羽衣甘藍BoRACK1基因克隆、亞細胞定位及表達分析

龐可勤 劉宏偉 甄萍萍 郭君潔 李偉 李大紅 李鴻雁

摘要：【目的】克隆羽衣甘藍蛋白激酶C1受體（RACK1）基因（BoRACK1）序列，并對其進行亞細胞定位及表達分析，為研究RACK1基因在植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控機制提供理論參考。【方法】PCR擴增BoRACK1基因，構(gòu)建其亞細胞定位表達載體，通過基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞后在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GEP）的分布情況。利用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測BoRACK1基因在不同組織中及在非生物脅迫（200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2溶液）下幼苗中的表達情況?！窘Y(jié)果】PCR擴增獲得BoRACK1基因的開放閱讀框（ORF）序列，其cDNA全長980 bp，編碼326個氨基酸，氨基酸序列與其他植物的RACK1具有較高同源性，在65%以上，尤其與擬南芥的同源性高達93%。BoRACK1基因在羽衣甘藍的根、莖、葉、花和種子中均有表達，其中在根、葉和種子中的表達量較高，而在花、幼芽和莖的表達量較少。BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCl脅迫下的表達量整體上呈下調(diào)趨勢，其中NaCl脅迫下其表達量在6 h時降至最低，而其他脅迫下其表達量均在4 h時降至最低。BoRACK1定位于細胞質(zhì)、細胞核和細胞質(zhì)膜?！窘Y(jié)論】BoRACK1基因表達無組織特異性，除了與羽衣甘藍花、果實及營養(yǎng)器官的發(fā)育存在關聯(lián)外，還可能參與了植物的抗逆性調(diào)控過程。

關鍵詞： 蛋白激酶C1受體（RACK1）；羽衣甘藍；亞細胞定位；熒光定量PCR（qRT-PCR）

中圖分類號： S681.903.6 文獻標Cloning， subcellular localization and expression analysis

of gene BoRACK1 in Brassica oleracea

PANG Ke-qin1， LIU Hong-wei2， ZHEN Ping-ping3， GUO Jun-jie4，

LI Wei4， LI Da-hong4， LI Hong-yan4*

（1Garden Center， Huanghuai University， Zhumadian， Henan 463000， China； 2Green Department of Zhumadian，Zhumadian， Henan 463000， China； 3Agricultural and Forestry Bureau of Linyi County，Shandong Province， Linyi， Shandong 276000， China； 4 School of Biotechnology and Food Engineering， Huanghuai University，

Zhumadian， Henan 463000， China）

Abstract：【Objective】Gene（BoRACK1） sequence of tyrosine kinase receptorC1（RACK1） from Brassica oleracea was cloned； subcellular localization and expression analysis were also conducted， in order to provide theoretical basis for research on the regulation mechanism of gene RACK1 in the process of plant growth and development. 【Method】Gene BoRACK1 was amplified by PCR and expression vector of subcellular localization was constructed.Onion epidermal cells were transformed by the particle bombardment method. The distribution of green fluorescent protein（GEP） was observed under a laser scanning confocal microscope. The fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） method was used to detect the expression of gene BoRACK1 in different tissues and seedlings under abiotic stress（200 mmol/L NaCl， 100 μmol/L ABA and 1 mmol/L H2O2 solution）. 【Result】The open reading frame（ORF） sequence of gene BoRACK1 was acquired by PCR amplification. cDNA was 980 bp in length，encoding 326 amino acids. Amino acid sequence hadhigh homology with the RACK1 of other plants， which was over 65%. In particular， the homology with Arabidopsis thaliana reached 93%. Gene BoRACK1 expressed in roots， stems， leaves， flowers and seeds of B.oleracea. The expressions in roots， leaves and seeds were high while those in flowers， seedlings and stems were low. The overall expression of gene BoRACK1 was down-re-gulated under abiotic stress of ABA， H2O2 and NaCl. The expression level reached the lowest point at 6 h under NaCl stress，and the expression level reached the lowest point at 4 h under other stresses. BoRACK1 was localized in the cytoplasm， cell nuclear and plasma membrane. 【Conclusion】The expression of gene BoRACK1 has no tissue specificity. The gene has different degrees of correlations with development of flowers， fruits and vegetative organof B.oleracea； and the gene may also be involved in the regulation process of plant stress resistance.

