甜瓜尾孢葉斑病病原分離與鑒定

葉云峰　杜嬋娟　覃斯華　柳唐鏡　洪日新　付崗　李桂芬　黃金艷

摘要：[目的]明確近年來(lái)引起廣西大棚厚皮甜瓜葉斑病的病原，為該病害的有效防治提供參考依據(jù)。[方法]采用單孢分離法直接從罹病厚皮甜瓜葉片上分離病原菌，以離體葉片接種法驗(yàn)證病原菌的致病性。對(duì)致病菌的菌落、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行觀察，同時(shí)對(duì)致病菌的rDNA-ITS基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。[結(jié)果]病原菌形態(tài)特征與瓜類尾孢（Cercospora citrullina）基本一致，rDNA-ITS基因序列與瓜類尾孢的同源性達(dá)99%。結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，將該病害的病原菌鑒定為瓜類尾孢。[結(jié)論]近年在廣西大棚厚皮甜瓜產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生的甜瓜葉斑病由瓜類尾孢引起，該病是廣西厚皮甜瓜上的一種新病害。

關(guān)鍵詞：甜瓜；葉斑??；病原鑒定；瓜類尾孢

中圖分類號(hào)：S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0476-05

0引言

[研究意義]甜瓜是葫蘆科黃瓜屬（CucumisLinn.）一年生蔓生草本植物，分為薄皮甜瓜和厚皮甜瓜兩大類型。厚皮甜瓜（包括哈密瓜、白蘭瓜和粗皮甜瓜等）原產(chǎn)非洲和亞洲熱帶地區(qū)，我國(guó)新疆為厚皮甜瓜次生起源中心之一。廣西引進(jìn)厚皮甜瓜種植始于20世紀(jì)90年代中期，并于1998年開(kāi)始通過(guò)改用大棚保護(hù)地避雨栽培試種獲得成功，2003年后種植面積迅速擴(kuò)大，常年種植總面積約4000 ha，種植甜瓜已成為廣西部分瓜農(nóng)脫貧致富的重要途徑。由于廣西的氣候高溫多雨，大棚內(nèi)濕度大，加上大棚栽培難以實(shí)施輪作，致使大棚甜瓜生產(chǎn)受到多種病害的威脅。本課題組于2015-2016年在廣西南寧、北海和欽州等厚皮甜瓜主產(chǎn)區(qū)開(kāi)展甜瓜病害種類調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)一種葉部新病害，該病害侵染北甜一號(hào)、好運(yùn)11號(hào)和新金鳳凰等厚皮甜瓜品種，其癥狀與以往發(fā)生的甜瓜葉部病害癥狀存在明顯差異，主要表現(xiàn)為在葉片上形成近圓形或倒“V”字形褐色大型病斑。該病在春茬甜瓜上的發(fā)病率為30%～50%，在秋茬甜瓜上發(fā)生更嚴(yán)重，多數(shù)大棚發(fā)病率在80%～22z，嚴(yán)重的發(fā)病率達(dá)100%，成為2015～2016年廣西大棚甜瓜最嚴(yán)重的葉部病害之一。該病主要造成甜瓜葉片大面積枯死，植株早衰，嚴(yán)重影響果實(shí)后期的營(yíng)養(yǎng)吸收，降低果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，造成20%～40%的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病病原菌的分類地位尚不明確，因此，開(kāi)展該病原的鑒定研究，對(duì)有效防治該病害具有重要的指導(dǎo)意義。[前人研究進(jìn)展]在我國(guó)南方地區(qū)大棚甜瓜上常發(fā)生的病害主要有霜霉病、白粉病、蔓枯病、病毒病、枯萎病、炭疽病、猝倒病和根結(jié)線蟲(chóng)病等（何毅等，2005；周靈芝等，2006）。經(jīng)比對(duì)，本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)的甜瓜葉部新病害癥狀與上述常見(jiàn)病害的葉部癥狀存在明顯差異，關(guān)于這種新病害目前未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。此外，前人對(duì)植物病害的鑒定通常采用病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，該方法能將病原菌鑒定到種的水平（王爽等，2013；冉雙飛等，2016；趙楊等，2016；歐陽(yáng)秋飛等，2017）。[本研究切入點(diǎn)]對(duì)于一種新發(fā)生的病害，準(zhǔn)確鑒定其病原菌是進(jìn)行有效防治的基本前提。目前對(duì)近年來(lái)廣西大棚甜瓜葉片上發(fā)生的新病害尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]采用單孢分離法對(duì)厚皮甜瓜上新發(fā)生的葉部病害進(jìn)行病原菌分離，用離體葉片接種法進(jìn)行致病性測(cè)定，同時(shí)對(duì)病原菌的形態(tài)特征進(jìn)行顯微觀察，并對(duì)其rDNA-ITS基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行鑒定，以明確該病原菌的分類地位，為該病害的有效防治提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

