基于間歇浸沒式生物反應(yīng)器的荔浦芋組培快繁體系優(yōu)化

董偉清　何芳練　江文　高美萍　楊柳　李小泉　蔣慧萍　黃詩宇　韋紹龍

摘要：【目的】優(yōu)化基于間歇浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)（TIBs）的荔浦芋組培快繁體系，為荔浦芋脫毒組培苗的工廠化、自動化生產(chǎn)提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳岳笃钟笮缕贩N桂芋2號莖尖分生組織脫毒誘導(dǎo)獲得的不定芽為外植體，利用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)篩選出適合組培苗增殖及生根的最佳激素組合，并分析不同繼代材料、接種密度及浸沒間歇頻率對組培苗增殖和生根效果的影響?！窘Y(jié)果】利用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)可有效提高荔浦芋組培苗的增殖效果，增殖倍數(shù)達28.96倍，約是傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法（2.87倍）的10倍，且組培苗的株高和生根數(shù)均極顯著高于傳統(tǒng)固體培養(yǎng)植株（P<0.01）。在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中，含4.00 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.05 mg/L萘乙酸（NAA）的培養(yǎng)基最適合荔浦芋組培苗增殖和生長，其組培苗增殖倍數(shù)為32.04倍。當接種材料為第4代荔浦芋繼代材料、接種密度為10株/L、浸沒間歇頻率為5 min/6 h時，最有利于組培苗增殖和生長，增殖倍數(shù)均在30.00倍以上，可縮短萌芽時間，組培苗長勢良好，且培養(yǎng)基污染率為0?！窘Y(jié)論】利用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)對荔浦芋繼代材料進行高效快繁具有可行性，可為實現(xiàn)及推動荔浦芋健康種苗繁育的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 荔浦芋；組培快繁；間歇浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)（TIBs）；體系優(yōu)化

中圖分類號： S632.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1164-07

Abstract：【Objective】The rapid propagation system of Lipu taro was optimized by using temporary immersion bioreactors system（TIBs） in order to provide technical supports for industrialized and automated production of its virus-free plantlets. 【Method】The adventitious buds induced by meristem of Lipu taro variety Guiyu 2 was used as explants， the suitable hormone combination for multiplication and rooting of adventitious buds was screened by using TIBs， and the effects of different subculture materials， inoculated densities and intermittent frequencies of TIBs on the multiplication and rooting were analyzed. 【Result】In TIBs， the multiplication effect of Lipu taro plantlets was enhanced effectively， and the multiplication rate of buds reached 28.96 times， which was as 10 times as that of traditional solid culture（2.87 times）； and both of plantlet height and rooting number of induced plantlets were extremely higher than those of traditional solid culture（P<0.01）. The hormone combination of 4.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA added in culture medium was the best for multiplication and growth of Lipu taro plantlets in TIBs， and the multiplication rate of plantlet reached 32.04 times. When the 4th sub-cultured plantlet was used as explants， 10 plantlets per liter of inoculation densities and 5 min per 6 hours of immersion frequency were found to be the best for growth and multiplication of plantlets， the multiplication rate reached more than 30.00 times， and could shorten the germination of plantlets with well growth vigor in TIBs， and the contamination rate of culture medium was 0. 【Conclusion】The results showed that it is of highly practicable to use TIBs for rapid propagation of Lipu taro sub-culture plantlets， this will provide important technical supports for implementing and promoting large-scale industrialized production of Lipu taro healthy seedling propagation.

