黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF含量的測(cè)定

陳家祥 徐策 張素 熊德欣 代園鳳 鄭澤軒 陳雪 李祝

摘?要：本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。對(duì)5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)，并繪制5-HMF濃度與吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線;用50%乙醇將原發(fā)酵液稀釋50倍，在測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中的5-HMF含量。結(jié)果表明，5-HMF最大吸收波長(zhǎng)為283 nm，R2為0.9995，線性關(guān)系良好，發(fā)酵液5-HMF平均濃度為171.743 μg/mL，平均回收率105.86%，精密度RSD為0.13%，重復(fù)性RSD為0.40%，儀器檢出限為0.007 μg/mL。該方法簡(jiǎn)便，快速，成本低，準(zhǔn)確度較高，為今后研究黑曲霉中5-HMF含量提供了一個(gè)可借鑒的方法。

關(guān)鍵詞：黑曲霉;5-HMF;紫外分光光度法

中圖分類號(hào)：Q939.96

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2018）06-0087-05?國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.015

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF），又名5-羥甲基-2-糠醛[1]，由葡萄糖或果糖脫水生成[2]，其分子中含有一個(gè)呋喃環(huán)，醛基和羥基，性質(zhì)非?；顫?，可通過氧化、氫化和縮合等反應(yīng)制備多種衍生物，是一種良好的化學(xué)平臺(tái)物質(zhì)。5-羥甲基糠醛可用于生產(chǎn)燃料和反應(yīng)中間體[3]，同時(shí)還有抗癌細(xì)胞增值活性，降血糖等藥理作用[4-5]，近年我國(guó)5-羥甲基糠醛產(chǎn)品行業(yè)銷售收入呈指數(shù)增長(zhǎng)[6]，應(yīng)用前景廣泛。

黑曲霉為曲霉屬的一個(gè)常見種[7]，可生產(chǎn)檸檬酸[8]，糖化酶[9]等，也可作為宿主進(jìn)行外源表達(dá)，廣泛用于食品原料、藥物、酶的生產(chǎn)[10-11]，是發(fā)酵工業(yè)中的重要菌種。于能江[12]從頭孢酶屬的發(fā)酵物中分離出5-HMF，陳楠等人[13]從蜜環(huán)菌中提取5-HMF，均表明微生物發(fā)酵液中可產(chǎn)5-HMF。黑曲霉在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)5-HMF可彌補(bǔ)化學(xué)法步驟復(fù)雜繁瑣的缺點(diǎn)。在對(duì)黑曲霉中5-HMF高產(chǎn)培養(yǎng)體系的建立中對(duì)發(fā)酵液內(nèi)的5-HMF含量測(cè)定是必不可少的步驟。

目前測(cè)定5-HMF的方法主要有HPLC法[14-16]、紫外分光光度法[17-19]、衍生化分光光度法[20]等。HPLC法樣本處理及測(cè)定過程繁瑣復(fù)雜且成本較高，不適用于長(zhǎng)期而頻繁的測(cè)定;衍生化分光光度法需將5-HMF生成衍生化合物后間接測(cè)量，步驟較繁瑣，紫外分光光度法簡(jiǎn)單快捷，在5-HMF的測(cè)定中應(yīng)用較多。如馮紅偉等人[21]利用紫外分光光度法測(cè)定糖蜜中的5-HMF，劉月新[22]利用紫外分光光度法測(cè)定四物湯傳統(tǒng)湯劑中的5-HMF。本實(shí)驗(yàn)將利用紫外分光光度法對(duì)黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF含量進(jìn)行測(cè)定。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

1.1.1?菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。

1.1.2?試劑

5-HMF（≥99.0%）：廣東翁江化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司;葡萄糖（分析純）：天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3?儀器與設(shè)備

BIOMATE 3S紫外分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技有限公司;UV-8000紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司;華普達(dá)THZ-82恒溫振蕩器：常州華普達(dá)有限公司。

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品全波長(zhǎng)掃描與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確吸取2.5 μL 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品，利用50%乙醇配制成31.075 μg/mL的儲(chǔ)備液。精確吸取10 mL母液，加入40 mL 50%乙醇，配制濃度為6.215 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

將標(biāo)準(zhǔn)液于UV-8000紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，取最大吸收峰值對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。

將標(biāo)準(zhǔn)液用50%乙醇梯度稀釋，得0、1.243 μg/mL、2.486 μg/mL、3.729 μg/mL、4.972 μg/mL、6.215 μg/mL的6份稀釋液。6份樣品以50%乙醇為參比，在測(cè)定波長(zhǎng)進(jìn)行吸光度測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2?黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF濃度的測(cè)定