病原菌分離和接種均采用厚皮甜瓜品種好運(yùn)11號(hào)，種植于廣西南寧市武鳴區(qū)鑼圩鎮(zhèn)武帽農(nóng)場(chǎng)。病原菌分離采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2病害癥狀觀察

2015年8月～2016年12月，在南寧市武鳴區(qū)、青秀區(qū)和北海市銀海區(qū)等厚皮甜瓜主產(chǎn)區(qū)，于不同發(fā)病時(shí)期對(duì)厚皮甜瓜葉斑病進(jìn)行癥狀觀察、記錄和拍照。

1.3病原菌鑒定

1.3.1病原菌分離 從南寧市武鳴區(qū)鑼圩鎮(zhèn)武帽農(nóng)場(chǎng)5個(gè)大棚采集新鮮病葉各1張，分別用滅菌水沖洗表面，置于28℃下保濕2 d，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行病原菌單孢分離。用沾了無(wú)菌水的滅菌接種環(huán)粘取病斑處的分生孢子，在水瓊脂塊表面劃線，置顯微鏡下觀察，挑取單孢子移入另一塊水瓊脂塊表面，再次用顯微鏡觀察，確認(rèn)第2塊水瓊脂塊上只含有1個(gè)分生孢子，將第2塊水瓊脂塊移到PDA培養(yǎng)基上，28℃下黑暗培養(yǎng)10 d，挑取菌落邊緣的菌絲塊轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病原菌致病性測(cè)定 從生長(zhǎng)健壯的甜瓜植株中上部剪取健康葉片，用無(wú)菌水沖洗干凈。用滅菌接種針在健康葉片上的每個(gè)接種點(diǎn)針刺5下，在傷口處滴半滴無(wú)菌水。從28℃黑暗培養(yǎng)15 d的菌落上切取菌絲塊（5 mm×5mm），將長(zhǎng)菌絲的一面貼于針刺傷口處。每處理3張葉片，每張葉片接種3個(gè)菌絲塊；以針刺傷口處貼放PDA空白培養(yǎng)基塊為對(duì)照。將處理和對(duì)照葉片置于28℃下保濕培養(yǎng)，定期觀察各處理葉片的發(fā)病情況。發(fā)病后對(duì)病斑上的病原菌進(jìn)行再分離，比較分離菌株與接種菌株的菌落和分生孢子形態(tài)是否相同，如分離菌株與接種菌株的菌落和分生孢子形態(tài)相同，則說(shuō)明是同一種真菌，可確認(rèn)為病原菌。

1.3.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將致病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，置于28℃下黑暗培養(yǎng)，定期觀察記錄菌落的形態(tài)特征和生長(zhǎng)情況。另外，用滅菌解剖刀片從葉片病斑上刮下菌體，置于載玻片上的半滴無(wú)菌水中，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察病菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)特征，并測(cè)量大小。

1.3.4病原菌分子生物學(xué)鑒定 采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA。以真菌通用引物ITS1（5-TCCG-TAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）（朱迎迎等，2016）對(duì)病原菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 uL：2.5 mmol/L dNTP 2.0μL，10xBuffer 2.5μL，5 U/IaLEx Taq 0.5 μL，10 μmol/L ITS1和ITS4各1.0μL，模板DNA 100 ng，超純水補(bǔ)足至25.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃80 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目標(biāo)DNA條帶，送交金唯智生物科技（北京）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。運(yùn)用BLAST將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1病害癥狀

該病害在厚皮甜瓜定植后的整個(gè)生育期均可發(fā)生，苗期發(fā)生較輕微，以生長(zhǎng)中后期（結(jié)果期至采收期）發(fā)病最重。病害癥狀首先在植株下部的葉片上出現(xiàn)，隨后向中上部葉片擴(kuò)展。初期在葉片上形成灰白色圓形小斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成近圓形褐色病斑，病斑中央常為灰白色，外圍有明顯黃色暈圈（圖1-A）。還可形成不規(guī)則形或沿著葉緣葉脈向葉片內(nèi)部擴(kuò)展呈倒“V”字形的大型病斑，病斑均為褐色，外圍有黃色暈圈（圖1-B），病斑大小差異較明顯。病害嚴(yán)重時(shí)，多個(gè)病斑融合在一起，致葉片大面積干枯死亡，造成植株早衰。

