杉木優(yōu)良無性系組培技術(shù)體系的建立

秦麗鳳

摘要：【目的】建立杉木（Cunninghamia lanceolata）優(yōu)良無性系組培快繁技術(shù)體系，為杉木規(guī)?；缣峁┘夹g(shù)支持。【方法】以桂林市全州縣15年生優(yōu)良杉木單株基部或根部萌芽條的莖尖為外植體，篩選最佳HgCl2浸泡滅菌時間；以1/2MS為基本培養(yǎng)基添加不同激素組合進行芽的誘導和增殖，以1/4MS為基本培養(yǎng)基添加不同生長素或生長素組合進行生根培養(yǎng)，篩選適宜杉木組織培養(yǎng)和快繁的培養(yǎng)基?！窘Y(jié)果】在改良培養(yǎng)基1/2MS+0.8 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.3 mg/L吲哚丁酸（IBA）中，杉木莖尖芽的誘導率達74.3%，平均芽長達2.3 cm；在改良培養(yǎng)基1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA中，杉木莖尖誘導芽的繼代培養(yǎng)增殖倍數(shù)適中，增殖芽生長較快，有效苗數(shù)較多；在改良培養(yǎng)基1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT 6號生根粉中，杉木繼代苗的生根率達90.7%。【結(jié)論】6-BA質(zhì)量濃度是影響杉木外植體誘導率的主要因素，同時影響新芽的萌發(fā)數(shù)量；IBA則主要影響新芽的生長速度。適宜質(zhì)量濃度的生長素可促進杉木組培苗生根，但質(zhì)量濃度過高會抑制苗木生根。在實際生產(chǎn)中，以1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA為杉木莖尖芽誘導和生長的培養(yǎng)基、1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA為杉木莖尖誘導芽的繼代增殖培養(yǎng)基、1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT 6號生根粉為杉木組培苗的生根培養(yǎng)基，可實現(xiàn)杉木優(yōu)良無性系規(guī)?；纭?/p>

關鍵詞： 杉木；無性系；組培快繁

中圖分類號： S791.27 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1183-06

Abstract：【Objective】A Cunninghamia lanceolata superior clone rapid propagation technology system was established to provide technical for large-scale C. lanceolata seedling production. 【Method】Using stem tip of stem base or root germination branch of 15-year C. lanceolata in Quanzhou， Guilin as the explants，the optimal HgCl2 soaking sterilization time was selected， and buds were induced and proliferated by adding different hormone combinations to 1/2MS as the basic medium， and different auxins or auxin combinations were added to 1/4MS as the basic medium for rooting culture，in order to screen out the appropriate medium in tissue culture of C. lanceolata. 【Result】The induction rate of bud of C. lanceolata stem tip was 74.3% and the average length of induced buds was 2.3 cm in culture medium of 1/2MS+0.8 mg/L 6-benzylaminopurine（6-BA）+0.3 mg/L indole butyric acid（IBA）. In culture medium 1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA， the subculture multiplication number of the induced buds was moderate， the bud growth was fast and effective bacteria number was large. Rooting rate of C. lanceolata subculture seedlings could be up to 90.7% in culture medium of 1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT No.6 rooting powder. 【Conclusion】6-BA mass concentration is the main factor that affects induction rate of C. lanceolata explant， and also affects germination number of buds. IBA mainly affects growth speed of the buds. The proper mass concentration of auxin can promote rooting of C. lanceolata tissue culture seedlings， but high mass concentration auxin inhibits the rooting. In actual production， using 1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA as medium for induction and growth of bud of C. lanceolata stem tip， 1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA as subculture medium for induced bud of C. lanceolata stem tip and 1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT No.6 rooting powder as rooting medium for tissue culture seedling of C. lanceolata， large-scale C. lanceolata superior clone seedling production can be realized.

