三葉木通葉片解剖結(jié)構(gòu)和光合特征對干旱脅迫的響應(yīng)

吳正花　喻理飛　嚴(yán)令斌　周晨　蔡國俊　張建利

摘要：【目的】分析干旱脅迫下三葉木通葉片的解剖結(jié)構(gòu)和光合特性，為西南喀斯特石漠化區(qū)生態(tài)修復(fù)植物材料選擇提供參考依據(jù)?！痉椒ā颗柙钥λ固氐貐^(qū)適生植物三葉木通并進(jìn)行連續(xù)干旱脅迫處理，采用常規(guī)石蠟切片法和Li-6400光合儀分別測定其幼苗葉片的解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)和光合參數(shù)，分析解剖結(jié)構(gòu)和光合生理特征變化，以及二者間的相關(guān)性。【結(jié)果】隨土壤相對水含量（SRWC）的降低，三葉木通幼苗葉片呈厚度變薄、水含量降低和柵欄組織縮短變緊密等變化趨勢；總?cè)~綠素（Chlt）含量、凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）下降，水分利用效率（WUE）提高；SRWC降至29%時，大部分解剖指標(biāo)和光合指標(biāo)呈顯著性差異變化（P<0.05）。主成分分析結(jié)果表明，大于1.000的葉片解剖指標(biāo)特征值中有4個主成分的載荷值差異極大，貢獻(xiàn)率達(dá)88.195%，主要指標(biāo)為柵欄組織、下表皮、木質(zhì)部和海綿組織；大于1.000的葉片光合指標(biāo)特征值有2個主成分的載荷值差異極大，貢獻(xiàn)率達(dá)83.277%，指標(biāo)為Gs和Chlt。相關(guān)性分析結(jié)果表明，SRWC與葉片水含量（LWC）、Chlt、Pn、Gs、胞間CO2濃度（Ci）、Tr、氣孔限制值（Ls）及葉片解剖結(jié)構(gòu)中的葉片厚度、柵欄組織厚度和木質(zhì)部厚度均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01，下同），與WUE和葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度呈極顯著負(fù)相關(guān)?！窘Y(jié)論】三葉木通幼苗在干旱脅迫下通過改變?nèi)~片結(jié)構(gòu)特征、降低光合作用和提高水分利用效率等方式適應(yīng)干旱頻發(fā)的喀斯特環(huán)境；SRWC為29%可視為三葉木通幼苗受干旱脅迫的起點(diǎn)；柵欄組織、海綿組織、木質(zhì)部及Gs可作為三葉木通耐旱性品種篩選的參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞： 三葉木通；干旱脅迫；解剖結(jié)構(gòu)；光合特征；喀斯特

中圖分類號： S567.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1156-08

Abstract：【Objective】The anatomical structure and photosynthetic characteristics of leaves of Akebia trifoliate were observed and measured under drought stress to provide references for selecting suitable plants for ecological restoration in karst rocky desertification area in southwest China. 【Method】A. trifoliate，a karst adaptable specie，was taken as material. Through pot experiment and continuous drought stress，seeding leaf anatomical structures were observed by conventional paraffin section，and changes of photosynthetic physiological characteristics were analyzed by measuring photosynthetic parameters with Li-6400. The changes of anatomical structures and photosynthetic characters and the correlation between the two were analyzed. 【Result】With soil relative water content（SRWC） decreasing，the thickness of seeding leaf thinned，water content decreased and palisade tissues shortened in the structural features of the leaves of A. trifoliate. Chlorophyll content（Chlt），photosynthetic rate（Pn），stomatal conductance（Gs），transpiration rate（Tr） decreased，water use efficiency（WUE） increased. Most of the anatomical and photosynthetic indicators showed significant difference when SRWC decreased to 29%（P<0.05）. The results of principal component analysis showed that the load values of four principal components in the characteristic values of leaf anatomy greater than 1.000 varied greatly，with a contribution rate of 88.195%. The main indicators were palisade tissue， lower epidermis，xylem，and spongy tissue. Among these photosynthetic index eigenvalues of leaves which were larger than 1.000，Gs and Chlt were two main components with large differences in load values，with a contribution rate of 83.277%. The correlation analysis showed that there was significant positive correlation between SRWC and leaf water content（LWC）， Chlt，Pn，Gs，Ci，Tr，Ls， leaf thickness，palisade tissue thickness and xylem thickness in leaf anatomy（P<0.01， the same below）. There was extremely significant negative correlation between WUE and leaf structure loose degree（SR）. 【Conclusion】By changing the structure characteristics，reducing photosynthesis and increasing water use efficiency under drought stress，seedlings of A. trifoliate can adapt to the karst environment in southwest China where drought take place frequently. SRWC of 29% can be regarded as the starting point of drought stress of A. trifoliate seedlings. Palisade tissue，spongy tissue，xylem and Gs can be used as reference indexes for the screening of drought-tolerant varieties of A. trifoliate.