Key words： Lipu taro； rapid propagation； temporary immersion bioreactors system（TIBs）； system optimization

0 引言

【研究意義】芋（Colocasia esculenta L.）又名芋艿、芋頭或毛芋，是天南星科芋屬中能形成地下球莖的栽培種，是一種重要的蔬菜和藥用植物，在我國具有悠久的栽培歷史，已被列為我國14種重點發(fā)展的特色蔬菜（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，2010）。芋還是迄今發(fā)現(xiàn)耐鹽性最強的蔬菜作物，長期栽培可降低土壤的鹽漬化程度，對灘涂的開發(fā)利用具有重要意義。廣西是芋的主產(chǎn)區(qū)之一，以盛產(chǎn)荔浦芋而聞名，根據(jù)園藝學(xué)分類，荔浦芋為魁芋類粗魁芋副型檳榔芋品種群，其芋肉有紅絲，肉質(zhì)細膩、松軟、香粉糯，具有特殊風味，是國家地理標志產(chǎn)品之一（江發(fā)茂和歐利，2016；覃自由等，2017）。芋的常規(guī)栽培是以球莖為種，每公頃用種量1500～2250 kg，不僅耗費大量商品芋，還需要解決芋種的越冬問題。此外，由于忽視種源提純復(fù)壯工作，荔浦芋品質(zhì)已出現(xiàn)嚴重退化，其抗病抗逆性能及產(chǎn)量品質(zhì)明顯下降。隨著荔浦芋產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，荔浦芋脫毒組培苗的需求量迅速增長，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基組培方式已難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，亟需建立高效快速的荔浦芋組培快繁體系以滿足生產(chǎn)上對荔浦芋脫毒種苗的需求?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)關(guān)于芋的組織培養(yǎng)已有大量研究報道，主要包括莖尖脫毒、提純復(fù)壯及快繁技術(shù)（崔瑾，2002；張志勇等，2008）。其中，采用傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)莖頂生長點附近的芽（頂芽、腋芽），使之大量分蘗繁殖并誘導(dǎo)生根，形成完整植株，既可保持品種的優(yōu)良品質(zhì)，又能節(jié)約用種成本（韓曉勇等，2014；殷劍美等，2015；張培通等，2017）。間歇浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)（Temporary immersion bioreactors system，TIBs）是一種在無菌環(huán)境下將組培材料在培養(yǎng)液中進行周期性浸泡培養(yǎng)的快繁方式，可使組培材料獲得最大的增殖倍數(shù)（Etienne and Berthouly，2002；楊柳等，2010b）。這種培養(yǎng)方式的優(yōu)點是可刺激和促進組培苗對營養(yǎng)元素和激素的吸收，同時因培養(yǎng)介質(zhì)的間歇及連續(xù)振動能有效保障液體培養(yǎng)基中氧氣充足，從而更有利于提高組培苗的增殖效率（Mehrotra et al.，2007）。由于TIBs簡化了部分培養(yǎng)環(huán)節(jié)，減少了人工操作過程，降低了生產(chǎn)成本，因此，國內(nèi)外利用其進行組織快繁研究的植物種類越來越多，如馬鈴薯（Xuan et al.，2003）、蘋果（Zhu et al.，2005）、香蕉（Ikram-ul-Haq and Dahot，2007；楊柳等，2010a）、甘蔗（Bernal et al.，2008；Mordocco et al.，2009）、草莓（張喬麗等，2014）等均已有相關(guān)報道。【本研究切入點】傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法是一種勞動密集型技術(shù)，生產(chǎn)成本高，不利于產(chǎn)業(yè)擴大，因此，基于液體培養(yǎng)基的流動特性，采用自動化、機械化方法進行組織培養(yǎng)以擴大生產(chǎn)規(guī)模及提供優(yōu)質(zhì)種苗已成為研究熱點，但至今尚無應(yīng)用TIBs進行荔浦芋組培快繁的相關(guān)研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以荔浦芋新品種桂芋2號莖尖分生組織脫毒誘導(dǎo)獲得的不定芽為外植體，利用TIBs進行組培快繁研究，并優(yōu)化相關(guān)技術(shù)體系參數(shù)，以期為荔浦芋脫毒組培苗的工廠化、自動化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所選育的桂芋2號莖尖分生組織脫毒誘導(dǎo)不定芽為外植體材料。參照Lorenzo等（2001）的設(shè)計路線建立基于TIBs的荔浦芋組培快繁體系，其中，培養(yǎng)瓶和儲液瓶為容積3.0 L的廣口白色玻璃瓶（瓶高30.0 cm，直徑15.0 cm），儲液瓶中的液體培養(yǎng)基體積為1.0 L，培養(yǎng)基配置完成后，整套裝置采用濕熱滅菌法進行滅菌后備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法與TIBs培養(yǎng)方法比較 傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法的增殖培養(yǎng)基為MS+3.00 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.05 mg/L萘乙酸（NAA）+30.00 g/L蔗糖，生根培養(yǎng)基為MS+0.30 mg/L NAA+0.40 mg/L吲哚乙酸（IBA）+30.00 g/L蔗糖。TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置參照Lorenzo等（2001）的方法，接種密度10株/L，浸沒間歇頻率（浸沒/間歇）5 min/6 h。TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)繼代增殖培養(yǎng)30 d，傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法每18 d繼代1次。比較不同培養(yǎng)方法對組培苗增殖倍數(shù)、株高及生根數(shù)等指標的影響。