Key words： Cunninghamia lanceolata； superior clone； rapid propagation

0 引言

【研究意義】杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國南方主要的速生用材樹種，生長快，產(chǎn)量高，干形通直圓滿，木材紋理通直，材質(zhì)輕韌，氣味芳香，抗蟲耐腐（劉建忠等，2016）。選擇優(yōu)良無性系進行擴大繁殖是發(fā)揮森林潛能、提高森林生產(chǎn)力及促進林木速生豐產(chǎn)的有效措施，而采用組培育苗，可不受杉木優(yōu)良種源種子產(chǎn)量低的限制，隨時滿足造林戶對優(yōu)質(zhì)種苗的需求，提高林農(nóng)造林的積極性。目前關于杉木優(yōu)良無性系組培研究的報道較多（蔡玲等，2013，2016；張建華，2014；李峰卿等，2017），但不同產(chǎn)地杉木優(yōu)良無性系的遺傳性狀存在差異，其在組培中的增殖率和生根率也存在明顯差異，極大影響杉木優(yōu)良無性系組培苗在生產(chǎn)上的推廣應用。因此，建立以桂林市全州縣15年生優(yōu)良杉木單株的組培快繁技術(shù)體系，對廣西杉木規(guī)模化育苗具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】陳劍勇（2009）以杉木優(yōu)良單株基部萌蘗條莖尖為外植體進行組培快繁試驗，篩選出愈傷組織誘導、不定芽分化增殖及生根的培養(yǎng)基分別為MS+0.2 mg/L 6-糖基腺嘌呤（KT）+1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、MS+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L吲哚丁酸（IBA）和1/2MS+0.5 mg/L萘乙酸（NAA）+0.2 mg/L IBA。林景泉（2011）研究表明，1/3MS+0.7 mg/L 6-芐基氨基嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L IBA+30.0 g/L蔗糖為較佳的杉木組培苗增殖培養(yǎng)基，1/2MS+0.4 mg/L NAA+1.2 mg/L IBA+30.0 g/L蔗糖為較佳的杉木組培苗生根培養(yǎng)基。付婷和李柏林（2013）研究發(fā)現(xiàn)，不同杉木優(yōu)良無性系樹干基部萌條的莖尖在相同類型培養(yǎng)基、相同活性炭和激素組合中增殖系數(shù)不同；添加活性炭可減少玻璃化現(xiàn)象，但作用時間過長會使組培苗老化。蔡玲等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，適宜杉木優(yōu)良無性系柳327叢芽繼代增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+0.7 mg/L 6-BA+0.3 mg/L KT+0.1 mg/L IBA，生根培養(yǎng)基為1/2MS+100.0 mg/L KH2PO4+3.0 mg/L吲哚乙酸（IAA）+2.0 mg/L IBA+0.8 mg/L ABT 6號生根粉。劉海鷹等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，杉木優(yōu)良無性系最佳初代誘導基本培養(yǎng)基為MS，最適增殖誘導培養(yǎng)基為MS+0.5～0.7 mg/L 6-BA+0～0.2 mg/L IBA，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS～1/4MS+0.5～1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA，最適杉木組培苗移栽基質(zhì)為泥炭土∶黃心土∶蛭石=4∶2∶1混合土。李峰卿等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，最適杉木優(yōu)良無性系繼代增殖培養(yǎng)基為DCR+0.4 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為1/4DCR+0.8 mg/L NAA?！颈狙芯壳腥朦c】不同杉木無性系的遺傳差異致使其對激素的敏感性不同，最適誘導、繼代增殖和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方也有所不同，而目前針對桂林市優(yōu)良杉木單株進行規(guī)?；M培快繁的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以桂林市全州縣15年生優(yōu)良杉木單株基部或根部萌芽條莖尖為外植體，采用添加不同激素組合的培養(yǎng)基進行誘導、增殖和生根培養(yǎng)，建立杉木優(yōu)良無性系組培技術(shù)體系，為廣西杉木規(guī)模化育苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用外植體為杉木莖尖，采自桂林市全州縣咸水林場1.5代杉木種子園自由授粉子代測定林優(yōu)良家系中的15年生優(yōu)良單株基部或根部萌芽條。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件設計 參考前人研究結(jié)果（鄭仁華，2008），以1/2MS為杉木莖尖誘導和增殖的基本培養(yǎng)基，添加2.5%蔗糖和4.8 g/L瓊脂；以1/4 MS為杉木莖尖增殖苗的生根培養(yǎng)基，添加1.5%蔗糖和5.0 g/L卡拉膠。培養(yǎng)基pH 5.6。所用抗氧化劑為抗壞血酸（Vc）和核黃素（VB2）。高溫滅菌15～20 min。培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照時間12～14 h/d，光照強度2000 lx。設3次重復，統(tǒng)計數(shù)據(jù)取3次重復的平均值。

