番木瓜感染畸形花葉病毒后的生理變化及掃描電鏡觀察

安娜 張榮萍 陳萍

摘要：【目的】闡明番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus，PLDMV）的侵染機(jī)理及侵染后番木瓜自身防御體系對(duì)抗病毒的作用機(jī)制，為番木瓜病毒病防治提供參考?！痉椒ā恳耘_(tái)農(nóng)二號(hào)番木瓜為材料，通過RT-PCR檢測(cè)接種PLDMV處理組（T）與健康空白對(duì)照組（CK）的病毒感染情況，采用分光光度法測(cè)定PLDMV侵染對(duì)番木瓜相關(guān)生理指標(biāo)的影響，運(yùn)用掃描電鏡法觀察兩組番木瓜葉片的微觀結(jié)構(gòu)差異?！窘Y(jié)果】通過RT-PCR檢測(cè)，證明T番木瓜植株已感染PLDMV。T與CK番木瓜葉片在表征、微觀解剖結(jié)構(gòu)及生理指標(biāo)等方面均存在明顯差異，與CK番木瓜葉片相比，T番木瓜葉片縱切面柵海比及背部絨毛密度明顯小于CK番木瓜，氣孔密度大于CK番木瓜；T番木瓜的過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、超氧陰離子（[O] ）含量均顯著高于CK番木瓜（P<0.05，下同），過氧化氫酶（CAT）活性和葉綠素（Chl）含量顯著低于CK番木瓜，而超氧化物歧化酶（SOD）和幾丁質(zhì)酶活性兩組間無顯著差異（P>0.05）。【結(jié)論】番木瓜受PLDMV侵染后，其葉片結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞毒害損傷嚴(yán)重，體內(nèi)代謝紊亂，多種代謝調(diào)節(jié)平衡被打破，番木瓜的正常生長(zhǎng)發(fā)育受阻。

關(guān)鍵詞： 番木瓜；番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）；掃描電鏡

中圖分類號(hào)： S668.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）04-0714-07

Physiological changes and scanning electron microscope observation of Carica papaya L. infected with PLDMV

AN Na， ZHANG Rong-ping， CHEN Ping*

（Institution of tropical agriculture and forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract：【Objective】The infection mechanism of Papaya leaf-distortion mosaic virus（PLDMV） and the mechanism of Carica papaya L. defense system against virus after infection were elucidated to provide reference for papaya virus di-sease. 【Method】C. papaya variety Tainong 2 was used as material. The infection situations of C. papaya in treatment group with PLDMV inoculation（T） and healthy blank control group（CK） were confirmed by RT-PCR detection. The influence of PLDMV infection on C. papaya related physiological indexes was determined by spectrophotometry. Scanning electron microscopy was used to observe the difference in microstructure between the two groups. 【Result】RT-PCR test showed that T group was infected with PLDMV. There were obvious differences in the characterization， microstructure and physiological indexes between leaves in T and CK. Palisade tissue to cavernous tissue ratio of vertical section leaves and density of back tomentum in T were smaller than those in group CK， and the stomatal density in group T was larger than that in group CK. In physiological indexes， the activities of peroxidase（POD）， polyphenol oxidase（PPO） and phenylalanine ammonia lyase（PAL）， and contents of proline（Pro）， malondialdehyde（MDA） and superoxide anion（[O] ） in T group were significantly higher than those in CK group（P<0.05， the same below）. Catalase（CAT） activity and chlorophyll（Chl） content in T group was significantly lower than those in CK group. Superoxide dismutase（SOD） and chitinase were not signi-ficantly different from each other（P>0.05）. 【Conclusion】After PLDMV infection， C. papaya leaf structure is damaged， the cells are seriously poisoned， metabolic disturbance occurs， multiple metabolic regulation are imbalanced， therefore， the development and growth of papaya is blocked.

