RNAi在昆蟲基因功能研究中的應(yīng)用進(jìn)展

張濤 郅軍銳 葉茂

摘?要：RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由小分子dsRNA引起目的基因mRNA序列特異性降解，導(dǎo)致靶標(biāo)基因沉默或表達(dá)量下調(diào)的現(xiàn)象。 RNAi在昆蟲重要生理酶相關(guān)基因功能的研究中起著至關(guān)重要的作用。本文主要對(duì)RNAi不同方法的應(yīng)用、各方法的優(yōu)缺點(diǎn)及影響RNAi效率的因素進(jìn)行了綜述，總結(jié)了RNAi不同方法對(duì)昆蟲功能基因沉默效果的差異，及在昆蟲基因功能研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：RNA干擾;基因功能;脫靶效應(yīng);害蟲防治

中圖分類號(hào)：S476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2018）06-0063-07?國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.011

昆蟲的RNA干擾（RNA interference，RNAi）主要指外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的，通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，引起內(nèi)源靶標(biāo)mRNA降解，從而導(dǎo)致靶標(biāo)基因沉默或表達(dá)量明顯下調(diào)的現(xiàn)象[1]。對(duì)于揭示昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及抗性相關(guān)基因的功能具有不可或缺的作用。近年來，基于昆蟲基因組學(xué)[2-3]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)[4]、代謝組學(xué)[5]、蛋白質(zhì)組學(xué)[6]等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。RNAi自1998年在對(duì)秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans進(jìn)行基因沉默的研究中發(fā)現(xiàn)以來[7]，RNAi技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其應(yīng)用主要包括作物品種改良、生物防治、昆蟲抗藥性功能基因研究等方面[1]。精確地說就是應(yīng)用于基因功能和信號(hào)傳導(dǎo)通路研究[8]。近年來，RNAi技術(shù)在昆蟲基因功能方面的研究也是如火如荼，不僅可以用于控制害蟲，也可以利用RNAi保護(hù)益蟲[9]。

RNAi方法自從被發(fā)現(xiàn)至今，就備受害蟲防治研究領(lǐng)域的學(xué)者們青睞。昆蟲的RNAi因其具有較強(qiáng)的特異性、對(duì)環(huán)境相對(duì)友好以及高效等特點(diǎn)，在基因功能、抗藥性研究和害蟲防治等方面的研究不斷取得新的進(jìn)展[10-11]。以模式昆蟲黑腹果蠅Drosophila melanogaster基因功能的研究為起點(diǎn)，國(guó)內(nèi)昆蟲RNAi研究已涉及常見8大目昆蟲[12]，比如半翅目的白背飛虱Sogatella furcifera [13]、鱗翅目的棉鈴蟲Helicoverpa armigera [14]、直翅目的東亞飛蝗 Locusta migratoria manilensis[15]、雙翅目的桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis[16]、鞘翅目的馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata[17]、半翅目的中黑盲蝽Adelphocoris suturalis[18]、膜翅目的蜜蜂Bee[19]。除上述昆蟲外，RNAi技術(shù)在蜱類和螨類防治中的應(yīng)用也有一些報(bào)道[20-21]。

除上述幾個(gè)目的昆蟲外，歐美等國(guó)家對(duì)其他類別昆蟲的研究也早有報(bào)道，比如蜚蠊目[22-24]、等翅目[25-26]、脈翅目[27]、纓翅目的西花薊馬Frankliniella occidentalis[28-29]。除昆蟲外，國(guó)外對(duì)蜱[30]和螨[31-32]也建立了相應(yīng)的RNAi方法。

由于該技術(shù)對(duì)靶基因的高特異性、系統(tǒng)性及易操作性等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為研究昆蟲基因功能的主要生物技術(shù)之一，且在害蟲防治等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[33]，特別是在非模式昆蟲中[34]。但不同的RNAi方法對(duì)同一昆蟲的RNAi效果存在差異，同一RNAi方法用在不同昆蟲研究RNAi效率也存在差異。dsRNA的導(dǎo)入方法、脫靶效應(yīng)、體外合成的dsRNA易降解及高成本等問題是RNAi應(yīng)用與推廣的最大障礙，嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致應(yīng)用RNAi進(jìn)行昆蟲功能基因組學(xué)研究產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)論。也會(huì)因?yàn)榘袠?biāo)非特異性的出現(xiàn)，而導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境安全性問題，甚至影響人類健康[35]。本文根據(jù)近年發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)不同RNAi方法在昆蟲功能基因研究及害蟲防治研究中的應(yīng)用、以及主要存在的問題等進(jìn)行綜述并展望，以期能為以后昆蟲功能基因研究中RNAi方法的選取提供參考。