1. 2. 2 不同激素組合對荔浦芋TIBs組培快繁效果的影響 選用傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4代荔浦芋組培苗為材料，接種密度10株/L，TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)浸沒間歇頻率為5 min/6 h，6-BA質(zhì)量濃度分別為2.00、3.00、4.00和5.00 mg/L，NAA質(zhì)量濃度分別為0.05和0.10 mg/L，比較不同激素組合對組培苗增殖倍數(shù)、株高及葉片數(shù)等指標的影響。

1. 2. 3 不同繼代不定芽對荔浦芋TIBs組培快繁效果的影響 選用傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的第1～8代荔浦芋組培苗為材料，增殖培養(yǎng)基為MS+4.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+30.00 g/L蔗糖，TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)浸沒間歇頻率為5 min/6 h，接種密度10株/L，比較不同繼代材料（不定芽）對組培苗增殖倍數(shù)、萌芽時間、株高及葉片數(shù)等指標的影響。

1. 2. 4 不同接種密度對荔浦芋TIBs組培快繁效果的影響 選用傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法培養(yǎng)的第4代荔浦芋組培苗為材料，增殖培養(yǎng)基配方及TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)浸沒間歇頻率參數(shù)同1.2.3，接種密度分別設(shè)為5、10、15、20和25株/L，比較不同接種密度對組培苗增殖倍數(shù)、株高、萌芽時間、葉片數(shù)及污染率等指標的影響。

1. 2. 5 不同浸沒間歇頻率對荔浦芋TIBs組培快繁效果的影響 選用傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法培養(yǎng)的第4代荔浦芋組培苗為材料，接種密度及增殖培養(yǎng)基同1.2.3，TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)浸沒間歇頻率按浸沒5 min后分別間歇1、3、6、12和24 h，比較分析不同浸沒間歇頻率對組培苗增殖倍數(shù)、株高、萌芽時間、葉片數(shù)及污染率等指標的影響。

以上各試驗每處理均設(shè)8套TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)，重復(fù)3次。繼代增殖培養(yǎng)條件：溫度（28±1）℃，光照強度1500 lx，光照周期為光照12 h/黑暗12 h；生根培養(yǎng)條件：溫度（28±1）℃，光照強度1500 lx，光照周期為光照14 h/黑暗10 h。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0的SNK法進行統(tǒng)計及多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 荔浦芋TIBs組培快繁效果

以荔浦芋莖尖分生組織脫毒誘導(dǎo)處理獲得的第4代不定芽為材料，利用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)（圖1）及傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法進行組織快繁培養(yǎng)，結(jié)果（表1）顯示，采用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)獲得的荔浦芋組培苗增殖倍數(shù)達28.96倍，約是傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法（2.87倍）的10倍，二者差異極顯著（P<0.01，下同）；TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)獲得的組培苗株高達16.47 cm，比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)獲得的組培苗高8.24 cm；此外，TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)獲得的組培生根苗健壯（圖1-D），生根數(shù)也極顯著高于傳統(tǒng)固體培養(yǎng)植株。