Key words：tyrosine kinase receptorC1（RACK1）；Brassica oleracea；subcellular localization；fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）04-0635-08

0 引言

【研究意義】蛋白激酶C1受體（RACK1）是一種含有7個β-螺旋槳結(jié)構(gòu)的多功能支架蛋白，廣泛存在于真核細胞中，屬于WD（色氨酸和天冬氨酸）重復蛋白家族成員（McCahill et al.，2002），參與多個信號轉(zhuǎn)導通路和不同信號分子調(diào)節(jié)過程，如cAMP信號轉(zhuǎn)導、mRNA翻譯調(diào)控、細胞骨架重構(gòu)和蛋白質(zhì)降解等（Ullah et al.，2008；Guo et al.，2009；Komatsu et al.，2014）。因此，開展RACK1基因克隆、亞細胞定位及表達分析，對研究RACK1基因在植物生長發(fā)育過程中的生物學功能和作用機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前有關RACK1基因的研究報道較多。McCahill等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，蛇、雞和人類等體內(nèi)僅含一個單一的RACK1基因。Chen等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因組包含3個RACK1基因，水稻基因組中有2個RACK1基因。Nakashima等（2008）研究認為，水稻RACK1與其他蛋白相互作用形成復合體共同參與植株對稻瘟病菌的響應，其響應機理是水稻感染稻瘟病后RACK1基因過表達導致其體內(nèi)活性氧（ROS）含量和病程相關基因（PR）表達量增加，從而緩解稻瘟病癥狀。Guo等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，RACK1基因參與植物的生物和非生物脅迫。Li等（2009，2018）、李大紅等（2014）分別利用RNA干擾（RNAi）技術抑制水稻和大豆的RACK1基因表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者的轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力均顯著高于野生型。Wang等（2014）采用PCR對玉米RACK1基因（ZmRACK1）進行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZmRACK1基因過表達可緩解玉米葉片大斑病癥狀。Zhang等（2014）研究表明，水稻RACK1基因通過調(diào)節(jié)內(nèi)源H2O2含量參與其種子萌發(fā)。Nielsen等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，RACK1蛋白氨基酸序列高度保守，可特異性與核糖體緊密結(jié)合，表明RACK1是一個完整的核糖體蛋白。Schmitt等（2017）研究認為，Asc1p/RACK1是一個與核糖體40S亞基相互作用的關鍵因子，RACK1可能是在核糖體翻譯后加工過程中發(fā)揮蛋白磷酸化信號轉(zhuǎn)導的作用。【本研究切入點】羽衣甘藍（Brassica oleracea var. acephala f.tricolor）是十字花科蕓薹屬的觀賞植物，葉片形態(tài)美觀多變，色彩絢麗如花，但至今鮮見羽衣甘藍RACK1基因（BoRACK1）克隆、亞細胞定位及表達分析的研究報道。【擬解決的關鍵問題】克隆BoRACK1基因，采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在羽衣甘藍不同組織及非生物脅迫下幼苗中的表達情況，并對其編碼蛋白進行亞細胞定位，為研究RACK1基因在植物生長發(fā)育過程中的生物學功能和作用機理提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

羽衣甘藍由河南省駐馬店市園林綠化科研所提供，種植于黃淮學院南區(qū)溫室內(nèi)。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和洋蔥瞬時表達載體pCAMBIA1301由黃淮學院園林中心實驗室保存提供，pMD18-T載體、DNA聚合酶I、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、PCR試劑盒和隨機引物試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA快速純化回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Green Supermix Ex Taq（ABI）試劑盒購自美國Bio-Rad公司，抗生素、植物生長調(diào)節(jié)劑等購自美國Sigma公司，其他試劑采用進口或國產(chǎn)分析純。主要儀器設備：ABI7500實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）、PDS-1000臺式基因槍（美國Bio-Rad公司）和激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品處理及采集 羽衣甘藍種子萌發(fā)后30 d移栽大棚，澆灌Hoaglands營養(yǎng)液；10 d后采集其根和葉。植株抽苔時采集莖和幼芽，初花期采集整花，種子成熟后收集種子，用于BoRACK1基因克隆及組織特異性表達分析。另外，將40 d的羽衣甘藍幼苗分為3組，每組30株，分別置于200 mmol/L NaCl、100 μmol/L脫落酸（ABA）和1 mmol/L H2O2中，于脅迫處理0、2、4、6和8 h后取樣（整個植株），立即放入液氮中待冷凍后于-80 ℃保存，用于研究BoRACK1基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應。