Key words： Akebia trifoliate； drought stress； anatomical structure； photosynthetic characteristics； karst

0 引言

【研究意義】水分虧缺是限制石漠化區(qū)植物恢復(fù)的主要因素（曹建華等，2004），很多植物為適應(yīng)所處的環(huán)境而形成一些特定生存策略，以外部形態(tài)和內(nèi)部生理生化的變化來抵御和適應(yīng)干旱逆境（Budak et al.，2013；D' Amico-Dami?o et al.，2015；李瑞雪等，2017）。葉片是植物暴露在環(huán)境中最大的器官，受環(huán)境因子影響顯著，對干旱等逆境反應(yīng)敏感，從葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理變化上能反映植物抵御和適應(yīng)干旱的能力（任磊等，2015；武金翠等，2017）。三葉木通（Akebia trifoliate）是木通科木通屬藤本植物，全株可入藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值（吳永朋等，2013），在西南石漠化地區(qū)恢復(fù)治理中有較好的應(yīng)用前景。在干旱頻發(fā)的喀斯特區(qū)，了解植物的抗旱性及響應(yīng)特征變化尤為重要，是制定植物栽培管理的重要依據(jù)，因此，分析干旱脅迫三葉木通葉片的解剖結(jié)構(gòu)和光合特性，對西南喀斯特石漠化地區(qū)選擇適生植物進(jìn)行生態(tài)修復(fù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有不少關(guān)于干旱脅迫下植物光合特征和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的研究。王琰等（2011）的研究結(jié)果表明，干旱脅迫會導(dǎo)致不同種源的油松（Pinus tabuliformis Carr.）形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隨著干旱脅迫的加強(qiáng)，抗旱性強(qiáng)的種源油松可通過降低蒸騰速率（Tr）和提高水分利用效率（WUE）來增強(qiáng)對干旱的適應(yīng)能力。季子敬等（2013）開展了落葉松[Larix gmelinii（Rupr.） Kuzen.]針葉解剖結(jié)構(gòu)和光合能力對氣候變化適應(yīng)性的研究，結(jié)果表明，落葉松針葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化與其生理功能統(tǒng)一，光合作用和蒸騰作用與葉片光合器官的解剖學(xué)特征聯(lián)系緊密。龐杰等（2013）研究認(rèn)為，干旱不僅導(dǎo)致沙芥[Pugionium cornutum（L.） Gaertn.]幼苗葉片氣孔關(guān)閉，影響光合底物二氧化碳的吸收，還會引起葉肉細(xì)胞損傷而降低光合酶的活性，使光合速率降低。孫善文等（2014）研究認(rèn)為，大戟科植物幼苗葉片具有發(fā)達(dá)的柵欄組織，細(xì)胞越小則排列越緊密，即植物的光能利用效率越高。王勇等（2014）、吳麗君等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，隨著自然生境中水分的減少，植物葉片通常會表現(xiàn)出葉片增厚，上下表皮和柵欄組織、海綿組織厚度減小等特征，以響應(yīng)干旱環(huán)境。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對三葉木通的研究主要集中于指紋圖譜、理化性質(zhì)、藥理作用（黃佩蓓等，2014）、栽培扦插（陳斌，2016）、資源分布（黃佩蓓等，2016）及新型保健水果開發(fā)（雷頌等，2016）等方面，而從葉片解剖結(jié)構(gòu)和光合生理角度進(jìn)行三葉木通耐旱性研究尚無文獻(xiàn)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】開展三葉木通干旱脅迫盆栽試驗，分析其葉片解剖結(jié)構(gòu)和光合生理變化特征，揭示其耐旱過程、耐旱機(jī)制及干旱脅迫的起始點(diǎn)，以期為喀斯特石漠化區(qū)域植被恢復(fù)選擇植物材料提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗在貴陽市花溪區(qū)養(yǎng)牛村四周通風(fēng)、氣溫與室外無差異的塑料大棚中進(jìn)行。2017年3月將1年生三葉木通實(shí)生壯苗移栽至口徑25 cm、高18 cm的塑料花盆中，每盆1株，共40盆，每盆使用5 kg喀斯特地區(qū)常見的棕色石灰土（pH 7.9）。試驗前測定盆內(nèi)土壤相對水含量（SRWC），苗木移栽后，采用稱重法（0.001 kg）保持苗盆內(nèi)水含量，澆飽和水后進(jìn)行常規(guī)盆栽管理，4月下旬苗成活并長出新葉，選取長勢一致、地徑0.5～0.6 cm的植株作為試驗材料。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設(shè)計 將40盆三葉木通一次性澆透水（土壤達(dá)飽和持水狀態(tài)）后，置于大棚內(nèi)自然失水，直至幼苗干旱死亡。設(shè)5盆為1組（5個平行），每隔4 d測定1組試樣的SRWC和葉片參數(shù)。