2. 2 不同激素組合對荔浦芋TIBs組培苗的影響

利用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)進行荔浦芋組培快繁時，培養(yǎng)基中添加適宜的激素組合對組培苗的增殖和生長起重要作用。由表2可知，當NAA質(zhì)量濃度固定為0.05或0.10 mg/L時，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，組培苗的增殖倍數(shù)和株高均呈增加趨勢，但其葉片數(shù)無明顯變化，各處理組間差異均不顯著（P>0.05，下同）。其中，6-BA為5.00 mg/L、NAA為0.05 mg/L時，組培苗的增殖倍數(shù)達36.94倍，顯著高于其他組合（P<0.05，下同）；而在NAA為0.10 mg/L處理中組培苗的增殖倍數(shù)顯著小于0.05 mg/L處理。當培養(yǎng)基中的NAA為0.05 mg/L、6-BA為5.00 mg/L時，組培苗的株高最高，為15.30 cm，顯著高于除NAA 0.10 mg/L、6-BA 5.00 mg/L處理外的其他組合。此外，研究發(fā)現(xiàn)當6-BA質(zhì)量濃度達5.00 mg/L時，雖然組培苗的增殖倍數(shù)及株高均有明顯提高，但其植株較細、長勢較其他處理濃度差，可能與6-BA質(zhì)量濃度過高有關(guān)。因此，綜合考慮荔浦芋組培苗的變異率，保證植株質(zhì)量的同時不影響組培苗增殖，荔浦芋TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中以添加4.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的組培快繁效果最優(yōu)。

2. 3 不同繼代材料對荔浦芋TIBs組培苗的影響

由表3可知，在以TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)進行荔浦芋組培苗快速繁殖的過程中，不同荔浦芋組培繼代材料對組培苗增殖和生長的影響存在明顯差異。以第1～2代荔浦芋組培苗為接種材料時，其增殖倍數(shù)在10.00倍左右；第3～7代組培苗的增殖倍數(shù)均顯著高于第1～2代；組培苗繼代數(shù)不同對荔浦芋TIBs組培苗的萌芽時間、株高、葉片數(shù)的影響也存在明顯差異，綜合3項指標，以第4代組培苗為材料時的組培快繁效果較優(yōu)。在污染率方面，第1～5代組培苗的污染率均為零，而第6和7代組培苗的污染率分別為16.29%和18.61%。因此，在保證荔浦芋組培苗有足夠材料且不影響其增殖的情況下，宜選擇第4代組培苗作為TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)的繼代材料。

2. 4 不同接種密度對荔浦芋TIBs組培苗的影響

由表4可知，荔浦芋組培苗增殖倍數(shù)隨接種密度的增加呈先增加后減少的變化趨勢，其中以接種密度為10和15株/L時的增殖效果最佳，對應(yīng)的增值倍數(shù)分別為32.17和32.86倍。組培苗的萌芽時間整體上隨接種密度的增加呈縮短趨勢，接種密度為5株/L時的萌芽時間（6.23 d）顯著長于其他接種密度；而接種密度為15～25株/L的萌芽時間差異不顯著。不同接種密度對荔浦芋組培苗株高及葉片數(shù)的影響不顯著，但隨接種密度的增加，培養(yǎng)基污染率呈遞增趨勢，接種密度為25株/L時的污染率高達36.54%。因此，綜合考慮組培苗的增殖倍數(shù)、生長情況及其污染風險，確定以10株/L的接種密度最適宜。

2. 5 不同浸沒間歇頻率對荔浦芋TIBs組培苗的影響

由表5可知，隨著浸沒間歇頻率的降低，荔浦芋TIBs組培苗的增殖倍數(shù)呈先增加后減少的變化趨勢，當浸沒間歇頻率為5 min/6 h時，組培苗的增殖倍數(shù)最高（32.42倍），顯著高于其他浸沒間歇頻率處理。不同浸沒間歇頻率處理對組培苗的萌芽影響不顯著，萌芽時間均在3.50 d左右；組培苗的株高、生根數(shù)及根長隨浸沒間歇頻率的降低而呈遞增趨勢，當浸沒間歇頻率為5 min/24 h時，組培苗株高達17.45 cm，生根數(shù)為17.27根/株，根長為11.09 cm，但與此同時培養(yǎng)基受污染的風險提高，培養(yǎng)基污染率達17.62%。因此，綜合考慮荔浦芋組培苗的繼代增殖效果及培養(yǎng)基污染情況，TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)的浸沒間歇頻率以5 min/6 h為宜。