1. 2. 2 總RNA提取 參照RNA提取試劑盒說明提取樣品總RNA。利用超微量核酸蛋白分析儀檢測總RNA的濃度和純度，并利用1%甲醛變性膠電泳進行其完整性檢測。

1. 2. 3 cDNA合成 以總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。參照DNA聚合酶I使用說明合成第二鏈DNA。

1. 2. 4 引物設計及合成 在NCBI網(wǎng)站上將羽衣甘藍基因組DNA與擬南芥（Arabidopsis thaliana）RACK1基因（GenBank登錄號LOC106317602）進行序列比對，獲得同源性達93%的基因序列。并利用Primer Premier 5.0設計其引物（表1），擴增目的片段為980 bp。

1. 2. 5 基因克隆 PCR反應體系50.0 μL：10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）5.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，BoRACK1-F和RACK1-R cDNA各2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1. 2. 6 亞細胞定位表達載體構(gòu)建 利用DNA快速純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中的目的條帶，并連接至pMD18-T載體上，熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。對測序正確的陽性質(zhì)粒和含綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的表達載體pCAMBIA1301（pCAMBIA1301-GFP）進行BamH I和Bcl I雙酶切。回收目的基因和表達載體，并按照3∶1比例混合，加入T4連接酶于4 ℃連接過夜。最后經(jīng)酶切和測序驗證后獲得重組表達載體pCAMBIA1301-BoRACK1-GFP，BoRACK1基因的開放閱讀框（ORF）被插入花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子與GFP報告基因之間（圖1），用于亞細胞定位。

1. 2. 7 生物信息學分析 測序結(jié)果在NCBI的BLAST上進行同源性比對，并利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預測目的基因的ORF，從而推導出氨基酸序列。利用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，采用ProtParam在線工具（http：//web.expasy.org/protparam/）預測該序列編碼蛋白的基本理化性質(zhì)，并以Smart（http：//smart. embl-heidilberg.de/）預測其保守結(jié)構(gòu)域。

1. 2. 8 qRT-PCR檢測 利用qRT-PCR檢測羽衣甘藍不同組織中及非生物脅迫（200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2）下幼苗中的表達情況，以iTaqTM Universal SYBR Green Supermix作為熒光試劑，管家基因Boactin（GenBank登錄號AF044573）作為內(nèi)參基因，其引物序列見表1。每處理3次重復。qRT-PCR反應體系50.0 μL：25.0 μL 2×SYBR Green Premix Ex Taq、10 μmol/L正、反向引物（qBoRACK1-F/qBoRACK1-F）各5.0 μL、5.0 μL cDNA 模板，滅菌蒸餾水補足至50.0 μL。擴增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，進行40個循環(huán)。

1. 2. 9 亞細胞定位 構(gòu)建的pCAMBIA1301-BoRACK1-GFP利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，并通過GFP報告基因在洋蔥表皮細胞內(nèi)的表達情況對BoRACK1基因編碼蛋白進行亞細胞定位（Zhang et al.，2016），以空載體pCAMBIA1301-GFP為對照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 BoRACK1基因擴增結(jié)果

如圖2所示，PCR擴增獲得一條大小約980 bp的清晰條帶，與目的基因長度基本相符。測序結(jié)果顯示，其與羽衣甘藍基因組中的RACK1基因參考序列相似性達100%，表明成功克隆獲得BoRACK1基因。