1. 2. 2 外植體表面消毒及滅菌 于天氣晴朗時采集萌芽條，剪除密集的針葉，用0.2%洗潔精溶液刷洗表面塵埃，然后用0.1%新潔爾滅溶液浸泡30 min，純凈水沖洗3～5次，剪切成長2.0 cm的莖段，純凈水清洗2～3次后置于超凈臺上用75%酒精浸泡30 s進行消毒，無菌水清洗1次，再用0.1% HgCl2溶液分別浸泡5、8、12和15 min進行滅菌，邊浸泡邊振蕩，無菌水清洗4～5次后，分別接種于誘導培養(yǎng)基上進行腋芽誘導培養(yǎng)，每5 d觀察記錄1次外植體的污染、褐化和芽萌動情況，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計其污染率、褐化率和誘導率。

1. 2. 3 誘導培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化 誘導培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度6-BA（0.3、0.6、0.8和1.2 mg/L）和IBA（0.1、0.3和0.5 mg/L），共12個處理，每處理接種50個經(jīng)表面消毒滅菌的外植體進行光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)試驗（接種后在黑暗中培養(yǎng)10 d再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)）。根據(jù)試驗結(jié)果繼續(xù)對誘導培養(yǎng)基進行優(yōu)化調(diào)整，各處理統(tǒng)一培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計外植體的萌芽率（萌芽的外植體數(shù)占接種外植體總數(shù)的百分率）、萌芽外植體的平均出芽數(shù)及平均芽長。

1. 2. 4 繼代增殖培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化 誘導培養(yǎng)40～50 d、新芽長至2.0 cm以上時，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度6-BA（0.3、0.6、0.8和1.2 mg/L）和IBA（0.1、0.3和0.5 mg/L），共12個處理，每處理接種20瓶，每瓶接種2個新芽。繼代培養(yǎng)5代后統(tǒng)計各處理芽數(shù)和增殖倍數(shù)（每處理芽的總數(shù)/第1次轉(zhuǎn)接時芽的個數(shù)/繼代次數(shù)）觀察每處理的有效苗數(shù)（苗高2.0 cm以上、生長健壯的芽總數(shù)）和叢生芽數(shù)，根據(jù)試驗結(jié)果繼續(xù)對培養(yǎng)基進行優(yōu)化調(diào)節(jié)。

1. 2. 5 生根培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)中芽長2.0 cm以上的有效芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。設13個處理，分別為：1/4MS+0.5 mg/L NAA，1/4MS+1.0 mg/L NAA，1/4MS+2.0 mg/L NAA，1/4MS+0.5 mg/L IBA，1/4MS+1.0 mg/L IBA，1/4MS+2.0 mg/L IBA，1/4MS+0.5 mg/L ABT6，1/4MS+1.0 mg/L ABT6，1/4MS+2.0 mg/L ABT6，1/4MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，1/4MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L ABT6，1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6，1/4MS（不添加任何激素）。各處理培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計生根率、平均根長和平均根條數(shù)，記錄生根時間（轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基至開始出根的天數(shù)）和觀察苗的生長情況。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行統(tǒng)計及相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 HgCl2浸泡滅菌時間對杉木外植體表面滅菌效果的影響