將黑曲霉接種至PDB培養(yǎng)基，于26℃，150 r/min振蕩頻率下培養(yǎng)5 d，過濾掉發(fā)酵液中的菌絲球及孢子，于發(fā)酵液中加入等體積的無水乙醇，10000 r/min離心10 min沉淀絮狀變性蛋白，吸取上清液，繼續(xù)加入50%乙醇，得到原發(fā)酵液50倍稀釋度的稀釋液。

分別取稀釋液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL加入5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL的50%乙醇，得到5個(gè)梯度稀釋樣品，以50%乙醇為參比，于283 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中的5-HMF平均濃度。

1.2.3?精密度測(cè)定

取同一份稀釋液8份，以同樣方法直接測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4?回收率測(cè)定

配置與發(fā)酵液5-HMF濃度相近的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，與發(fā)酵液在相同稀釋度下等體積混合后測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.5?重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一批發(fā)酵液以相同方法平行處理，分析重復(fù)性。

1.2.6?儀器檢出限測(cè)定

配制濃度為0.213 μg/mL、0.426 μg/mL、0.533 μg/mL、0.639 μg/mL的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用BIOMATE 3S紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，繪制低濃度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定20組參比的吸光度，計(jì)算儀器檢出限。

2?結(jié)果與分析

2.1?全波長(zhǎng)掃描

標(biāo)準(zhǔn)液于190～1100 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)283 nm處有最大吸收峰（200～400 nm部分掃描結(jié)果），故采用283 nm作測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2?5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度回歸曲線

5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品溶解于50%乙醇中，其通過計(jì)算得到的濃度與所對(duì)應(yīng)的吸光度結(jié)果見表1，線性回歸曲線，R2為0.9995，線性關(guān)系良好，回歸方程為y = 0.1225x + 0.005。

2.3?發(fā)酵液5-HMF濃度測(cè)定

對(duì)稀釋液梯度稀釋后的6份樣品測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度（見表2），再分別根據(jù)總稀釋度求出原發(fā)酵液5-HMF濃度，為165.714 μg/mL、173.333 μg/mL、172.143 μg/mL、173.714 μg/mL、173.810 μg/mL，平均值為171.743 μg/mL。

2.4?精密度測(cè)定

取稀釋液8份，直接進(jìn)行紫外分光測(cè)定（見表3），RSD為0.13%，重現(xiàn)性良好。

2.5?回收率測(cè)定

配制186.450 μg/mL的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，與原發(fā)酵液各稀釋50倍后等體積混合并測(cè)定（結(jié)果見表4），平均回收率為105.86%，RSD為1.03%，回收率較好，可以較準(zhǔn)確反映發(fā)酵液中5-HMF實(shí)際含量。

2.6?重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批發(fā)酵液8份，以同樣方法測(cè)定其中5-HMF含量（見表5），RSD為0.40%，重復(fù)性良好。

2.7?儀器檢出限

配制0.746 μg/mL的低濃度5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行梯度稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其斜率，低濃度時(shí)靈敏度0.1397。以20組50%乙醇進(jìn)行空白測(cè)定，得空白均值為0.009，空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%，根據(jù)IUPAC標(biāo)準(zhǔn)[23]，k取3用于檢出限計(jì)算，得最小分析信號(hào)為0.010，BIOMATE 3S紫外分光光度計(jì)測(cè)定黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF濃度檢出限為0.007 μg/mL。

3?結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定黑曲霉發(fā)酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品全波長(zhǎng)掃描得283 nm處有最大吸收峰，故以283 nm作為測(cè)定波長(zhǎng);標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1225x+0.005，線性關(guān)系良好，用此法測(cè)定黑曲霉xj發(fā)酵液中的5-HMF平均濃度為171.743 μg/mL，與HPLC測(cè)定結(jié)果0.1257 mg/g相近[24]，平均回收率為105.86%，能較準(zhǔn)確地反應(yīng)5-HMF實(shí)際含量，方法重現(xiàn)性良好。儀器檢出限為0.007 μg/mL，可以精準(zhǔn)測(cè)定。此法操作簡(jiǎn)便快速，成本低，準(zhǔn)確度較高，但由于比色法會(huì)受到一定的干擾，測(cè)定結(jié)果不能視為5-HMF絕對(duì)含量，可為研究黑曲霉中5-HMF含量提供一個(gè)可借鑒的方法。

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