2. 2 生物信息學分析結(jié)果

采用ProtParam預測BoRACK1蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，其分子量為35.6 kD，等電點（pI）為7.03，由326個氨基酸組成。DNAMAN分析結(jié)果表明，BoRACK1與擬南芥AtRACK1C、AtRACK1B和AtRACK1A（A. thaliana，Np_188441、Np_175296和Np_173248）的同源性分別達93%、91%和87%，與核桃（Juglans regia L.，xp_018829694.1）、木豆（Cajanus cajan L.，kyp67473.1）、菜豆（Phaseolus vulgaris L.，acj24167.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula L.，xp_003631071.1）、蔓花生（Arachis duranensis L.，xp_015966958.1）、大豆（Glycine max L.，q39836）、棗樹（Zizyphus jujuba L.，xp_015882908.1）和草莓（Fraga-ria，xp_004299548.1）的同源性均為85%，與雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii L.，xp_012486409.1）和亞洲棉（G. arboreum L.，khg29145.1）的同源性為86%，與水稻OsRACK1A和OsRACK1B（Oryza sativa L.，NP_916988和XP_475866）的同源性分別為86%和66%。利用Smart預測BoRACK1蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，其氨基酸序列中有典型的GH（甘氨酸和組氨酸）和WD二肽結(jié)構(gòu)，其中有7個WD重復，7個GH重復，是蛋白激酶C（PKC）保守結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部序列，其數(shù)量和位置與大豆、水稻等植物PKC基本一致；BoRACK1蛋白的N端為WH，C端為WG，且第6和第7個GH-WD核心序列間的序列與其他植物RACK1蛋白存在明顯差異（圖3），表明該蛋白與其他同源蛋白間發(fā)生了明顯變異。

2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果

利用DNAMAN基于BoRACK1蛋白氨基酸序列與擬南芥（Np_173248、Np_175296和Np_188441）、核桃（xp_018829694.1）、木豆（kyp67473.1）、菜豆（acj24167.1）、蒺藜苜蓿（xp_003631071.1）、蔓花生（xp_015966958.1）、雷蒙德氏棉（xp_012486409.1）、大豆（q39836）、棗樹（xp_015882908.1）、草莓（xp_004299548.1）、亞洲棉（khg29145.1）、水稻（NP-916988和XP-475866）等植物的RACK1蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖4所示。羽衣甘藍RACK1與同為十字花科的擬南芥和禾本科植物水稻聚在同一分支上，與擬南芥AtRACK1C（NP_188441）蛋白聚于同一亞分支，且擬南芥AtRACK1A（NP_173248）和水稻OsRACK1A（NP_916988）在最近的亞分支，表明羽衣甘藍與擬南芥親緣關系最近，其次為水稻，同時證明RACK1在長期生物進化過程中具有較強的保守性，在近緣種中變異很小。

2. 4 BoRACK1基因的組織特異性表達分析結(jié)果

利用qRT-PCR檢測羽衣甘藍不同組織中BoRACK1基因的表達情況，結(jié)果如圖5所示。BoRACK1基因在羽衣甘藍的根、莖、葉、花、幼芽和種子中均有表達，其中在根、葉和種子中的表達量較高，而在花、幼芽和莖的表達量較少。說明BoRACK1基因在不同組織中的表達量存在一定差異，但無組織特異性。

2. 5 BoRACK1基因在非生物脅迫下的表達情況

分別以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2脅迫處理40 d的羽衣甘藍幼苗，于處理0、2、4、6和8 h后取樣，利用qRT-PCR檢測其表達情況，結(jié)果如圖6所示。100 μmol/L ABA處理0～4 h BoRACK1基因表達量呈顯著降低趨勢（P<0.05，下同），處理4 h時表達量降至最低，之后又顯著上升，最后趨于穩(wěn)定（圖6-A）。200 mmol/L NaCl處理0～6 h BoRACK1基因表達量呈顯著降低，處理6 h時表達量降至最低，是處理0 h表達量的35%，隨后又顯著回升（圖6-B）。1 mmol/L H2O2處理0～2 h BoRACK1基因表達量無顯著變化（P>0.05，下同），但處理4 h時表達量顯著降低至最低，隨后表達量無顯著變化（圖6-C）。由此推測，BoRACK1基因參與非生物脅迫響應。

2. 6 BoRACK1蛋白的亞細胞定位結(jié)果

測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組表達載體pGAMBIA1301-BoRACK1-GFP上BoRACK1基因序列與PCR擴增獲得序列完全一致，且ORF序列正確，表明表達載體構(gòu)建成功，可用于亞細胞定位分析。利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察洋蔥表皮細胞內(nèi)BoRACK1和GFP的融合表達情況，結(jié)果顯示，洋蔥表皮細胞的細胞基質(zhì)、細胞膜和細胞核均有綠色熒光，表明BoRACK1定位于細胞質(zhì)、細胞核和細胞膜（圖7）。