Key words： Carica papaya L.； Papaya leaf-distortion mosaic virus（PLDMV）； scanning electron microscope

0 引言

【研究意義】番木瓜（Carica papaya L.）屬大型軟木質(zhì)多年生草本植物，其作為南方地區(qū)一種主栽水果深受消費(fèi)者喜愛，但栽培過程中常遭受番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus， PLDMV）侵染，受害番木瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，給果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尋找方便高效的番木瓜畸形花葉病毒病防治措施對(duì)促進(jìn)番木瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤為重要，但至今尚無十分有效的防治手段，因此，全面了解該病毒病的發(fā)病癥狀及感病番木瓜植株的生理情況，對(duì)今后從多角度尋找有效的番木瓜病毒病防治方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】番木瓜畸形花葉病毒病是一種主要流行于日本及我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)、在番木瓜間傳播的病毒病，可危害番木瓜植株的葉片及果實(shí)，2013年時(shí)檢測(cè)發(fā)病率達(dá)3%（楊勇等，2013），近年來呈逐漸上升趨勢(shì)。目前，對(duì)于該病毒的鑒定檢測(cè)技術(shù)已非常成熟?；豉i（2015）利用多重?zé)晒舛縋CR鑒定番木瓜病毒，該方法比PCR靈敏10～100倍；庹德財(cái)（2015）通過建立并優(yōu)化多重PCR反應(yīng)，可同時(shí)進(jìn)行包括PLDMV在內(nèi)的3種番木瓜病毒鑒定；吳自林和李華平（2016）運(yùn)用RT-PCR對(duì)18個(gè)采集自廣州南沙區(qū)的番木瓜感病樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果從中檢測(cè)到13個(gè)樣品為番木瓜畸形花葉病毒。在番木瓜病毒病的防治方面，張榮萍等（2017）通過對(duì)番木瓜進(jìn)行多種植物免疫藥劑的正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)殼聚糖、碧護(hù)和酵素菌復(fù)配處理對(duì)番木瓜幼苗環(huán)斑病毒病有較好的控制效果。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于PLDMV感染番木瓜后植株的生理病理變化尚無文獻(xiàn)報(bào)道，且其發(fā)病后病葉的微觀結(jié)構(gòu)變化也鮮有報(bào)告?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用分光光度法和掃描電鏡法，結(jié)合RT-PCR分子檢測(cè)，比較受PLDMV侵染的番木瓜植株與正常植株的生理代謝及葉片超微結(jié)構(gòu)的差異，闡明其致病機(jī)理，為番木瓜病毒病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試番木瓜苗為臺(tái)農(nóng)二號(hào)，種苗來自廣東惠州旺發(fā)果苗場(chǎng)。挑選長(zhǎng)勢(shì)相同、健康無病癥的番木瓜苗進(jìn)行培養(yǎng)，處理組（T）番木瓜苗在50 cm高時(shí)接種PLDMV，對(duì)照組（CK）不接種病毒并進(jìn)行隔離，其他環(huán)境條件相同，CK與T均有10棵苗。PLDMV來源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。主要試劑：植物總RNA提取試劑盒[DP437，離心柱型，天根生化科技（北京）有限公司]、反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AT311-02，北京全式金生物技術(shù)有限公司）、2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye）（AS111-02，北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

于2017年9月進(jìn)行病毒接種，2017年10月發(fā)病后進(jìn)行掃描電鏡觀察及生理指標(biāo)測(cè)定。

1. 2. 1 病毒接種 病毒接種采用摩擦接種法，參考孫玉娟等（2011）的方法并略有改進(jìn)。摘取已嚴(yán)重發(fā)病的番木瓜病株嫩葉1 g，剪碎用液氮充分研磨，按1∶100比例加入100 mL磷酸緩沖液與少量石英砂研磨成勻漿，用干凈紗布將殘?jiān)^濾掉，濾液低溫保存，并立刻進(jìn)行病毒接種。接種前以肥皂洗凈雙手，用食指沾取少量病毒提取液后再沾取少量石英砂，大拇指與食指捏住葉片進(jìn)行輕微摩擦，擦破葉表面即可。選擇從頂端往下數(shù)第4和第5片功能葉進(jìn)行接種試驗(yàn)。