1. 2. 2 光合參數(shù)測定 選取三葉木通幼苗基部向上第2～5片健康無蟲害的成熟葉片，使用Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)，于晴朗天氣上午9：00～11：30，在自然光照及CO2條件下測定葉片水含量（LWC）、凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）和氣孔限制值（Ls）等參數(shù)。水分利用效率（WUE）=Pn/Tr，將已進(jìn)行光合參數(shù)測定的葉片標(biāo)記，用于葉片解剖和葉綠素含量測定。

1. 2. 3 葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)測定 采用常規(guī)石蠟切片法（呂冬霞，2012），摘取1.2.2測定光合參數(shù)后標(biāo)記的葉片帶回實(shí)驗室置于FAA（70%酒精90 mL+甲醛5 mL+冰乙酸5 mL）中固定，番紅—固綠染色，切片厚度10 μm，在Olympus Vanox光學(xué)顯微鏡下使用目鏡測微尺觀測上下表皮、柵欄組織和海綿組織厚度，并拍照。每個結(jié)構(gòu)參數(shù)均為25視野范圍內(nèi)測定平均值。其中，柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度；葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）=柵欄組織厚度/葉片厚度；葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度（SR）=海綿組織厚度/葉片厚度。

1. 2. 4 葉綠素含量測定 將1.2.2測定光合參數(shù)后標(biāo)記的葉片去除葉脈，稱取葉片0.2 g，用95%乙醇研磨、提取和過濾，定容至25.0 mL，使用分光光度計在665和649 nm處分別測定提取液的吸光值，按照Arnon公式計算每克葉片的葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和總?cè)~綠素（Chlt）含量。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析，并以Pearson相關(guān)系數(shù)分析光合參數(shù)與解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 干旱脅迫過程中三葉木通幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化

從圖1可看出，三葉木通幼苗葉片的柵欄組織細(xì)胞隨著SRWC的降低變得致密，兩層細(xì)胞出現(xiàn)縮短現(xiàn)象，第2層細(xì)胞由長柱狀變?yōu)槎虉A柱狀甚至球狀，參差不齊；海綿組織由零散排列變?yōu)榫o密，細(xì)胞間隙變??；尤其當(dāng)SRWC下降至17%后，柵欄組織的兩層細(xì)胞已變?yōu)槊黠@的圓柱狀，第2層細(xì)胞甚至縮短為球狀，難以與海綿組織區(qū)分，海綿組織變得更致密。

測定的葉片解剖結(jié)構(gòu)（表1）顯示，當(dāng)SWRC從 60%降至46%時，葉片厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度、主脈長度、木質(zhì)部厚度、韌皮部厚度和柵海比差異均不顯著（P>0.05，下同）；SWRC低于46%后，葉片和柵欄組織厚度呈變薄趨勢，海綿組織和下表皮厚度呈先增加后下降趨勢；SWRC從29%降至23%時，葉片厚度、上表皮厚度和柵欄組織厚度顯著下降（P<0.05，下同），主脈長度、木質(zhì)部厚度和SR明顯增加，下表皮和韌皮部厚度及柵海比降低，但差異不顯著；隨著干旱脅迫的繼續(xù)加強(qiáng)（SWRC降至17%），葉片各解剖結(jié)構(gòu)持續(xù)發(fā)生不同程度的變化。說明三葉木通葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度等解剖結(jié)構(gòu)的變化可能是其增強(qiáng)抗性及適應(yīng)干旱脅迫所作出的響應(yīng)。

2. 2 三葉木通葉片光合生理對干旱脅迫過程的響應(yīng)