3 討論

RACK1含有7個WD重復結(jié)構(gòu)，每一個WD重復跨度為40～60氨基酸，稱為WD40結(jié)構(gòu)域，其并非絕對保守（Guo et al.，2007），可能被其他氨基酸代替。前人研究表明，RACK1蛋白的7個β-螺旋槳結(jié)構(gòu)N端為GH，C端為WD（Smith et al.，1999；Guo et al.，2007；Adams et al.，2011；Peng et al.，2016）。但本研究結(jié)果顯示，BoRACK1蛋白的N端為WH，C端為WG，且第6和第7個GH-WD核心序列間的序列與其他植物RACK1蛋白存在明顯差異，說明BoRACK1蛋白與其他同源蛋白間發(fā)生了明顯變異。已有研究發(fā)現(xiàn)，在所有WD重復蛋白中，第6與第7個GH-WD核心序列間存在一個較大的可變區(qū)域，推測其暴露在WD重復蛋白的7葉螺旋槳結(jié)構(gòu)的表面，決定了其可作為PKC受體的特性（Smith et al.，1999；Guo et al.，2007；Adams et al.，2011；Peng et al.，2016）。

RACK1基因不僅在擬南芥等植物不同組織中均有表達（Guo et al.，2007），且在哺乳動物不同組織和器官也均有表達，尤其是人類的大腦、肝臟和脾臟的表達水平較高（Adams et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，BoRACK1基因在羽衣甘藍的根、莖、葉、花、幼芽和種子中均有表達，其中在根、葉和種子中的表達量較高，而在花、幼芽及莖的表達量較少，說明BoRACK1基因在不同組織中的表達量存在一定差異，但無組織特異性，與RACK1基因在大多數(shù)動物不同組織中的表達情況一致（Chou et al.，1999；Corsini et al.，2016）。

RACK1基因參與對植物激素信號的響應。Ishida等（1993）首次從煙草BY-2懸浮細胞中分離獲得RACK1基因，并發(fā)現(xiàn)其參與生長素介導的細胞分裂，是一種生長素誘導基因。Nakashima等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，水稻RACK1A基因表達與茉莉酸甲酯（MeJA）、ABA和IAA密切相關。Guo等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥rack1a突變體在種子萌發(fā)、幼苗生長及根形成過程中均對生長素不敏感，但對ABA超敏感，且種子萌發(fā)期間對赤霉素（GA）和油菜素內(nèi)酯的敏感性明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)，BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCI脅迫下的表達整體上呈下調(diào)趨勢，表明其參與激素和非生物脅迫響應。但須通過基因敲除或過表達的方法對其抗逆性響應機制進行深入探索。

RACK1在不同物種的亞細胞定位不同。如在哺乳動物細胞中RACK1定位于細胞質(zhì)、細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（Guo et al.，2011）；在水稻細胞中RACK1A存在于細胞質(zhì)和微粒體中（Nakashima et al.，2008）。本研究通過構(gòu)建一個含BoRACK1基因和GFP報告基因融合表達載體，并用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)BoRACK1和GFP融合蛋白分布在洋蔥表皮細胞的細胞質(zhì)、細胞核和細胞膜中，說明BoRACK1定位于細胞質(zhì)、細胞核和細胞膜，與前人研究結(jié)果（Nakashima et al.，2008；Guo et al.，2011）一致。RACK1是一個核糖體相關蛋白，在翻譯過程中發(fā)揮關鍵作用，可與擬南芥真核起始因子6（eIF6）相互作用（Guo et al.，2011）；在細胞核中的RACK1復合物可促進部分基因的轉(zhuǎn)錄（He et al.，2002，2010）；RACK1與膜蛋白Rboh相互作用（Nakashima et al.，2008）。表明RACK1存在于細胞質(zhì)、細胞膜和細胞核中，但其具體發(fā)揮的生物學功能有待進一步研究。

4 結(jié)論

BoRACK1基因表達無組織特異性，除了與羽衣甘藍花、果實及營養(yǎng)器官的發(fā)育存在關聯(lián)外，還可能參與了植物的抗逆性調(diào)控過程。

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（責任編輯 陳 燕）