1. 2. 2 田間觀測(cè) 接種2周后植株陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病癥狀。每組選取3株發(fā)病程度基本一致的番木瓜苗，摘取從頂端往下數(shù)第2和第3片功能葉，其中一片將葉柄剪去進(jìn)行拍照，另一片用于后續(xù)試驗(yàn)。

1. 2. 3 發(fā)病植株P(guān)CR分子檢測(cè) 參照庹德財(cái)（2015）的方法，用植物總RNA提取試劑盒提取RNA，根據(jù)PLDMV保守區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)（片段大小為355 bp；正向引物PLDMV355-F：5'-GGCATGT

GGTTTATGATGCAAGGG-3'，反向引物PLDMV355-

R：5'-GCTCCGTGTTCTCAGTCGCATT-3'）。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明轉(zhuǎn)錄合成cDNA；反轉(zhuǎn)錄程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（2%的Agarose），選用TaKaRa DL2000 DNA Marker進(jìn)行標(biāo)定，電泳條件為100 V 25 min，觀察條帶分布以確認(rèn)T植株的病毒感染情況。

1. 2. 4 掃描電鏡觀察 參照李和平（2009）的方法并稍作修改。葉片洗凈擦干，用刀片切成直徑小于2 mm的切片，迅速投入2.5%戊二醛固定液中浸泡2 h，再用真空泵將葉片中的氣泡抽出，繼續(xù)浸泡8 h以上。固定好的切片用磷酸緩沖液進(jìn)行漂洗，階梯濃度酒精進(jìn)行逐級(jí)脫水，每次8 min，脫水完畢用乙酸異戊酯置換酒精，然后再進(jìn)行超臨界干燥和噴金，最后上掃描電鏡觀察葉片正面、背面及橫切面并拍照。

1. 2. 5 生理指標(biāo)測(cè)定 用剩余葉片分別進(jìn)行10個(gè)生理指標(biāo)的測(cè)定。過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和葉綠素（Chl）含量測(cè)定參考蔡慶生（2013）的方法并適當(dāng)調(diào)整，超氧陰離子自由基（[O][2] ）含量測(cè)定參照陳銀萍等（2015）的方法，丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用張琦等（2016）的方法，脯氨酸（Pro）含量測(cè)定參考張樂華等（2011）的方法，幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定參考Yin等（2013）的方法，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測(cè)定參照陳建勛和王曉峰（2015）的方法。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，用SAS 9.4進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析（ANOVA），采用t檢驗(yàn)（P=0.05）進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 發(fā)病葉片癥狀描述

2017年10月1日，采摘番木瓜頂端往下數(shù)完全舒展的第2或第3片葉進(jìn)行觀察、拍照。如圖1所示，CK番木瓜植株葉片的葉色呈墨綠色，葉色均勻，葉片舒展，葉脈無扭曲變形現(xiàn)象，而T番木瓜植株的葉片葉色不均勻且有色斑，黃綠相間，靠近葉脈輻射中心處有明顯的扭曲變形現(xiàn)象。

2. 2 PLDMV感染情況的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在T1、T2和T3泳道有明顯條帶，位置在250～500 bp，與PLDMV陽性對(duì)照顯示的條帶（355 bp）平行。說明T番木瓜植株確實(shí)感染了PLDMV，且病毒在植株中的表達(dá)量已能夠被檢測(cè)出，而CK番木瓜植株均未檢測(cè)出條帶，說明CK番木瓜未感染PLDMV。

2. 3 掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，CK與T番木瓜的葉上表面（葉面）無明顯差異，葉表皮細(xì)胞均排列緊密（圖3-1和圖3-2）。葉下表面（葉背）包含形成氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞及葉背毛，CK與T番木瓜的葉背面細(xì)胞存在差異：（1）CK番木瓜葉背面構(gòu)成氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞與相鄰的副保衛(wèi)細(xì)胞較飽滿，細(xì)胞偏大，相同放大倍數(shù)相同視野下，CK番木瓜的氣孔個(gè)數(shù)為3個(gè)且不完全閉合，而T番木瓜的氣孔個(gè)數(shù)為4個(gè)且全部處于閉合狀態(tài)；（2）CK番木瓜的葉片絨毛密度比T番木瓜的絨毛密度大，T番木瓜可見明顯的裸露區(qū)域（圖3-3和圖3-4）。從葉片的縱切面掃描電鏡照片（圖3-5和圖3-6）可看出，CK番木瓜有明顯寬大的柵欄組織，而T番木瓜的柵欄組織細(xì)胞排列散亂，占橫切面的比例不足1/3，且CK番木瓜的柵欄組織排列緊密整齊，可清晰辨認(rèn)；CK與T番木瓜的海綿組織在掃描電鏡下觀察無明顯差異，均散亂分布于柵欄組織下方，且大小不一。

