黃芪糖蛋白對博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的治療作用及機(jī)制

欒智華　任晉宏　薛慧清　柴智　魏硯明　陳薛靜　陳晨　劉新潔

摘要 目的：觀察黃芪糖蛋白（Huang Qi Glycoprotein，HQGP）對肺纖維化小鼠的治療作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法：選取60只健康ICR小鼠，隨機(jī)分為對照組、模型組及觀察組，每組20只。采用鼻腔滴入博萊霉素建立小鼠肺纖維化模型，造模次日起觀察組每天每只小鼠腹腔注射HQGP，連續(xù)14 d，模型組及對照組腹腔注射等體積的生理鹽水；給藥后第7、28天每組分別處死5只動物，取肺組織，評價HQGP對肺組織病理形態(tài)、肺系數(shù)、肺組織羥脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達(dá)的影響。結(jié)果：與模型組比較，第7、28天HQGP觀察組小鼠的肺纖維化程度減輕，肺組織的TGF-β1、Hyp、MDA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），肺組織SOD水平及肺系數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：HQGP可能通過降低膠原合成，提高機(jī)體的抗氧化能力，對肺纖維化的發(fā)生發(fā)展起到治療作用。

關(guān)鍵詞 黃芪糖蛋白；肺纖維化；抗氧化；病理學(xué)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；羥脯氨酸；超氧化物歧化酶；丙二醛

Abstract Objective To observe the therapeutic effect of Huang Qi Glycoprotein （HQGP） on pulmonary fibrosis mice and discusse the mechanism of action.Methods：A total of 60 healthy ICR mice were randomly divided into the control group， the model group and the treatment group， with 20 mice in each group.The mouse pulmonary fibrosis model was established by intranasal instillation of bleomycin.From the next day， the treatment group was intraperitoneally injected with HQGP for 14 days.The model group and the control group were injected with equal volume of normal saline intraperitoneally； 7， 28 days after giving the drug， each group were sacrificed at 5 animal lung tissue.The effect of HQGP on the changes of the lung pathology， pulmonary index， the content of hydroxyproline （Hyp）， superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） and transforming growth factor beta （TGF-β1） were observed.Results：Compared with the model group， the levels of pulmonary fibrosis in mice treated with HQGP were reduced in the 7th and 28th day.The levels of TGF-β1， Hyp， and MDA in lung tissue were significantly lower （P<0.05， P<0.01）， and lung tissue SOD and pulmonary index increased significantly （P<0.05， P<0.01）.Conclusion：HQGP may play an important role in the development of pulmonary fibrosis by reducing the synthesis of collagen and enhancing the antioxidant capacity of the body.

Key Words Huangqi glycoprotein； Pulmonary fibrosis； Antioxidant； Pathology； TGF-β1； Hyp； SOD； MDA

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.044

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重的疾病之一，廣泛累及肺間質(zhì)、肺泡和（或）細(xì)支氣管，由于各種刺激因子介導(dǎo)肺內(nèi)炎性反應(yīng)細(xì)胞滲出，出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積，病程一般呈進(jìn)行性發(fā)展，最終導(dǎo)致呼吸功能衰竭而死亡[1]。隨著污染、環(huán)境惡化等因素，肺纖維化己成為當(dāng)今嚴(yán)峻的健康問題。因西醫(yī)治療手段有限，從中藥及天然植物中提取不良反應(yīng)低的有效單體成分已成為纖維化疾病治療的新途徑。

黃芪糖蛋白（Huang Qi Glycoprotein，HQGP）從傳統(tǒng)中藥膜莢黃芪中提取純化，體外實(shí)驗(yàn)表明其具有一定的免疫抑制作用[2]。HQGP除了具有已知的免疫抑制作用，可能還有直接的抗纖維化的作用，但目前其用于肺纖維化的治療及作用機(jī)制尚未見報道。本研究采用博萊霉素誘導(dǎo)小鼠建立肺纖維化模型，觀察HQGP是否對肺纖維化有干預(yù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為拓展其臨床應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雌性ICR小鼠，體重16～18 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.1.2 藥物 黃芪糖蛋白（HQGP），由山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心薛慧清教授惠贈。注射用鹽酸博萊霉素，浙江海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號16033811。

1.1.3 試劑與儀器

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1（小鼠）ELISA試劑盒，上海研吉生物科技有限公司；羥脯氨酸（Hyp），丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD），考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒，無毒環(huán)保蘇木精染液，均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

721型分光光度計（上海第三分析儀器廠）；YD-1508RⅢ型石蠟切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；5415D型低溫高速多功能離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；DHG-9243BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；BX51T-32F01型全自動顯微攝像系統(tǒng)（日本Olympus公司）；Varioskan型全波長多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠分為對照組、模型組及HQGP觀察組。模型組小鼠參照欒智華等[3]的方法，鼻腔滴注博萊霉素造模。

1.2.2 給藥方法 建模后第2天起，對照組、模型組腹腔注射0.9%生理鹽水，每只小鼠0.2 mL；觀察組腹腔注射HQGP，劑量按照1 mg/kg，用0.9%生理鹽水稀釋，每只0.2 mL，連續(xù)注射14 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)