3 討論

利用生物反應(yīng)器進行優(yōu)質(zhì)健康種苗大規(guī)模自動化培養(yǎng)是解決重要經(jīng)濟作物市場供苗需求的最佳途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中荔浦芋組培苗的增殖倍數(shù)高達28.96倍，約是傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法的10倍，其原因：一方面是TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)對組培材料的周期性浸泡培養(yǎng)，有效抑制了頂端優(yōu)勢而促使更多葉芽誘導(dǎo)及增殖；另一方面，培養(yǎng)材料能充分接觸液體培養(yǎng)基，更有利于對營養(yǎng)元素和植物激素的吸收，從而促進葉芽增殖（張喬麗等，2014）。此外，在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中，液體培養(yǎng)基是以過濾除菌的空氣作為動力對組培苗進行浸沒間歇式培養(yǎng)（Lorenzo et al.，2001），保障培養(yǎng)基中擁有足夠的氧氣，從而促進組培苗快速生長（湯青林等，2006）。

植物激素在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用（李祖芳等，2017）。在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中，由于組培苗與液體培養(yǎng)基直接接觸，促使植物激素能更有效地調(diào)控組培苗的增殖和發(fā)育；而在培養(yǎng)基中所添加的激素種類及其配比對細胞誘導(dǎo)分化及生長起決定性作用（胡雪丹等，2016；李敏等，2016）。李瑞雪等（2012）研究表明，高濃度的細胞分裂素與低濃度的生長素配合可直接誘導(dǎo)外植體再生不定芽或誘導(dǎo)形成胚狀體，其中6-BA對莖尖及葉片的發(fā)育具有顯著促進作用。本研究結(jié)果表明，在利用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)進行荔浦芋組培苗快速繁殖的過程中，以4.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的激素配比最適合組培苗的增殖和發(fā)育。在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中不同繼代組培苗的增殖效果也不相同。Quiala等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，以第2代菠蘿繼代苗為TIBs培養(yǎng)材料時，菠蘿組培苗的增殖和生長能力較好；楊柳等（2010a）研究發(fā)現(xiàn)，以第7代的香蕉繼代苗為培養(yǎng)材料時，香蕉組培苗的生長和增殖效果最優(yōu)。本研究結(jié)果表明，在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中為保證荔浦芋組培苗有足夠材料且不影響其增殖的情況下，宜選擇第4代組培苗作為快速擴繁的繼代材料。此外，在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中外植體的接種密度對組培苗增殖影響顯著。楊柳等（2010a）研究發(fā)現(xiàn)，在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中接種密度為10株/L時最適合香蕉組培苗的生長和增殖；但接種密度為10～15株/L時，甘蔗組培苗的生長和增殖效果最優(yōu)（楊柳等，2011）。高美萍等（2016）研究表明，接種密度為10株/L時慈姑組培苗的生長和增殖效果最優(yōu)，且污染率為0。本研究結(jié)果表明，利用TIBs進行荔浦芋組培苗大規(guī)模培養(yǎng)時，反應(yīng)器中的接種密度以10株/L為宜，既可控制培養(yǎng)基污染率，又可促進組培苗增殖和生長。