1?不同RNAi方法在昆蟲功能基因研究中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)廣泛應(yīng)用于昆蟲基因功能研究中，但由于昆蟲種類多樣性、基因多樣性以及RNAi方法多樣性等導(dǎo)致靶標(biāo)基因的沉默效率存在差異[34，37]。其干擾片段dsRNA的導(dǎo)入方法主要有顯微注射、喂食、浸泡、病毒感染、共生體介導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因方法等，其中較常用的是顯微注射法、喂食法和浸泡法[1，36]，且顯微注射法是研究昆蟲系統(tǒng)性RNAi的最適方法[12]。

1.1?顯微注射法

1.1.1?顯微注射法在昆蟲RNAi研究中的應(yīng)用

顯微注射法即將體外合成的 dsRNA 通過顯微注射儀注射到昆蟲體內(nèi)的方法。通常昆蟲的各組織部位均可注射，但由于昆蟲中腸表皮的微絨毛上含有許多通道和內(nèi)吞小體、無幾丁質(zhì)包被、較大的表皮面積等特點(diǎn)便于dsRNA的吸收和擴(kuò)散，所以，通常選擇中腸進(jìn)行注射[38]。

隨著顯微注射法在模式生物線蟲和雙翅目黑腹果蠅的RNAi研究中取得成功[7，39]。該方法便在鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、半翅目和直翅目等昆蟲中得到廣范應(yīng)用，且成為最為有效引入dsRNA主要方法之一[36]。近兩年來，顯微注射法在昆蟲RNAi中的研究可謂是日新月異，Vatanparast 等[40]觀察了注射α-淀粉酶基因HaAMY48，Ha-AMY49和保幼激素酯酶基因Ha-JHE的dsRNA后對(duì)棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)注射96 h后3類重要酶基因表達(dá)量分別下調(diào)95.8%、 97.7%和74%。Zhu等 [41]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)褐飛虱Nilaparvata lugens注射核糖體蛋白L5基因N1RPL5 dsN1RPL5后，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低了65.5%，限制了褐飛虱卵巢的發(fā)育。此外，豌豆長(zhǎng)管蚜Acyrthosiphon pisum[42]，非洲甘薯象甲[43]，大麥蟲Zophobas atratus[44]和美洲大蠊Periplaneta americana[45]等昆蟲功能基因研究也見諸報(bào)端。

在國(guó)內(nèi)也有一些報(bào)道，如楊爽等[46]使用顯微注射法將麥長(zhǎng)管蚜Sitobion avenae Fabricius OBP7的小干擾RNA（siRNA）導(dǎo)入麥長(zhǎng)管蚜體內(nèi)，結(jié)果證明了顯微注射方式進(jìn)行RNA干擾的可行性。蔣艷冬等[47]利用顯微注射法對(duì)白背飛虱Sogatella furcifera觸角中特異性高表達(dá)的 SfOBP11進(jìn)行 RNA 干擾，結(jié)果顯示，注射 SfOBP11 dsRNA 的若蟲對(duì)寄主水稻的識(shí)別能力降低。王芮等[48]采用顯微注射技術(shù)建立了超量表達(dá)灰飛虱 Laodelphax striatellus羧酸酯酶基因的果蠅品系。還有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)東亞飛蝗采用注射法（觸角窩注射和腹部注射）進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，得出觸角窩注射法可以高效降解 LmCYP3117C1，可作為飛蝗觸角高表達(dá)基因RNAi的主要干擾方法[15]。Ren 等[49]發(fā)現(xiàn)在飛蝗腹部注射 dsRNA 不能有效地干擾卵巢高表達(dá)的基因。熊佳福等[50]顯微注射家蠅Musca domestica胚胎，成功建立Ammrjp1轉(zhuǎn)基因家蠅品系，RT-PCR證明Ammrjp1基因在轉(zhuǎn)基因家蠅中可正常轉(zhuǎn)錄。

