真菌ITS序列并進(jìn)行序列測定，測序測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。利用BLASTN將獲得的ITS基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對，確定與該菌株親緣關(guān)系最近的種屬，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的序列，用MEGA 5.0進(jìn)行序列比對排列并使用鄰接法（Neigh-bour-joining methods，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，以確定病原菌的分類學(xué)地位。

1.4病原微生物的致病性測定

將待測菌株P(guān)DA斜面培養(yǎng)物表面的孢子用無菌水洗下，收集到盛有10 mL無菌水及若干玻璃珠的50 mL三角瓶中，于28℃、160 r/min下振蕩1 h，用4層擦鏡紙過濾，用無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度為1×10⁶個/mL的孢子懸液。2017年夏季果成熟期間，從未發(fā)現(xiàn)霉斑病的試驗地塊中選取顆粒疏松、無顆粒相互擠壓裂果的健康巨峰葡萄成熟果穗，用含0.1%（w/v）NaClO、0.01%（v/v）Tween-20的消毒液浸泡進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水沖洗3次并晾干，用無菌噴壺以噴霧接種的方法將孢子懸液均勻接種到健康果穗表面，以果穗上孢子懸液開始滴落作為接種終點，接種后果穗用無菌牛皮紙袋包扎，通過向紙袋定時噴灑無菌水保持袋內(nèi)濕度，每個菌株接種3串果穗作為重復(fù)，以無菌水代替孢子懸液噴霧為對照，定期觀察各果實表面霉斑的發(fā)生狀況，發(fā)病后挑取單個霉斑進(jìn)行病原菌分離，通過柯赫氏法則（韓召軍，2012）驗證病原菌。

2結(jié)果與分析

2.1田間生境與病癥觀察結(jié)果

生境：葡萄采用棚架模式栽培，架下環(huán)境較濕潤，空氣相對濕度在80%以上，園區(qū)中一半面積搭建了避雨棚，一半面積為露地栽培。

發(fā)病癥狀：病害發(fā)生于果實成熟期，通常在連日降雨、空氣濕度較高時期發(fā)病；2015和2016年冬季果表現(xiàn)為避雨、套袋的果穗發(fā)病相對較少、較輕，2016年夏季果則表現(xiàn)為露地栽培、不套袋的果穗發(fā)病較少、較輕；該病害一般首先發(fā)生于果穗上部，隨后逐漸向果穗下部蔓延；霉斑分布一般表現(xiàn)為同一果穗上部比下部多，同一果粒向外表皮上比向中心果梗一面的表皮上多；霉斑大多呈雪花狀分散于果皮表面，局部嚴(yán)重的會形成一整片類似果粉的纖維薄膜狀物質(zhì)，霉斑周邊的健康果粉消失（圖1-a）。經(jīng)觀察比較，在園內(nèi)相同片區(qū)，按現(xiàn)有大田生產(chǎn)技術(shù)，使用較大劑量赤霉素進(jìn)行保果處理的果穗（表現(xiàn)為果梗粗硬老化，果粒較自然果更大）霉斑發(fā)生較嚴(yán)重，而部分本課題組用于試驗、未經(jīng)過赤霉素處理的自然坐果果穗極少發(fā)病。

2.2田間發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果

田間葡萄果穗發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果（表1）表明，葡萄果實霉斑在調(diào)查園內(nèi)發(fā)病程度極高，病穗率在86.00%以上，造成大量果穗喪失商品價值。

2.3病原菌致病性鑒定結(jié)果

隨機(jī)選取100個霉斑進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，結(jié)果在培養(yǎng)基上形成絕對優(yōu)勢的菌株均具有相似的菌落形態(tài)。依照柯赫氏法則，從100份培養(yǎng)物中隨機(jī)選取8株分離菌株進(jìn)行回接試驗，結(jié)果顯示，接種了分離菌株的巨峰葡萄健康果穗均表現(xiàn)出典型的霉斑癥狀，而空白組的果穗未出現(xiàn)霉斑。對回接試驗中產(chǎn)生的果實表皮霉斑進(jìn)行再分離，得到相似形態(tài)的分離菌株，表明該菌為引起巨峰葡萄果實表皮霉斑的病原菌。

2.4病原菌鑒定結(jié)果

將用于回接試驗的病原菌代表菌株的ITS序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果表明，該類菌株與橘青霉（Penicillium citrinum）的相似性達(dá)99%。由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）可知，編號為GX系列的病原菌菌株與從印度農(nóng)作物及昆蟲上分離得到的P.citrinum MSSRF-IS1在進(jìn)化樹的同一分枝上，而與由美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心保藏的其他青霉屬菌株存在一定差異。各病原菌代表菌株在PDA培養(yǎng)基上均具有下列形態(tài)學(xué)特點：菌絲呈絨狀，單菌落有同心環(huán)紋，氣生菌絲發(fā)達(dá)，培養(yǎng)3-5 d后長出灰藍(lán)色孢子，菌落周圍有淡黃色色素物質(zhì)分泌（圖3-a）；分生孢子梗直立、細(xì)長，單生或數(shù)根叢生，具有分隔，分枝呈帚狀，較長或很長，多為雙輪生；分生孢子呈球形或近球形（圖3-b和圖3-c），基本符合文獻(xiàn)描述（孔華忠，2007）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果的相互印證，進(jìn)一步證明分離所得的系列病原菌為橘青霉（P.citrinum）。