基于TIBs的組培方式為浸沒間歇培養(yǎng)，組培苗在沒有培養(yǎng)基浸沒時可能會分泌代謝產(chǎn)物，而有培養(yǎng)基浸沒時代謝產(chǎn)物可溶于培養(yǎng)基中并不斷積累，對組培苗的分化生長起促進或抑制作用（劉麗敏等，2013）。浸沒間歇頻率是TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)的一個重要參數(shù)，能影響組培苗的增殖和生長，但不同作物對浸沒間歇頻率參數(shù)的要求不同。Pérez等（2013）研究表明，相對于1 min/12 h的浸沒間歇頻率，1 min/6 h或1 min/4 h的浸沒間歇頻率能顯著增加栓皮櫟體細胞胚組織的數(shù)量和質(zhì)量；Valdez-Tapia等（2014）研究指出，浸沒間歇頻率為5 min/24 h較5 min/12 h對酒店草組培苗的影響更明顯。本研究結(jié)果顯示，浸沒間歇頻率為5 min/6 h時最有利于荔浦芋組培苗的增殖和生長，同時發(fā)現(xiàn)提高浸沒間歇頻率有利于降低培養(yǎng)基的污染風險，但其具體原因有待進一步探究。

4 結(jié)論

在TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)中，適宜荔浦芋組培苗增殖生長的培養(yǎng)基激素組合為4.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，在以第4代繼代材料為外植體進行培養(yǎng)、接種密度為10株/L、浸沒間歇頻率為5 min/6 h的條件下，組培苗的增殖倍數(shù)均在30.00倍以上，說明利用TIBs培養(yǎng)系統(tǒng)對荔浦芋繼代材料進行高效快繁具有可行性，可為實現(xiàn)及推動荔浦芋健康種苗繁育的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

參考文獻：

崔瑾. 2002. 芋（Colocasia esculenta L. Schott）脫毒快繁體系的構(gòu)建以及組培苗無糖培養(yǎng)的研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué). [Cui J. 2002. Study on construction micropropagation system of virus-free taro（Colocasia esculenta L. Schott） and on sugar-free tissue culture[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.]

高美萍，林志城，張馳，江文，何芳練，楊柳，韋紹龍. 2016. 利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進行慈姑組培快繁研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，29（11）：2704-2708. [Gao M P，Lin Z C，Zhang C，Jiang W，He F L，Yang L，Wei S L. 2016. Optimization of Sagittaria sagittifolia rapid propagationin temporary immersion bioreactors system[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，29（11）：2704-2708.]

韓曉勇，宋婷婷，王立，張培通，郭文琦，李春宏，殷劍美. 2014. 靖江香沙芋組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（1）：50-52. [Han X Y，Song T T，Wang L，Zhang P T，Guo W Q，Li C H，Yin J M. 2014. Study on tissue culture and rapid propagation of Jingjiang taro[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，43（1）：50-52.]

胡雪丹，張曼，侯茜，徐錦華，劉廣，姚協(xié)豐，李蘋芳，任潤生，陳學(xué)好，羊杏平. 2016. 不同影響因子誘導(dǎo)葫蘆花藥愈傷組織[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，32（5）：1155-1161. [Hu X D，Zhang M，Hou Q，Xu J H，Liu G，Yao X F，Li P F，Ren R S，Chen X H，Yang X P. 2016. Induction of calli in anther culture of gourd influenced by temperature，hormone and activated carbon[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，32（5）：1155-1161.]

江發(fā)茂，歐利. 2016. 荔浦縣荔浦芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及栽培技術(shù)[J]. 長江蔬菜，（8）：27-28. [Jiang F M，Ou L. 2016. Development status and cultivation techniques of Lipu taro industry in Lipu County[J]. Journal of Changjiang Vegetables，（8）：27-28.]

李敏，王樸，路喆，王自健，蔣新明. 2016. 不同激素、處理時間及基質(zhì)對兩種大馬士革玫瑰扦插生根率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，32（1）：207-210. [Li M，Wang P，Lu Z，Wang Z J，Jiang X M. 2016. Effects of hormones，trea-ting time and substrates on cutting rooting rates in two varieties of Rosa damascena Mill[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，32（1）：207-210.]

李瑞雪，汪泰初，胡飛，賈鴻英，王偉. 2012. 6-BA、IBA、NAA對桑組培苗繼代增殖的影響[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報，2（11）：37-39. [Li R X，Wang T C，Hu F，Jia H Y，Wang W. 2012. Influence of 6-BA，IBA and NAA on sub-proliferation of mulberry tissue culture[J]. Journal of Agriculture，2（11）：37-39.]

