雌激素通過(guò)調(diào)控RCC2參與乳腺癌細(xì)胞凋亡

王偉琦　鄭亞冰　李昌　劉春燕　湯俊怡　常曉天

【摘要】 目的 探索雌激素刺激乳腺癌病變過(guò)程中染色體縮合調(diào)控子2（RCC2）的作用及機(jī)制。方法 收集乳腺標(biāo)本，用蛋白免疫印跡法檢測(cè)RCC2蛋白表達(dá)水平；分別用雌激素（雌二醇）、RCC2 小干擾RNA（siRNA），雌激素聯(lián)合RCC2 siRNA處理MCF-7細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡。結(jié)果 與乳腺纖維瘤組織相比，RCC2在雌激素受體陽(yáng)性（ER+）乳腺癌組織中的表達(dá)水平升高（P=0.001），在ER-乳腺癌組織中無(wú)升高（P=0.404）。抑制RCC2后ER+乳腺癌細(xì)胞系MCF-7增殖無(wú)變化（F處理=0.003，P=0.957），但凋亡比例比Allstars siRNA組高（t=2.679，P=0.037）；雌二醇處理MCF-7后增殖能力增強(qiáng)（F=110.323，P

【關(guān)鍵詞】 染色體縮合調(diào)控子2；雌激素；乳腺癌；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

【Abstract】 Objective To explore the role of chromosomal condensation regulator 2 （RCC2） during the process of estrogen promoting the progression of breast cancer. Methods Human breast tissues were collected. Western blot was utilized to quantitatively detect the expression level of RCC2 protein. MCF-7 cells were treated with estrogen or RCC2 siRNA and combined use of estrogen and RCC2 siRNA. The cell apoptosis and cell proliferation were detected. Results Compared with the breast fibroma tissues， the expression level of RCC2 in the ER+breast cancer tissues was significantly up-regulated （P=0.001）， but there was no significant change in the ER-breast cancer tissues （P=0.404）. After inhibiting the expression of RCC2， the proliferation of MCF-7 cells did not significantly change （F=0.003， P=0.957）， whereas the apoptosis ratio of MCF-7 cells was significantly higher than that in the Allstars siRNA group （t=2.679， P=0.037）. After treated with E2， the proliferation of MCF-7 cells was evidently enhanced （F=110.323， P

【Key words】 Chromosomal condensation regulator 2； Estrogen； Breast cancer；

Cell apoptosis； Cell proliferation

乳腺癌是全球婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤，雌激素受體陽(yáng)性（ER+）的乳腺癌患者占總比約70%[1]。目前乳腺癌早期診斷方法主要為影像學(xué)檢查，尋找診斷及判斷乳腺癌預(yù)后的明星基因十分必要[2]。染色體縮合調(diào)控子2（RCC2）也被稱作TD60，位于染色體1p36位點(diǎn)[3]。其在胃癌組織中顯著上調(diào)，可篩選結(jié)直腸癌高危人群，同時(shí)也是黑色素瘤復(fù)發(fā)及生存率的決定因素[4-6]。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RCC2可通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)肺腺癌的轉(zhuǎn)移[7]。盡管RCC2與眾多腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但RCC2是否參與乳腺癌的致病至今尚未明確。在本研究中，筆者探究了RCC2是否在乳腺癌的致病過(guò)程中發(fā)揮作用，以及雌激素是否參與其中，從而為更有效治療乳腺癌、提高患者生存率提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、材 料

1.乳腺組織的獲取

收集2014年6月至2016年12月滕州市中心人民醫(yī)院保存的18例患者的乳腺組織，其中乳腺癌組織13例（ER+組織8例、ER-組織5例），乳腺纖維瘤組織5例。18例患者的年齡為41（20～70 ）歲。本研究計(jì)劃經(jīng)山東省千佛山醫(yī)院及滕州市中心人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.細(xì)胞株

乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

3.主要試劑

MEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Corning公司；無(wú)酚紅DMEM購(gòu)于北京邁晨科技有限公司；葡聚糖-活性炭吸附血清購(gòu)于以色列BI公司；胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技股份有限公司；兔抗人RCC2單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖試劑購(gòu)于日本同仁公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)BioLegend公司；雌激素（雌二醇）純度>99%購(gòu)于Sigma公司。

二、方 法

1.乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞株MCF-7用含10%胎牛血清+0.01 mg/ml牛胰島素的MEM培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。做雌激素相關(guān)實(shí)驗(yàn)之前，在含5%葡聚糖-活性炭吸附血清的無(wú)酚紅DMEM中培養(yǎng)MCF-7共3 d。

2.蛋白免疫印跡法檢測(cè)RCC2的蛋白表達(dá)