3討論

葡萄果實溢糖性霉斑作為一種新的葡萄果實病害此前一直未引起業(yè)內(nèi)重視。近年來，隨著設(shè)施栽培技術(shù)的推廣，我國南方濕潤多雨地區(qū)的葡萄種植業(yè)快速發(fā)展，陸續(xù)有種植者反映在廣西、浙江和臺灣等地發(fā)現(xiàn)葡萄果實溢糖性霉斑。據(jù)本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西多地有葡萄果實溢糖性霉斑大面積發(fā)生現(xiàn)象，給種植戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本課題組通過對發(fā)病果園的多年觀察及連續(xù)三造果的病害發(fā)生情況分析發(fā)現(xiàn)，葡萄果實溢糖性霉斑病具有很強(qiáng)的頑固性，容易連續(xù)多年持續(xù)嚴(yán)重發(fā)生。

本研究從巨峰葡萄果實的霉斑中分離得到一系列菌落形態(tài)相近的菌株，經(jīng)回接試驗驗證其能引發(fā)果實霉斑，通過形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定，最終確定該系列菌株為橘青霉（P. citrinum），這是我國大陸地區(qū)首次報道分離并鑒定的與葡萄果實溢糖性霉斑相關(guān)的病原微生物。健康葡萄果實表皮上會附著大量的真菌微生物（Martins et a1.，2014；Kecske-meti et a1.，2016），通常青霉屬微生物不易在活體葡萄果實表皮附生微生物群落中形成優(yōu)勢地位，推測葡萄果實溢糖性霉斑有可能是葡萄果實表皮附生微生態(tài)被某些因素破壞，從而造成青霉等絲狀真菌形成生長優(yōu)勢所引發(fā)的病害。

橘青霉擁有強(qiáng)大的酶合成及代謝系統(tǒng)，能利用多種營養(yǎng)基質(zhì)，能產(chǎn)生大量孢子，并借助空氣流動迅速擴(kuò)散，在潮濕條件下較易定殖生長，這些特點很可能是造成葡萄果實溢糖性霉斑持續(xù)發(fā)生的重要原因。前人的研究表明，橘青霉對楊梅、棗、葡萄等水果均能造成危害（Mikugova et a1.，2010；郭東起等，2011；汪開拓等，2011），但通常是在果實有傷口或在采后儲藏過程中才會造成危害，在完整葡萄果實表皮形成霉斑的現(xiàn)象目前尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)，橘青霉在葡萄果實表皮形成霉斑后不會進(jìn)一步引起果實潰爛；在返接試驗中，未經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑處理的自然坐果果實不易遭受橘青霉的侵害，而經(jīng)較大劑量赤霉素處理的果實較易形成霉斑病害，可能是外源赤霉素處理促使果實表皮通透性發(fā)生改變，為橘青霉的定殖提供了有利條件所致。

由于葡萄果實溢糖性霉斑病發(fā)病程度重且發(fā)生于果實成熟期，不宜采用化學(xué)藥劑進(jìn)行補(bǔ)救，因此目前只能通過提早采取措施進(jìn)行預(yù)防：（1）做好園區(qū)排水和通風(fēng)工作，防止出現(xiàn)地面積水，降低園區(qū)環(huán)境濕度；（2）及時清園并做好園區(qū)滅菌工作，減少可被青霉利用的生物基質(zhì)；（3）在保花保果過程中控制植物生長調(diào)節(jié)劑、特別是赤霉素的用量，以免葡萄果實表皮的天然結(jié)構(gòu)被破壞，減少橘青霉定殖于葡萄果實表皮的有利條件。綜合考慮，葡萄果實溢糖性霉斑病的防治需從栽培技術(shù)人手做好綜合防控工作，同時應(yīng)開展生物防治該病的研究。

本研究對于葡萄果實溢糖性霉斑病的研究工作較粗淺，尚不能夠?qū)υ摬∮邢到y(tǒng)和全面的認(rèn)識，在后續(xù)研究中還需對該病的致病關(guān)鍵微生物的區(qū)域差異、發(fā)病內(nèi)在機(jī)制、發(fā)病后處理方案等進(jìn)行深入探究。

4結(jié)論

橘青霉（P.citrinum）是引起廣西南寧巨峰葡萄果實溢糖性霉斑的病原菌之一，當(dāng)前應(yīng)從栽培技術(shù)人手做好綜合防控工作。

（責(zé)任編輯 麻小燕）