由表2可知，干旱脅迫下三葉木通的LWC、Chlt、Pn、Ci、Tr和Ls總體呈下降趨勢，SWRC從60%降至35%時，上述參數(shù)中除Chlt和Tr有顯著變化外，其他4個參數(shù)（LWC、Pn、Ci和Ls）均無顯著變化；當(dāng)SWRC從35%降至29%時，Pn、Ci和Ls均呈顯著變化；WUE隨著干旱脅迫的加強(qiáng)呈上升趨勢，SWRC從60%降至35%時，WUE無顯著變化，SWRC降至35%后，WUE顯著升高。觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SWRC降至17%后，三葉木通的大部分葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，小部分葉片枯萎，各項指標(biāo)與正常水分條件下（SRWC為60%）相比發(fā)生了顯著變化，其中，Pn僅為正常水分條件下的24%，Tr僅為正常水分條件下的2.1%、WUE提高了11倍。說明SRWC從60%降至35%時三葉木通的光合作用尚未受到干旱脅迫的顯著影響，而SRWC降至29%可能是三葉木通受到干旱脅迫的起點(diǎn)。

2. 3 三葉木通葉片解剖結(jié)構(gòu)特征和光合特征的主成分分析結(jié)果

由表3可知，大于1.000的葉片解剖指標(biāo)特征值中有4個主成分的載荷值差異極大，貢獻(xiàn)率達(dá)88.195%，第一、第二、第三和第四主成分的特征值分別為2.303、1.751、1.275和1.112，貢獻(xiàn)率分別為19.633%、16.546%、15.998%和12.533%，主要指標(biāo)分別為柵欄組織、下表皮、木質(zhì)部和海綿組織（荷載系數(shù)>0.460）；大于1.000的葉片光合指標(biāo)特征值有2個主成分的載荷值差異極大，貢獻(xiàn)率達(dá)83.277%，第一主成分和第二主成分的特征值分別為5.933和0.745，貢獻(xiàn)率分別為42.120%和41.157%，指標(biāo)分別為Gs和Chlt（荷載系數(shù)>0.460）。說明在干旱脅迫過程中柵欄組織、木質(zhì)部、海綿組織和下表皮是反映三葉木通解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)的主要指標(biāo)，Chlt和Gs是反映三葉木通光合參數(shù)的主要指標(biāo)。

2. 4 葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)、光合參數(shù)和葉綠素含量的相關(guān)性分析結(jié)果

對SWRC、光合生理指標(biāo)、葉綠素含量和解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表4）表明，SRWC與LWC、Chlt、Pn、Gs、Ci、Tr、Ls及葉片解剖結(jié)構(gòu)中的葉片厚度、柵欄組織厚度和木質(zhì)部厚度均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01，下同），與WUE和SR呈極顯著負(fù)相關(guān)；與SWRC呈極顯著相關(guān)的指標(biāo)占總指標(biāo)的12/19；SWRC與Pn、Tr和WUE的絕對相關(guān)系數(shù)均在0.900以上，與葉片厚度的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.854；柵欄組織厚度與光合性狀參數(shù)Pn、Ci、WUE和Ls呈極顯著相關(guān)，與Gs和Tr呈顯著相關(guān)。說明干旱脅迫下三葉木通葉片結(jié)構(gòu)的變化與光合作用相互影響。

3 討論

植物生長發(fā)育與其所處環(huán)境密切相關(guān)，葉片是對環(huán)境適應(yīng)性和可塑性最強(qiáng)的器官。植物在不同的干旱生境中演化出不同葉肉組織類型，具備雙層甚至更多層?xùn)艡诮M織的植物，其柵欄組織越厚，細(xì)胞越小，排列越緊密（王勛陵和馬驥，1999），植物利用光能的效率越高，以不降低蒸騰作用來提高光合速率（Dong and Zhang，2001）。本研究結(jié)果表明，當(dāng)SRWC低于29%時，三葉木通葉片結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出與水分環(huán)境相適應(yīng)的特征，葉片變薄、柵欄組織細(xì)胞縮短，排列緊密；柵欄組織和葉片厚度與正常SRWC為60%時具有顯著差異，因此SRWC約29%時可視為三葉木通受到干旱脅迫的起點(diǎn)；葉片變薄的原因可能是干旱脅迫下植株水分代謝受到影響，使葉片水勢降低，水分虧缺致使葉片細(xì)胞生長分裂受阻，葉片生長受限；此外，與自身遺傳因素及生化因素等也有關(guān)。Boughalleb等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，絹毛委陵菜（Potentillasericea）、Astragalus gombiformis等植物葉片在干旱逆境中變薄、柵欄組織厚度下降。本研究結(jié)果與Boughalleb等（2014）的研究結(jié)果一致，即從結(jié)構(gòu)變化可看出三葉木通對干旱脅迫采取的是一種被動性適應(yīng)保守策略。本研究中，三葉木通葉片的11個解剖結(jié)構(gòu)特征集中在4個主成分上，其中柵欄組織、木質(zhì)部、海綿組織和下表皮是各因子中負(fù)荷量大于0.460的指標(biāo)，是反映三葉木通葉片的信息因素或變異的誘導(dǎo)因素，但在解剖結(jié)構(gòu)差異性分析中，下表皮無顯著性變化。因此，綜合考慮可將木質(zhì)部、柵欄組織和海綿組織作為三葉木通的耐旱性評價參考指標(biāo)。