此外，陳潔等[51]對(duì)甜菜夜蛾Spodoptera exigua進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，利用注射法，成功沉默了幾丁質(zhì)酶B基因（SeCHSB），導(dǎo)致部分甜菜夜蛾出現(xiàn)蛹期畸形。王錦達(dá)[35]在赤擬谷盜Tribolium castaneum RNAi的研究表明注射不同dsRNA均可以有效抑制目標(biāo)基因的表達(dá)量（55%～75%），且能持續(xù)抑制超過7天，并導(dǎo)致78.8%～87.0%的試蟲畸形。許霽玉[52]對(duì)褐飛虱五齡末期若蟲進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，得出沉默后蟲體內(nèi)卵黃蛋白基因（N1Vg）的表達(dá)量顯著降低，卵母細(xì)胞發(fā)育滯緩，產(chǎn)卵量與孵化率均顯著降低，褐飛虱的生殖能力受到一定的影響。Hu等[53]利用RNAi技術(shù)研究小菜蛾P(guān)lutella xylostella體內(nèi)細(xì)胞色素 P450 基因家族中的CYP321E1 基因，研究表明在CYP321E1 基因在小菜蛾抗藥性中起明顯作用。

1.1.2?顯微注射法優(yōu)缺點(diǎn)分析

顯微注射法具備明顯的優(yōu)點(diǎn)，主要表現(xiàn)在通過顯微注射運(yùn)送ds RNA，能夠直接迅速將雙鏈 RNA 運(yùn)送到目的組織或血淋巴中，避免外表皮、腸道上皮細(xì)胞等障礙。此外，能夠?qū)⒋_定數(shù)量的dsRNA 注射到昆蟲體內(nèi)[36]。而且可以引起強(qiáng)烈的系統(tǒng)性RNAi。該方法可將某些基因干擾效應(yīng)傳遞到子代，對(duì)于口器、生境和發(fā)育歷期的要求十分寬泛[11]。

該技術(shù)也還存在一些缺陷與不足。如顯微注射法操作技巧的要求高，操作參數(shù)需優(yōu)化，操作過程相對(duì)耗時(shí)，且不適合個(gè)體較小的昆蟲[1，36]。因?yàn)轶w型較小的昆蟲容易被注射操作的機(jī)械損傷而導(dǎo)致死亡，不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步開展。然而隨著全細(xì)胞自動(dòng)注射儀等精密儀器的發(fā)展，顯微注射法在小型昆蟲的RNAi研究中取得了一些突破性進(jìn)展。李如美等[54]利用NK2 全自動(dòng)細(xì)胞注射系統(tǒng)，以煙粉虱Bemisia tabaci的CYP6CM1 基因?yàn)槟繕?biāo)基因成功構(gòu)建了RNAi技術(shù)體系;Badillo-Vargas等[31]使用Nanoinjector II（Drummond Scientific，Broomall，PA，USA）顯微注射儀，以西花薊馬Frankliniella occidentalis的V-ATPase-B為靶標(biāo)基因進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，成功導(dǎo)致V-ATPase-B基因的表達(dá)量下調(diào)，致使西花薊馬死亡率升高，繁殖率下降。

1.2?飼喂法

1.2.1?飼喂法在昆蟲RNAi研究中的應(yīng)用

飼喂法即昆蟲通過取食體外合成的dsRNA/siRNA而對(duì)靶標(biāo)基因起到干擾作用的方法。近幾年來應(yīng)用飼喂法進(jìn)行昆蟲的RNAi研究方興未艾。Yu和Killiny[55]利用飼喂法對(duì)亞洲柑橘木虱Diaphorina citri的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶DcGSTe2、DcGSTd1基因進(jìn)行沉默，導(dǎo)致該蟲對(duì)甲氰菊酯和噻蟲嗪的敏感性增加，且通過對(duì)柑橘木虱飼喂dsRNA（dsDcGSTe2-d2）對(duì)DcGSTe2和DcGSTd1進(jìn)行共沉默，導(dǎo)致了柑橘木虱對(duì)甲氰菊酯和噻蟲嗪的敏感性增加。Niu等[56]利用植物介導(dǎo)的dsRNA飼喂西方玉米根蟲Diabrotica virgifera virgifera導(dǎo)致該蟲繁殖率顯著下降。Wang等[57]用合成的dsRNA喂養(yǎng)煙粉虱成蟲導(dǎo)致Btdef基因沉默從而降低了煙粉虱體內(nèi)TYLCCNV基因的表達(dá)豐度。Ran等[58]在研究大豆食心蟲Leguminivora glycinivorella免疫相關(guān)基因LgToll-5-1a和LgPGRP-LB2a時(shí)，利用飼喂法導(dǎo)致這兩個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)，導(dǎo)致其發(fā)育受阻且死亡率升高。Ghosh和Gundersen-Rindal[59]用細(xì)菌表達(dá)和體外合成的dsRNA喂養(yǎng)舞毒蛾Lymantria dispar幼蟲，導(dǎo)致舞毒蛾體重下降、卵塊數(shù)減少一半。