包括以下步驟：①組織蛋白提取，稱量乳腺組織50 mg，加入裂解液充分研磨，冰上裂解30 min，于4℃ 12 000轉(zhuǎn)/分離心30 min。取上清，于95℃變性15 min，于-80℃保存?zhèn)溆?。②?xì)胞蛋白提取，轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，操作步驟同上。③蛋白免疫印跡法，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上，RCC2單克隆抗體（1∶ 1 000）4℃過(guò)夜，二抗（1∶ 5 000）37℃孵育2 h。用ECL發(fā)光液在熒光成像儀檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

3.小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染

將MCF-7鋪于6孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為Allstars siRNA組和RCC2 siRNA組，轉(zhuǎn)染步驟根據(jù)HiPerFect Transfection Reagent說(shuō)明書進(jìn)行。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取RNA。按TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RCC2的mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)體系為SYBR Green 5 μl，ddH2O 2 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，（95℃ 15 s，60℃ 34 s，72℃ 30 s）×45 cycle，72℃延伸3 min。

5.Cell Counting Kit-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞鋪于96孔板。分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h向相應(yīng)孔加入10 μl Cell Counting Kit-8溶液，培養(yǎng)箱孵育3 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（OD450），將數(shù)值進(jìn)行相應(yīng)統(tǒng)計(jì)。

6.Annexin V-FITC/PI流式分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h后取20×104～50×104個(gè)細(xì)胞離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞3遍，加入100 μl binding buffer 重懸，加入FITC 5 μl、PI 10 μl，混勻后室溫避光孵育15 min。每管加入400 μl binding buffer，重懸后上機(jī)檢測(cè)。

7.雌激素刺激實(shí)驗(yàn)

包括以下步驟：①雌激素的配制，以無(wú)水乙醇為溶劑，將雌二醇配制成濃度為10-2 mol/L的儲(chǔ)存液。用無(wú)酚紅DMEM加5%葡聚糖-活性炭吸附處理過(guò)的胎牛血清為溶劑配制不同濃度的雌二醇（10-12、10-10、10-8、10-6、10-4 mol/L）以及含0.1%無(wú)水乙醇的對(duì)照組。②用Cell Counting Kit-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，方法同上。③用Annexin V-FITC/PI流式分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡，方法同上。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示。完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的2組樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組相互獨(dú)立的樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；同一受試對(duì)象不同處理在不同時(shí)間點(diǎn)上變化情況的比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析了解2種處理因素的效應(yīng)及因素間交互作用。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RCC2在乳腺癌組織中的表達(dá)

各組間RCC2蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.851，P=0.001）。在此之后多重比較中，乳腺纖維瘤組織（0.242±0.054）與ER+乳腺癌組織（0.736±0.280）相比RCC2蛋白表達(dá)水平低（P=0.001）；而與ER-乳腺癌組織（0.352±0.115）相比RCC2蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.404），見(jiàn)圖1。

二、RCC2 siRNA對(duì)RCC2 mRNA水平和蛋白表達(dá)的作用

與Allstars siRNA組相比，RCC2 siRNA組中RCC2的mRNA水平降低約75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.177，P=0.019），見(jiàn)圖2A； 與Allstars siRNA組RCC2的蛋白水平（0.951±0.150）相比，RCC2 siRNA組（0.504±0.313）較其降低約45%，分子量為56 kDa，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.251，P=0.017），見(jiàn)圖2B、C。提示本實(shí)驗(yàn)所用si-RCC2能成功抑制MCF-7中RCC2 mRNA及蛋白水平的表達(dá)。

三、 RCC2 siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

RCC2 siRNA組與Allstars siRNA組的細(xì)胞增殖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F處理=0.003，P=0.957），且處理與時(shí)間的交互作用的方差分析結(jié)果顯示兩者的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間*處理=0.03，P=0.992），見(jiàn)圖3。提示抑制RCC2的表達(dá)對(duì)MCF-7的細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。

四、RCC2 siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，RCC2 siRNA組細(xì)胞凋亡比例為（16.87±2.00）%，較Allstars siRNA組的（11.63±3.37）%高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.679，P=0.037），見(jiàn)圖4。提示抑制RCC2的表達(dá)可促進(jìn)

五、雌二醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

不同濃度雌二醇處理組的MCF-7細(xì)胞增殖隨時(shí)間的變化趨勢(shì)不同，處理與時(shí)間的交互作用的方差分析結(jié)果顯示其交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間*處理=110.323，P<0.001，P-10<0.001，P-8<0.001，P-6<0.001，P- 六、雌二醇在MCF-7中對(duì)RCC2表達(dá)的影響