干旱脅迫對光合作用的影響與植物葉片的水勢相關(guān)，輕度缺水不直接影響植物的光合作用，當(dāng)葉片水勢下降到一定值后，光合作用才開始下降，之后隨著干旱脅迫程度的加深迅速降低（朱教君等，2005；馬新等，2017）。本研究結(jié)果表明，當(dāng)SRWC降至29%時，光合參數(shù)Pn、Gs、Ci、Ls等發(fā)生顯著變化，與解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著差異變化起點(diǎn)相同，進(jìn)一步證實(shí)可將29% SRWC視為三葉木通受干旱脅迫的起點(diǎn)。Brown和Simpson（1998）研究表明，引起光合速率降低的氣孔和非氣孔因素可根據(jù)Ci和Ls的變化方向來判斷，當(dāng)Ci下降而Ls升高時，Pn下降主要由氣孔導(dǎo)度下降引起，則為氣孔限制因素；若Ci升高而Ls下降或不變，則為非氣孔限制因素引起。本研究中，當(dāng)SRWC降至35%時，Ci明顯下降，Ls呈增加趨勢，說明三葉木通在此過程中Pn下降是由氣孔限制因素所引起，當(dāng)SRWC從35%降至29%時，Ls急劇下降后保持基本穩(wěn)定，說明引起Pn下降主要是氣孔因素轉(zhuǎn)變?yōu)榉菤饪滓蛩?，此時三葉木通葉片的光合機(jī)構(gòu)受到損傷；由此認(rèn)為，29% SRWC為三葉木通葉片光合作用氣孔和非氣孔限制因素的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可視為在喀斯特地區(qū)三葉木通生長允許土壤水分虧缺的最大程度。此外，在主成分分析中Gs作為一個主要成分，載荷系數(shù)達(dá)0.585，說明在干旱脅迫過程中Gs可作為反映三葉木通對干旱的一個抗性指標(biāo)。

葉片對干旱逆境較敏感和具有較大可塑性，表現(xiàn)于形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能變化，尤其是光合能力及WUE變化，反映植物抗旱和適應(yīng)能力（季子敬等，2013；任磊等，2015）。植物的抗旱性涉及多個指標(biāo)，需進(jìn)行綜合性篩選分析，對不同植物篩選出的抗旱性指標(biāo)也存在差異。葉片厚度直接影響水分的散失速率，葉片越厚，WUE越高。在本研究中，WUE與葉片厚度和柵欄組織厚度呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明干旱脅迫下三葉木通的柵欄組織和葉片厚度變薄過程中葉片的水含量也在下降，葉片需提高WUE來滿足生理生化過程的需求，高WUE是植物的適應(yīng)機(jī)制之一，植物的高WUE可作為在喀斯特地區(qū)耐旱性的一個指標(biāo)。本研究中，SRWC降至29%時，WUE與SRWC 60%才具有顯著性差異，說明三葉木通作為喀斯特環(huán)境中的一種適生藤本植物，經(jīng)過長期的適應(yīng)，對干旱反應(yīng)的閾值較高，具有較高的水分適應(yīng)能力和控制能力，其葉片氣孔開度減少，葉片Pn降低，更大程度上降低Tr，有效對水分進(jìn)行分配，在土壤水分虧缺時可減緩葉片水含量的下降速度，進(jìn)而維持植物體內(nèi)生理生化活動的正常進(jìn)行。張海娜等（2013）的研究結(jié)果表明，柵欄組織越厚，在葉片中所占比例越大，水分散失越快。本研究中WUE與柵欄組織的相關(guān)性分析結(jié)果也證實(shí)，柵欄組織厚度變薄，提高了WUE。

4 結(jié)論

三葉木通幼苗在干旱脅迫下通過改變?nèi)~片結(jié)構(gòu)特征、降低光合作用和提高水分利用效率等方式適應(yīng)干旱頻發(fā)的喀斯特環(huán)境；SRWC為29%可視為三葉木通幼苗受干旱脅迫的起點(diǎn)；柵欄組織、海綿組織、木質(zhì)部及Gs可作為三葉木通耐旱性品種篩選的參考指標(biāo)。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）