李雪峰等[60]利用豌豆蚜Acyrthosiphon pisum基因C002序列進(jìn)行RNAi試驗(yàn)，結(jié)果顯示，麥長(zhǎng)管蚜分別取食dsC002 4 d和6 d后，C002基因的表達(dá)量均下降，且差異極顯著。李曉敏等[61]對(duì)B型和Q型煙粉虱飼喂P450CYP6CM1dsRNA，研究結(jié)果表明P450CYP6CM1基因在煙粉虱抵御煙堿或新煙堿類殺蟲劑過程中起重要作用。此外，飼喂法在豌豆長(zhǎng)管蚜[42]、非洲甘薯象甲[43]、棉鈴蟲[62]、岡比亞按蚊Anopheles gambiae [63]、東亞飛蝗[15]等昆蟲中的研究也已見諸報(bào)端。

1.2.2?飼喂法導(dǎo)入dsRNA的方式及優(yōu)缺點(diǎn)分析

前人的研究報(bào)道指出飼喂法導(dǎo)入dsRNA的方法主要分為3種[1，36]：第1種是在細(xì)菌中表達(dá)雙鏈RNA，通過喂食細(xì)菌實(shí)現(xiàn)的，Palli用大腸桿菌表達(dá)甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成酶A（Se CHSA） 的dsRNA，并混在人工培養(yǎng)基后喂食甜菜夜蛾，可成功將dsRNA傳送到幼蟲的中腸[64];第2種是在體外合成dsRNA，再把dsRNA混在食物或溶液直接給昆蟲食用，在赤擬谷盜、豌豆蚜、煙草天蛾Manduca sexta、馬鈴薯甲蟲的研究中取得成功[1，65];第3種是喂食能夠表達(dá)雙鏈RNA 的轉(zhuǎn)基因植物，目前利用轉(zhuǎn)基因植物抑制昆蟲基因表達(dá)，在鱗翅目、鞘翅目和半翅目昆蟲中得以成功實(shí)現(xiàn)[9]，且通過使昆蟲取食表達(dá) dsRNA 的植物來沉默體內(nèi)目的基因，從而達(dá)到防控蟲害的目的[66]，該方法是將RNAi技術(shù)向大田推廣應(yīng)用最具潛力方法之一。

飼喂法用于昆蟲dsRNA導(dǎo)入具有省力、省時(shí)和易操作等優(yōu)點(diǎn)[67]。對(duì)于高通量基因的篩選，特別是害蟲的防治，飼喂法相比于其他方法應(yīng)用性更強(qiáng)，且對(duì)于個(gè)體比較小的昆蟲不易對(duì)其造成機(jī)械損傷，如王暉等[68]用飼喂法成功沉默麥長(zhǎng)管蚜與桃蚜Myzus persicae細(xì)胞色素P450基因。但飼喂法也存在不足，主要表現(xiàn)為不同物種所需量的范圍不同，需要大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。且飼喂法由于作用較慢、效率較低、昆蟲的胚胎期和蛹期等無法取食等特點(diǎn)，并非所有的種都能取得成功[11，36]。

1.3?其他方法及其應(yīng)用

除上述兩種較常用方法外，其他還有如浸泡法、病毒介導(dǎo)法、轉(zhuǎn)基因法等dsRNA導(dǎo)入手段。浸泡法是將實(shí)驗(yàn)材料直接浸泡在dsRNA 溶液中而引起RNAi的方法，因其方便操作，也變得越來越常見，這種方法也稱為細(xì)胞外RNAi[36]。浸泡法在昆蟲細(xì)胞系研究中應(yīng)用廣泛，在昆蟲當(dāng)中，大部分浸泡實(shí)驗(yàn)主要在細(xì)胞株中實(shí)施[69]，如黑腹果蠅[70]和飛蝗[15]。