2. 4 生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2. 4. 1 植物抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 由圖4-A～圖4-D可看出，番木瓜植物在受到病原攻擊時(shí)其POD和PPO活性顯著高于CK（P<0.05，下同），而CAT活性顯著低于CK，SOD活性高于CK番木瓜但差異不顯著（P>0.05，下同）。細(xì)胞中[O][2] 含量越高，細(xì)胞越容易受到攻擊，細(xì)胞新陳代謝失衡的可能性就越大。圖4-E顯示，T番木瓜的[O][2] 含量顯著高于CK番木瓜。從圖1可直接觀察到CK番木瓜的葉色明顯比T番木瓜的深，而圖4-F也證實(shí)CK番木瓜的Chl含量顯著高于T番木瓜。

2. 4. 2 與植物抗逆相關(guān)的主要指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 MDA含量能反應(yīng)植物細(xì)胞的膜質(zhì)過氧化程度，一般而言，MDA含量越高，意味著植物中膜質(zhì)過氧化程度越高，損傷也就越嚴(yán)重。由圖5-A可看出，T的MDA含量顯著高于CK番木瓜，該指標(biāo)與[O][2] 含量的測(cè)定結(jié)果可同時(shí)證明T細(xì)胞的受損程度大于CK番木瓜。Pro含量和PAL活性與植物抗逆性相關(guān)，Pro含量越高，說明植物受到的脅迫越劇烈，相反則越低；PAL在植物體內(nèi)的次生代謝中起重要作用，植物受到脅迫時(shí)其活性會(huì)顯著增加。由圖5-B和5-C可看出，T番木瓜的Pro含量和PAL活性均顯著高于CK。近年來有報(bào)道幾丁質(zhì)酶活性與植物抗逆相關(guān)，通過提高幾丁質(zhì)酶活性可水解微生物細(xì)胞壁，從而保護(hù)植物自身免受微生物的侵害（徐恩靜等， 2011）。由圖5-D可看出，CK與T番木瓜中的幾丁質(zhì)酶活性相當(dāng)，兩者間差異不顯著。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)番木瓜葉片受到病原侵害造成傷害時(shí)其[O][2] 含量迅速上升，對(duì)細(xì)胞造成氧化傷害， T番木瓜的CAT活性低于CK番木瓜且SOD活性無明顯上升，與花生感染條紋病毒后的表現(xiàn)相似（董煒博等，1997）；[O][2] 沒有被及時(shí)清除可能是造成細(xì)胞中[O][2] 積累的原因，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜質(zhì)產(chǎn)生過氧化，與趙天宏等（2008）的報(bào)道相似。本研究中T番木瓜的POD和PPO活性顯著高于CK番木瓜，與毛健民等（2002）報(bào)道煙草感染花葉病毒后的生理生化變化趨勢(shì)一致，可能由于POD活性提高是植物對(duì)病原微生物侵染的一種積極反應(yīng)，是一種自身防護(hù)機(jī)能的表現(xiàn)，也有可能是脅迫產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物如酚類、胺類等的積累誘導(dǎo)了這兩種酶活性升高，在這里筆者更傾向于后者，因?yàn)檫@兩種酶是植物中的末端氧化酶，PPO可催化各種酚類物質(zhì)氧化成醌類以避免其對(duì)細(xì)胞的毒害，POD可清除活性氧催化H2O2直接氧化酚類和胺類等底物（楊志敏和蔣立科，2010）。病葉中Pro含量高，說明植物正遭受逆境脅迫。PAL活性升高，與前述POD和PPO活性同時(shí)升高的試驗(yàn)結(jié)果相聯(lián)系，也證明植物體內(nèi)有害次生代謝產(chǎn)物存在積累現(xiàn)象，而有害次生代謝產(chǎn)物積累過多所造成的毒害也是植物細(xì)胞受損的一個(gè)重要原因。本研究中，CK與T番木瓜的幾丁質(zhì)酶活性無明顯差異，說明病毒的刺激并未激活植物提高自身的幾丁質(zhì)酶活性。