2.2病原菌分離和鑒定結(jié)果

2.2.1病原菌分離和致病性測(cè)定結(jié)果 對(duì)5張來(lái)自不同大棚的甜瓜病葉進(jìn)行病原菌單孢分離，分離純化得到形態(tài)特征一致的真菌5株。通過(guò)針刺接種法將5株菌株的菌絲塊接種到健康的甜瓜葉片上，接種4 d后，接種部位均出現(xiàn)明顯的近圓形褐色小病斑，直徑8-10 mm，外圍有明顯黃色暈圈（圖2-B）。隨著時(shí)間推移，病斑不斷擴(kuò)大，接種6 d后，病斑直徑達(dá)25-30 inn3，病斑癥狀與自然發(fā)病的近圓形病斑癥狀相似（圖2-C）。對(duì)照葉片未發(fā)?。▓D2-A）。從發(fā)病組織上采用單孢分離法再分離得到的菌株，其菌落和分生孢子形態(tài)與接種菌株相同，表明再分離獲得的真菌菌株即為病原菌。選取其中一株菌株TBD-2進(jìn)行培養(yǎng)菌落的形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定。

2.2.2病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 人工培養(yǎng)的菌落在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，28℃下黑暗培養(yǎng)10 d，菌落直徑僅為3.0-3.5 cm，且不產(chǎn)生分生孢子。菌落近圓形，邊緣平滑，氣生菌絲致密，菌落正面為白色，中央隆起（圖3-D），菌落背面黑褐色，產(chǎn)生紅色色素。菌落生長(zhǎng)特征基本與尾孢屬真菌相符（雷玉明和張建文，2006）。

從葉片病斑上觀察到病菌子實(shí)體葉兩面生。刮下菌體制成臨時(shí)玻片在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)子座小或不明顯。分生孢子梗單生或2-12根簇生，頂部淺褐色，基部深褐色，不分枝，直立或彎曲，有1-7個(gè)曲膝狀折點(diǎn)，1-8個(gè)隔膜，頂部圓錐形平截，孢痕疤明顯加厚（圖3-C），大小為（52.5-245.0）μm×（4.0-6.0）gin。分生孢子針形，直或稍彎曲，無(wú)色，單生，基部平截，頂端漸細(xì)至鈍，多個(gè)隔膜（圖3-A和圖3-B），大小為（48.5-238.0）μmx（2.7-5.4）岬。從葉片病斑上觀察到的病原菌形態(tài)特征與《中國(guó)真菌志》第二十四卷尾孢菌屬（郭英蘭等，2005）描述的寄生在葫蘆科作物上的瓜類尾孢（Cercospora citrullina）基本一致。

2.2.3病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 用真菌通用引物ITSl和ITS4對(duì)菌株TBD一2的rDNA-ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得長(zhǎng)度約530 bp的DNA片段（圖4）?；厥赵揇NA片段進(jìn)行測(cè)序，得到538 bp的基因序列（GenBank登錄號(hào)KY824771），將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的基因序列進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，結(jié)果表明，該序列與瓜類尾孢的同源性達(dá)99%。

結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株TBD-2鑒定為瓜類尾孢（C.citrullina）。

3討論

國(guó)內(nèi)外已報(bào)道能引起甜瓜葉斑病的病原菌有多種，包括瓜鏈格孢（Alternaria cucumerina）（Egeland Harmon，2007）、交鏈格孢（A.alternata）（Zhouand Everts，2008；Huang et a1.，2011）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）（王爽等，2013）和丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）（李亞利等，2007）等真菌和細(xì)菌，由瓜類尾孢（C. citrullina）引起的甜瓜葉斑病未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。瓜類尾孢主要侵染葫蘆科的冬瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆、黃瓜、絲瓜和苦瓜等作物（郭英蘭等，2005），引起葉斑類病害。鑒于能引起甜瓜葉斑病的病原種類較多，為避免混淆，建議將瓜類尾孢引起的甜瓜葉斑病定名為甜瓜尾孢葉斑病。

本研究發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的組織分離法很難分離到尾孢菌，其原因可能是尾孢菌在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，容易被其他生長(zhǎng)較快的腐生真菌或內(nèi)生真菌覆蓋，因此采用組織分離法通常分離到其他真菌而不是尾孢菌。而采用挑取單孢的分離法，可有效分離到純的尾孢菌，且能減少病菌分離純化的工作量。劉慶奎等（2013）、張小飛等（2014）也是采用單孢分離法對(duì)尾孢屬真菌進(jìn)行分離。

瓜類尾孢在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，這一特性與其他尾孢屬真菌相同（雷玉明和張建文，2006）。其生長(zhǎng)緩慢的特性將影響后續(xù)的生物學(xué)特性測(cè)定、藥劑敏感性測(cè)定等室內(nèi)試驗(yàn)的開(kāi)展，因此，促進(jìn)該病原菌快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法尚需進(jìn)一步探究。

4結(jié)論

結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)近年來(lái)在廣西大棚厚皮甜瓜上嚴(yán)重發(fā)生的一種葉部新病害進(jìn)行鑒定，將病原菌鑒定為瓜類尾孢（C. citrullina），該病是廣西厚皮甜瓜上的一種新病害。

（責(zé)任編輯 麻小燕）