病毒介導(dǎo)法是將靶標(biāo)基因dsRNA通過病毒侵染途徑導(dǎo)入宿主體內(nèi)的方法。針對(duì)不同的目標(biāo)害蟲，需對(duì)其生活史、生活習(xí)性和發(fā)生規(guī)律進(jìn)行全面了解，有目的地選擇適宜的方法進(jìn)行干擾試驗(yàn)，以獲得預(yù)期效果[71];轉(zhuǎn)基因法進(jìn)行 RNAi的優(yōu)點(diǎn)在于可持續(xù)、穩(wěn)定和便利地得到 dsRNA，并且能夠遺傳，轉(zhuǎn)基因方法首先被應(yīng)用于果蠅上，通過表達(dá)雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因植物，將昆蟲基因作為靶標(biāo)，提高植物的抗蟲性[11，36，71]。此外，Whitten等[32]利用共生體介導(dǎo)的方法對(duì)西花薊馬進(jìn)行RNA干擾，導(dǎo)致西花薊馬通道蛋白的mRNA表達(dá)水平下降，致使其對(duì)寄主植物的取食為害減弱，死亡率增高。

2?影響RNAi效率的因素

2.1?脫靶效應(yīng)

RNAi脫靶效應(yīng)首先是在研究人體細(xì)胞內(nèi)siRNA引導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)的，該研究結(jié)果顯示，沉默的并非靶標(biāo)基因，而是與siRNA的11個(gè)連續(xù)核苷酸序列匹配的非靶標(biāo)基因[72]。對(duì)于昆蟲的脫靶效應(yīng)而言，前人在對(duì)黑腹果蠅的研究中得出，dsRNA與mRNA的匹配長(zhǎng)度超過19 bp后就會(huì)產(chǎn)生較高的假陽性結(jié)果[73，74]。而對(duì)于秀麗隱桿線蟲則是dsRNA與mRNA大于40 bp且相似性高于95%才會(huì)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。

脫靶效應(yīng)的類型根據(jù)其是否引起細(xì)胞的一序列免疫應(yīng)答等原因?qū)⑵浞譃閮深悾譃樾蛄邢嚓P(guān)和序列無關(guān)，其中序列相關(guān)脫靶效應(yīng)包括：（1）siRNA分子和非鞭標(biāo)基因的互作;（2）siRNA的種子區(qū)域六聚體或七聚體與非靶標(biāo)基因3UTR區(qū)的匹配。序列無關(guān)的脫靶效應(yīng)包括：（1）外源siRNA引起內(nèi)源mircoRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)非靶標(biāo)基因的調(diào)節(jié)作用;（2）外源dsRNA誘導(dǎo)機(jī)體或細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答;（3）靶基因沉默，進(jìn)而改變下游基因的表達(dá)即‘下游效應(yīng)。王錦達(dá)[35]對(duì)赤擬谷盜注射dsRNA（dsEGFP）后對(duì)其15個(gè)免疫應(yīng)答相關(guān)基因檢測(cè)，結(jié)果表明，可以通過免疫反應(yīng)引發(fā)赤擬谷盜序列無關(guān)基因產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。

RNAi脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生與siRNA/dsRNA的濃度有關(guān)，針對(duì)不同的物種不同的靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)適宜濃度及適合長(zhǎng)度的siRNA/dsRNA，有益于降低脫靶現(xiàn)象的出現(xiàn)率;通過化學(xué)修飾的方法亦可減少脫靶情況的出現(xiàn)，化學(xué)修飾通過使正義鏈?zhǔn)Щ?，失去與RISC結(jié)合的能力，從而降低正義鏈引發(fā)的脫靶效應(yīng)。此外，通過混合siRNA/dsRNA進(jìn)行干擾比單一轉(zhuǎn)染的siRNA或者dsRNA更能降低脫靶效應(yīng)[35]。

2.2?功能性靶標(biāo)基因的選擇

將 RNAi 應(yīng)用于害蟲防控領(lǐng)域，功能性靶標(biāo)基因的選擇極為重要，這些基因包括生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因、昆蟲能量代謝相關(guān)的重要生理酶基因、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的激素、神經(jīng)調(diào)控相關(guān)的蛋白等。就當(dāng)前已有的研究報(bào)道而言，昆蟲抗藥性相關(guān)功能基因的研究更為全面。例如，F(xiàn)ishilevich 等[75]沉默了西方玉米根蟲和新熱帶區(qū)的褐蝽Euschistus heros 染色質(zhì)重組 ATP 酶基因，結(jié)果顯示西方玉米根蟲和新熱帶區(qū)的褐蝽繁殖率顯著降低。王暉等[68]沉默了麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜體內(nèi)細(xì)胞色素 P450，結(jié)果隨著 dsRNA 濃度的增大和時(shí)間的推移，麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜的死亡率可分別達(dá)到 75.56%和 64.44%。