從掃描電鏡觀察結(jié)果可看出，PLDMV對(duì)番木瓜葉片結(jié)構(gòu)的破壞程度大、柵海比失衡，與李琴等（2010）對(duì)冬棗銹病病葉解剖結(jié)構(gòu)觀察、付春霞（2014）對(duì)蘋果小葉病葉片橫切面顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果一致。而發(fā)病番木瓜葉背面與健康番木瓜植株相比，發(fā)病葉片氣孔全部閉合，與倪國(guó)仕（2010）等在煙草中的研究結(jié)果一致，其原因可能是植物在受到逆境脅迫時(shí)會(huì)通過關(guān)閉氣孔、改變細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)及增加細(xì)胞中的活性氧等以對(duì)抗病原體入侵，但同時(shí)抑制植物的正常光合作用，導(dǎo)致葉片光合速率下降，進(jìn)而影響植物的正常光合代謝與發(fā)育，也有可能是病毒對(duì)正常細(xì)胞攻擊而導(dǎo)致正常葉片結(jié)構(gòu)破壞，致使氣孔保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)育異常。通過彩色照片對(duì)比可看出，病葉扭曲變形，不完全伸展，且根據(jù)葉綠素含量在兩組間的測(cè)定結(jié)果，CK番木瓜的葉片葉綠素含量明顯高于T番木瓜，與毛健民等（2002）在煙草、于力等（2012）在番茄上的研究結(jié)果一致，其原因是病毒破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，從而降低葉片光合作用效率，結(jié)合掃描電鏡觀察結(jié)果，病毒刺激導(dǎo)致葉片氣孔部分關(guān)閉和葉肉細(xì)胞的光合活性降低。本研究結(jié)果顯示，PLDMV對(duì)番木瓜葉片葉綠素的破壞程度較大，能影響葉綠素的合成，從而阻礙植物的光合作用，導(dǎo)致葉片的正常生理過程受阻，妨礙碳水化合物的積累。病毒對(duì)番木瓜葉片中正常組織的侵染使細(xì)胞中活性氧類物質(zhì)積累，同時(shí)打破了細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡，這些活性氧以其極強(qiáng)的氧化性造成細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，對(duì)植物造成嚴(yán)重傷害（張夢(mèng)如等，2014）。同時(shí)，病毒的大量繁殖導(dǎo)致植物葉片分化異常，葉綠體基本結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，不能發(fā)育成形態(tài)正常的葉片，從而影響植物光合作用，植物生長(zhǎng)受抑制（洪健等，2001）。由上述研究結(jié)果及分析討論可以看出，無抗病性的番木瓜其自身的抗病能力有限，且其整個(gè)防御系統(tǒng)很容易失衡，不能有效抵抗病毒顆粒的入侵，今后可從提高植物自身免疫抗性角度進(jìn)行更深入研究。

PLDMV的危害程度極大，需要引起重視，尤其隨著農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口量的大幅增長(zhǎng)，病毒的傳播速度加快，如何有效地預(yù)防該病毒的傳播及對(duì)番木瓜的侵染，如何找到有效的防治方法是今后研究的重要方向。

4 結(jié)論

番木瓜被PLDMV侵染發(fā)病后，其葉片結(jié)構(gòu)被破壞，柵海比變小，細(xì)胞毒害損傷嚴(yán)重，使植物體內(nèi)代謝紊亂，多種代謝調(diào)節(jié)平衡被打破，嚴(yán)重影響番木瓜正常生長(zhǎng)發(fā)育。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）