李祖芳，孟瀟，秦江南，張銳，高山. 2017. 植物生長調(diào)節(jié)劑在核桃上的應(yīng)用研究進展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，45（9）：31-33. [Li Z F，Meng X，Qin J N，Zhang R，Gao S. 2017. Advances in application of plant growth regulators in walnut production[J]. Guizhou Agricultural Sciences，45（9）：31-33.]

劉麗敏，吳凱朝，余坤興，劉俊仙，劉紅堅，周珊，淡明，盧曼曼，楊柳，游建華，李松. 2013. TIBs和傳統(tǒng)培養(yǎng)方式培養(yǎng)的甘蔗脫毒苗生理生化指標比較[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，26（4）：1444-1447. [Liu L M，Wu K C，Yu K X，Liu J X，Liu H J，Zhou S，Dan M，Lu M M，Yang L，You J H，Li S. 2013. Comparison of several physiological and biochemical parameters in virus-free sugarcane seedlings produced by TIBs and traditional tissue culture methods[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，26（4）：1444-1447.]

覃自由，葉國春，江發(fā)茂. 2017. 荔浦芋生產(chǎn)現(xiàn)狀、問題及發(fā)展對策[J]. 長江蔬菜，（16）：23-25. [Qin Z Y，Ye G C， Jiang F M. 2017. Production status，problems and develo-pment countermeasures of Lipu taro[J]. Journal of Chang-jiang Vegetables，（16）：23-25.]

湯青林，牛義，王志敏，王小佳，宋明，李啟波. 2006. 芋芽繼代培養(yǎng)中激素、水解乳蛋白、碳源的調(diào)節(jié)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，19（5）：928-930. [Tang Q L，Niu Y，Wang Z M，Wang X J，Song M，Li Q B. 2006. Study on effect of hormone，LH and carbon source in taro buds sub-culture[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，19（5）：928-930.]

楊柳，秦鋼，粟靖，楊麗濤，羅瑞鴻，李小泉，林貴美，鄒瑜，李楊瑞. 2010a. 利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進行香蕉（Musa AAA Cavendish var. Williams B6）組培快繁研究[J]. 果樹學(xué)報，27（6）：1010-1013. [Yang L，Qin G，Su J，Yang L T，Luo R H，Li X Q，Lin G M，Zou Y，Li Y R. 2010a. Micro-propagation of banana（Musa AAA Cavendish var. Williams B6） in temporary immersion bioreactor system（TIBs）[J]. Journal of Fruit Science，27（6）：1010-1013.]

楊柳，秦鋼，楊麗濤，羅瑞鴻，游建華，Ariel D Arencibia，魏源文，李楊瑞. 2010b. 利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進行果蔗組培快繁[J]. 熱帶作物學(xué)報，31（4）：614-620. [Yang L，Qin G，Yang L T，Luo R H，You J H，Arencibia A D，Wei Y W，Li Y R. 2010b. Optimization of Saccharum sinensis Roxb rapid multiplication in temporary immersion bioreactors system[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，31（4）：614-620.]

楊柳，秦鋼，楊麗濤，吳建明，羅瑞鴻，魏源文，李楊瑞. 2011. 利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器進行甘蔗組培快繁的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，32（3）：37-41. [Yang L，Qin G，Yang L T，Wu J M，Luo R H，Wei Y W，Li Y R. 2011. Optimization of sugarcane rapid propagation in temporary immersion bioreactors system[J]. Journal of South China Agricultural University，32（3）：37-41.]

殷劍美，韓曉勇，王立，張培通，郭文琦，李春宏. 2015. 靖江香沙芋脫毒組培技術(shù)效應(yīng)及種芋擴繁要點[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（8）：151-153. [Yin J M，Han X Y，Wang L，Zhang P T，Guo W Q，Li C H. 2015. Technical effect of virus-free tissue culture of Jingjiang taro and its key points for propagation of seed-used taro[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，43（8）：151-153.]