由表1可知，隨著HgCl2浸泡滅菌時間的延長，杉木外植體的褐化率有所增加，污染率下降，芽的誘導率呈先上升后下降的變化趨勢。其中，滅菌8 min處理芽的誘導率達60.3%，顯著高于其他滅菌時間處理（P<0.05，下同）；褐化率為12.5%，顯著低于滅菌12和15 min處理，與滅菌5 min處理差異不顯著（P>0.05，下同）；污染率為27.2%，顯著低于滅菌5 min處理，顯著高于滅菌15 min處理，與滅菌12 min處理差異不顯著。說明杉木外植體的最佳HgCl2浸泡滅菌時間為8 min。

2. 2 光照對杉木外植體誘導的影響

由表2可知，外植體接種后暗培養(yǎng)10 d再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，其褐化率比直接光照培養(yǎng)顯著降低10.4%（絕對值，下同），但其誘導率顯著提高11.2%，直接光照培養(yǎng)及暗培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)對其污染率和萌芽率的影響無顯著差異?？梢?，暗培養(yǎng)能有效降低杉木外植體褐化程度，提高芽的誘導率。

2. 3 不同質(zhì)量濃度6-BA和IBA組合對杉木外植體誘導的影響

由表3可知，培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和IBA，外植體的誘導率、萌芽率和生長狀況均存在一定差異。對不同質(zhì)量濃度6-BA和IBA組合處理外植體的萌芽率進行方差分析和極差分析，結(jié)果（表4）表明，依據(jù)P值的大小可判斷，6-BA質(zhì)量濃度對杉木外植體萌芽率的影響達極顯著水平（P=2.09E-0.5<0.01），而IBA質(zhì)量濃度對杉木外植體萌芽率的影響（P=0.201658>0.05）不顯著；從K值判斷，6-BA以0.8 mg/L處理的萌芽率最理想（K3=83.0），IBA以0.3 mg/L處理的萌芽率最理想（K2=63.3）。說明在1/2MS中，杉木外植體芽誘導的最佳激素組合為0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA。

2. 4 不同質(zhì)量濃度6-BA和IBA組合對杉木芽繼代增殖的影響

由表5可知，隨著6-BA和IBA質(zhì)量濃度的增加，杉木芽繼代苗的生長速度逐漸減慢，叢生芽數(shù)增多，有效苗數(shù)減少。對不同質(zhì)量濃度6-BA和IBA組合處理杉木芽繼代苗的增殖倍數(shù)進行方差分析和極差分析，結(jié)果（表6）表明，依據(jù)P值判斷，6-BA質(zhì)量濃度對杉木芽繼代苗增殖倍數(shù)的影響達極顯著水平（P=2.09E-0.5<0.01），IBA質(zhì)量濃度對杉木芽繼代苗增殖倍數(shù)的影響不顯著（P=0.201658>0.05）；從K值判斷，6-BA以1.2和0.8 mg/L處理的增殖倍數(shù)較理想（K4=2.877，K3=2.600），0.6 mg/L處理次之（K2=2.283），0.3 mg/L處理不理想（K1=1.683）；IBA以0.5 mg/L處理的增殖倍數(shù)較理想（K3=2.473），0.3 mg/L處理次之（K2=2.458），0.1 mg/L處理不理想（K1=2.153）。綜合考慮1.2和0.8 mg/L 6-BA處理、0.5 mg/L IBA處理的繼代增殖芽生長速度慢，有效苗數(shù)較少，而0.6 mg/L 6-BA處理、0.3 mg/L IBA處理的增殖芽生長速度較快，有效苗數(shù)較多，因此選定0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA為杉木芽繼代增殖最佳激素組合，即在1/2MS中添加0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA進行杉木芽繼代增殖，符合工廠化育苗要求。

2. 5 生根培養(yǎng)基中添加生長素對杉木增殖苗生根的影響

從表7可知，生根培養(yǎng)基中添加激素對杉木生根有明顯的促進作用，生根率明顯提高，生根時間縮短；生根培養(yǎng)基中同時添加兩種生長素的生根率總體上較僅添加單一生長素的高，生根時間普遍縮短。