加入10-8 mol/L雌二醇處理MCF-7，分別在0、2、8、48 h收集細(xì)胞，檢測(cè)RCC2的表達(dá)。與0 h相比，RCC2的表達(dá)量隨時(shí)間的增加而增加，量化后的RCC2相對(duì)蛋白表達(dá)量作單因素方差分析在0 h（0.562±0.106）、2 h（0.818±0.676）、8 h（0.806±0.119）、48 h（1.235±0.304）之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.653，P=0.010）。與0 h相比，48 h的RCC2蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），見(jiàn)圖6。提示雌二醇在MCF-7中可促進(jìn)RCC2的表達(dá)。

七、雌二醇與RCC2 siRNA共同對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

MCF-7轉(zhuǎn)染24 h后，加入含0.1%乙醇的無(wú)酚紅DMEM或10-8mol/L雌二醇處理48 h，觀察2種因素對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，見(jiàn)圖7。析因分析結(jié)果顯示，雌二醇與RCC2 siRNA 2種因素在MCF-7細(xì)胞增殖方面交互效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.281，P=0.604），在MCF-7細(xì)胞凋亡方面交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.897，P=0.002）。其中加入雌二醇可抑制細(xì)胞凋亡（F=108.599，P<0.001）。提示雌二醇促進(jìn)細(xì)胞增殖不是通過(guò)調(diào)控RCC2實(shí)現(xiàn)的，而雌二醇抑制細(xì)胞凋亡可能通過(guò)調(diào)控RCC2實(shí)現(xiàn)。

討 論

乳腺癌是女性常見(jiàn)癌癥死亡原因之一，ER+乳腺癌是中老年乳腺癌的主要類型，雌激素在其致病過(guò)程中發(fā)揮重大作用[8]。RCC2是染色體乘客復(fù)合體（CPC）的一員，目前已知其在胃癌組織、黑色素瘤、肺腺癌、皮膚基底細(xì)胞癌患者及結(jié)直腸癌高危人群體內(nèi)顯著上調(diào)[4-7，9-10]。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過(guò)檢測(cè)不同類型乳腺組織RCC2蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與乳腺纖維瘤組織相比，ER+乳腺癌組織RCC2表達(dá)量更高，而ER-乳腺癌組織與乳腺纖維瘤組織之間RCC2的表達(dá)量無(wú)明顯差異，提示RCC2可能通過(guò)提高表達(dá)水平參與ER+乳腺癌的發(fā)展。

為了探究RCC2在ER+乳腺癌中的生物學(xué)功能，筆者選擇ER+乳腺癌細(xì)胞系MCF-7進(jìn)行一系列體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抑制RCC2在MCF-7中的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，說(shuō)明抑制RCC2可影響乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的凋亡。有研究顯示，RCC2參與細(xì)胞有絲分裂和紡錘體的組裝[9， 11]。此外，RCC2作為纖維蛋白依賴的黏附信號(hào)通路調(diào)控者參與調(diào)控Rac1和Arf6，從而影響細(xì)胞擴(kuò)散與定向遷移[12-15]。關(guān)于RCC2是通過(guò)何種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bruun等[5]認(rèn)為抑制RCC2促進(jìn)細(xì)胞凋亡這一現(xiàn)象可能與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，而RCC2作為CPC的一員與凋亡抑制基因Survivin等共同參與細(xì)胞有絲分裂和紡錘體的組裝，因此設(shè)想RCC2與Survivin共同參與有絲分裂，并通過(guò)影響細(xì)胞有絲分裂而調(diào)控細(xì)胞凋亡[9，11，16]。但具體通過(guò)何種通路調(diào)控尚需作進(jìn)一步探索。

鑒于ER+乳腺癌細(xì)胞ER+的特征，用最佳濃度的雌激素（雌二醇=10-8mol/L）刺激MCF-7，細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，凋亡能力明顯減弱，提示雌激素能夠影響ER+乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。為了探究雌激素是否通過(guò)RCC2影響ER+乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能，筆者用最佳濃度的雌激素作用于MCF-7，發(fā)現(xiàn)MCF-7中RCC2的表達(dá)量隨加入雌激素時(shí)間的增加而增加，說(shuō)明雌激素可在MCF-7中調(diào)控RCC2，促進(jìn)RCC2的表達(dá)。在抑制RCC2的基礎(chǔ)上加入雌激素刺激MCF-7，觀察2種因素共同作用于MCF-7時(shí)細(xì)胞增殖和凋亡的變化，結(jié)果提示雌二醇抑制細(xì)胞凋亡可能通過(guò)調(diào)控RCC2實(shí)現(xiàn)，而雌二醇促進(jìn)細(xì)胞增殖并非通過(guò)調(diào)控RCC2實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示了RCC2在ER+乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并影響ER+乳腺癌細(xì)胞凋亡，雌激素可能通過(guò)調(diào)控RCC2表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)ER+乳腺癌的癌變進(jìn)程。

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（收稿日期：2017-11-30）

（本文編輯：洪悅民）