在昆蟲RNAi的研究中，選擇合適的靶基因和適當(dāng)?shù)膶?dǎo)入方法是其成功的關(guān)鍵。根據(jù)齊江衛(wèi)等[76]的報(bào)道，在害蟲的防治中可供選擇適宜靶標(biāo)基因主要有4類，分別為（1）害蟲致死基因，如Rieske鐵流蛋白基因沉默致使害蟲死亡;（2）害蟲抗性和免疫基因，如細(xì)胞色素P450;（3）害蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，如幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等[55，76];（4）害蟲產(chǎn)卵相關(guān)基因，如卵黃原蛋白受阻使害蟲產(chǎn)卵量下降[77]。

2.3?dsRNA的設(shè)計(jì)及其它影響因素

設(shè)計(jì)科學(xué)合理的dsRNA是保證昆蟲RNAi取得良好效果的關(guān)鍵，因?yàn)橹挥羞m宜dsRNA進(jìn)入蟲體后才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNA干擾反應(yīng)[11]。dsRNA對(duì)RNA干擾效率的影響可歸納為以下幾點(diǎn)：（1）dsRNA的序列，決定生物出現(xiàn)脫靶效應(yīng)的可能性;（2）dsRNA的長(zhǎng)度，決定了吸收和沉默的效率;（3）dsRNA的濃度，濃度越高不一定沉默效應(yīng)越強(qiáng)。比如在赤擬谷盜的RNA干擾研究中，在相同dsRNA濃度下，520 bp的dsRNA比69 bp的dsRNA抑制靶標(biāo)基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)63 d[78]。

此外，dsRNA不穩(wěn)定性、供試?yán)ハx的發(fā)育歷期、腸道內(nèi)含物、生理PH、dsRNases、RNAi通路重疊等都對(duì)RNAi效率存在不同程度的影響[79]。就昆蟲的發(fā)育歷期而言，盡管較大的齡期便于操作，但幼齡時(shí)期往往表現(xiàn)出更強(qiáng)的沉默效應(yīng)，且不同基因的沉默效應(yīng)持續(xù)時(shí)間不同[11，79]。

3?小結(jié)與展望

隨著昆蟲基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、新一代高通量測(cè)序技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，為我們獲取大量的基因信息提供了技術(shù)保障。RNAi 作為一種對(duì)基因表達(dá)具有特異性的抑制機(jī)制，為未知基因功能的研究提供了技術(shù)平臺(tái)，成為研究基因功能的有利工具。同時(shí) RNAi 技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好等特性，可成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新策略。不同RNAi方法對(duì)同一昆蟲的干擾效應(yīng)存在差異，比如前人研究發(fā)現(xiàn)浸泡法和涂抹法干擾飛蝗觸角的LmCYP3117C1基因效果不明顯，腹部注射法對(duì)飛蝗觸角 LmCYP3117C1 的沉默效率相對(duì)較低，唯有觸角窩注射法可以高效降解LmCYP3117C1，及注射法可作為飛蝗觸角高表達(dá)基因RNAi的主要干擾方法[15]。

目前，昆蟲RNAi 技術(shù)在昆蟲重要生理酶、生長(zhǎng)發(fā)育、抗藥性及其滯育相關(guān)功能基因方面的研究已取得重要進(jìn)展。然而在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些棘手的問題。如 siRNA 不僅可與靶標(biāo)基因特異性結(jié)合，也可與非靶標(biāo)基因結(jié)合使其基因沉默，出現(xiàn)脫靶效應(yīng);如何使用特定的RNAi來保護(hù)植物免受害蟲侵害，但又不傷害以這些植物為食的其他物種？不同種或同種昆蟲的同一靶標(biāo)基因或不同靶標(biāo)基因，RNAi效率最好所需的dsRNA濃度？如何將RNAi技術(shù)應(yīng)用于田間害蟲的防治？如何保障飼喂法研究中體外合成的dsRNA不降解或者少降解等均是亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。RNAi 技術(shù)的研究應(yīng)用，可為害蟲的防控策略提供一種更可持續(xù)、更綠色環(huán)保的新思路，相信隨著對(duì)分子生物學(xué)研究的不斷深入，RNAi技術(shù)有望走出實(shí)驗(yàn)室，向田間推廣應(yīng)用。

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