張培通，殷劍美，王立，韓曉勇，劉水東，吳薇，常蕾，羅敏. 2017. 芋頭脫毒快繁技術(shù)規(guī)程[J]. 蔬菜，（10）：39-42. [Zhang P T，Yin J M，Wang L，Han X Y，Liu S D，Wu W，Chang L，Luo M. 2017. Technical regulations for virus-free and rapid propagation of taro[J]. Vegetables，（10）：39-42.]

張喬麗，邵微，高利梅，姚允聰，姬謙龍. 2014. 間歇浸沒式生物反應(yīng)器快繁草莓脫毒苗的參數(shù)[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，29（2）：20-24. [Zhang Q L，Shao W，Gao L M，Yao Y C，Ji Q L. 2014. Micro-propagation of Fragaria×ananassa Duch. optimization of process parameters in temporary immersion bioreactors system[J]. Journal of Beijing University of Agriculture，29（2）：20-24.]

張志勇，黃萍萍，梁金平. 2008. 芋莖尖脫毒應(yīng)用研究進展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，20（7）：52-53. [Zhang Z Y，Huang P P，Liang J P. 2008. Research progress on application of taro stem tip virus-free[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，20（7）：52-53.]

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所. 2010. 中國蔬菜栽培學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社. [Institute of Vegetable and Flower， Chinese Academy of Agricultural Sciences. 2010. Chinese Vegetable Cultivation[M]. Beijing：China Agriculture Press.]

Bernal A，Machado P，Cortegaza L，Carmona E R，Rivero O，Cabrera M，Zayas C M，Nodarse O，Perez A，Santana I，Arencibia A D. 2008. Priming and biopriming integrated into the sugarcane micropropagation technology by temporary immersion bioreactors（TIBs）[J]. Sugar Techno-logy，10（1）：42-47.

Etienne H，Berthouly M. 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，69（3）：215-231.

Ikram-ul-Haq，Dahot M U. 2007. Effect of permanent and temporary immersion system on banana micro-propagation[J]. Pakistan Journal of Botany，39（5）：1763-1772.

Lorenzo J C，Ojeda E，Espinosa A，Borroto C. 2001. Field performance of temporary immersion bioreactor-derived su-garcane plants[J]. In Vitro Cellular & Development Biology-plant，37（6）：803-806.

Mehrotra S，Goel M K，Kukreja A K，Mishra B N. 2007. Efficiency of liquid culture systems over conventional micropropagation：A progress towards commercialization[J]. African Journal of Biotechnology，6（13）：1484-1492.

Mordocco A M，Brumbley J A，Lakshmanan P. 2009. Development of a temporary immersion system（RITA?） for mass production of sugarcane（Saccharum spp. interspecific hybrids）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，45（4）：450-457.

Pérez M，Bueno M A，Escalona M，Toorop P，Rodríguez R，Ca?al M J. 2013. Temporary immersion systems（RITA） for the improvement of corkoak somatic embryo genetic culture proliferation and somatic embryo production[J]. Trees，27（5）：1277-1284.

Quiala E，Ca?al M J，Meijón M，Rodríguez R，Chávez M，Valledor L，de Feria M，Barbón R. 2012. Morphological and physiological responses of proliferating shoots of teak to temporary immersion and BA treatments[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，109（2）：223-234.

Valdez-Tapia R，Capataz-Tafur J，López-Laredo A R，Trejo-Espino J L，Trejo-Tapia G. 2014. Effect of immersion cycles on growth， phenolics content， and antioxidant pro-perties of Castilleja tenuiflora shoots[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，50（4）：471-477.

Xuan C，Chakrabarty D，Hahn E J，Paek K Y. 2003. A simple method for mass production of potato microtubers using a bioreactor system[J]. Current Science，84（8）：81-86.

Zhu L H，Li X Y，Welander M. 2005. Optimisation of growing conditions for the apple rootstock M26 grown in RITA containers using temporary immersion principle[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，81（3）：313-318.

（責任編輯 蘭宗寶）