生根培養(yǎng)基中添加單一生長素時，總體上以添加IBA的生根率較高，其中以添加1.0 mg/L IBA的生根率最高，為78.0%，生根時間較短，根長適中，生根數(shù)最多；添加NAA的生根效果普遍較差，其中以添加2.0 mg/L NAA的生根率最低，僅24.5%，生根時間較長，根長較短，生根數(shù)較少。生根培養(yǎng)基中同時添加兩種生長素時，以添加0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6 的生根率最高，達90.7%，生根時間最短，根長最長，生根數(shù)適中；添加0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L ABT6的生根率最低，為70.2%，根長和生根數(shù)適中。對添加不同生長素處理的生根率進行方差分析，結(jié)果（表8）表明，生根培養(yǎng)基中添加不同生長素對杉木繼代苗生根率的影響達極顯著水平（P=0.000396<0.01）。說明1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6 為杉木繼代苗生根最佳培養(yǎng)基。

3 討論

初代培養(yǎng)時經(jīng)常遇到褐變現(xiàn)象，主要是外植體切口表面滲出的酚類物質(zhì)在光照條件下氧化成醌類物質(zhì)而引起（王玉英和高新一，2006），因此開始時把外植體置于黑暗處，待其切口愈合、外滲停止后再轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng)可降低褐化程度（鄭仁華，2008），本研究也獲得了相似研究結(jié)果，即以杉木莖尖為外植體進行暗培養(yǎng)可有效降低其褐化程度，提高誘導率。

杉木外植體誘導、繼代增殖和生根受外界培養(yǎng)條件的影響較明顯。本研究在1/2MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度6-BA和IBA組合，外植體的誘導率、萌芽率和生長狀況均存在明顯差異，其中6-BA質(zhì)量濃度是影響杉木外植體誘導率的主要因素，與曾雷等（2009）的研究結(jié)果一致；在繼代增殖培養(yǎng)過程中，6-BA和IBA質(zhì)量濃度對杉木繼代苗增殖具有重要影響，6-BA主要影響新芽的萌發(fā)數(shù)量，IBA主要影響新芽的生長速度，與鄭仁華（2008）的研究結(jié)果一致；在生根培養(yǎng)過程中，適宜質(zhì)量濃度的生長素可促進杉木組培苗生根，但質(zhì)量濃度過高會抑制苗木生根，與鄭仁華（2008）、林景泉（2011）、韋如萍等（2013）研究認為不同生長素間的交互效應對杉木組培苗生根影響明顯，生根培養(yǎng)時添加生長素的濃度和比例有較嚴格要求的觀點相似。

本研究僅以桂林市全州縣1.5代杉木種子園自由授粉子代測定林選出優(yōu)良家系中的15年生優(yōu)良單株基部或根部萌芽條莖尖為外植體建立杉木優(yōu)良無性系組培技術(shù)體系，在今后的研究中還需進一步篩選更優(yōu)良的無性系，選擇誘導率高、增殖和生長速度快、生根率和移栽成活率高的優(yōu)良無性系用于組培快繁。

4 結(jié)論

6-BA質(zhì)量濃度是影響杉木外植體誘導率的主要因素，同時影響新芽的萌發(fā)數(shù)量；IBA則主要影響新芽的生長速度。適宜濃度的生長素可促進杉木組培苗生長，但質(zhì)量濃度過高會抑制苗木生根。在實際生產(chǎn)中，以改良培養(yǎng)基1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA為杉木莖尖芽誘導和生長的培養(yǎng)基、1/2 MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA為杉木莖尖誘導芽的繼代增殖培養(yǎng)基、1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6為杉木組培苗的生根培養(yǎng)基，可實現(xiàn)杉木優(yōu)良無性系規(guī)模化育苗。

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（責任編輯 思利華）