1.2.3.1 一般狀況觀察 每天觀察動物活動、精神狀態(tài)、攝食等狀況。分別于給藥后第7、14、21、28天，測定每組小鼠的體重變化。分別于給藥后第7、28天，每次每組取5只小鼠，眼球采血處死。取肺臟，用濾紙吸干血跡，稱取并記錄肺質(zhì)量，根據(jù)公式計算肺系數(shù)：肺系數(shù)=肺質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.2.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肺組織形態(tài)變化 分別于給藥后第7、28天取材，每次每組處死5只小鼠。取左肺4%多聚甲醛固定，按常規(guī)病理學(xué)方法包埋，病理切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肺泡炎、肺纖維化程度。

1.2.3.3 分光光度法檢測肺組織中Hyp、SOD、MDA表達(dá) 取右肺用冰鹽水沖洗，濾紙吸干水分，冷凍保存?zhèn)錂z，肺組織中Hyp、SOD、MDA水平檢測均按照試劑盒說明書操作。

1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測肺組織中TGF-β1表達(dá) 取右肺冷凍保存?zhèn)錂z，肺組織中TGF-β1檢測按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 全部資料用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況比較

觀察期間對照組小鼠活潑好動，皮毛光亮，攝食正常，體重逐漸增加。模型組小鼠精神萎靡，呼吸急促，反應(yīng)靈敏度變差，毛發(fā)干燥晦暗，嚴(yán)重者脫毛，進(jìn)食下降，體重逐漸減輕。觀察組小鼠精神狀態(tài)略好于模型組。

每組小鼠在造模后第7、28天肺系數(shù)的變化情況，與對照組比較，模型組小鼠的肺系數(shù)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，觀察組小鼠的肺系數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)的影響 光鏡下對照組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，肺泡間隔未見增厚及炎性反應(yīng)細(xì)胞細(xì)浸潤。模型組小鼠第7天可見明顯急性肺炎，肺泡間隔增寬，可見大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，同時伴有大量出血（圖2B）；模型組小鼠第28天可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡炎性反應(yīng)明顯，肺泡間隔成纖維細(xì)胞大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，呈現(xiàn)典型的肺纖維化病變（圖2E）。與模型組比較，HQGP給藥組小鼠第7、28天肺組織結(jié)構(gòu)明顯改善，炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤程度減輕，成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積均減少，肺組織纖維化程度明顯減輕（圖2C、F）。見圖2。

2.3 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織Hyp的影響

模型組小鼠肺組織中Hyp水平第7、28天明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，HQGP觀察組第7、28天有明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

2.4 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)第7、28天顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，觀察組第7、28天明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

2.5 HQGP對肺纖維化小鼠肺組織SOD，MDA水平的影響

模型組小鼠肺組織中MDA表達(dá)第7、28天顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，觀察組第28天MDA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖5.a。

模型組肺組織中SOD表達(dá)水平第7、28天顯著低于對照組（P<0.05）。與模型組比較，觀察組第28天SOD表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖5.b。

3 討論

肺纖維化是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終形成肺間質(zhì)纖維化為特征病變的慢性進(jìn)展性疾病。目前臨床上用于治療肺纖維化的藥物主要是糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，但其嚴(yán)重不良反應(yīng)影響了廣泛使用，調(diào)查顯示，肺纖維化的發(fā)病率和死亡率正在逐年攀升[4]，但早期診斷和有效的治療手段仍較缺乏，因此尋找合適的中藥治療肺纖維化已成為目前的研究熱點(diǎn)。

糖蛋白是一類由糖類同多肽或蛋白質(zhì)以共價鍵連接而形成的結(jié)合蛋白，廣泛存在于動物、植物和某些微生物中，且存在形式各不相同。山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心從中藥黃芪中提取到一種具有免疫抑制活性的物質(zhì)-黃芪糖蛋白（HQGP），并已申請專利。近年來，關(guān)于黃芪糖蛋白的研究越來越多，楊向竹等[5]發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白的抑制作用主要表現(xiàn)為對T細(xì)胞增殖的抑制，而對B細(xì)胞增殖的抑制只有在高劑量時有作用；在佐劑性關(guān)節(jié)炎（Adjuvan Arthritis，AA）大鼠模型治療實(shí)驗(yàn)中，HQGP對模型鼠的關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)有顯著的改善作用[6]。趙俊云等[7]采用TUNEL法觀察到HQGP可有效誘導(dǎo)AA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織的細(xì)胞凋亡。章培軍等[8]利用HQGP治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE），推測其治療EAE的可能機(jī)制是抑制了炎性反應(yīng)。章培軍等[9]還發(fā)現(xiàn)HQGP通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例，抑制炎性反應(yīng)介質(zhì)釋放，從而減輕EAE炎性反應(yīng)。張娜等[10]研究表明HQGP對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Collagen-induced Arthritis，CIA）小鼠的治療作用，可能是與降低特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3表達(dá)，調(diào)整Th1/Th2功能失衡有關(guān)。但目前還沒有關(guān)于黃芪糖蛋白與小鼠肺纖維化的關(guān)系研究，本研究結(jié)果表明HQGP對小鼠的肺纖維化具有一定的治療作用。

本研究HE染色結(jié)果表明，HQGP可明顯減輕肺纖維化小鼠肺泡結(jié)構(gòu)受損及肺泡間隔增厚的程度，減少炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，表明HQGP對小鼠PF的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用。肺系數(shù)作為反映PF程度的指標(biāo)之一，在PF的發(fā)病過程中，由于炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤、血管充血淤血等因素造成肺重增加，導(dǎo)致肺系數(shù)升高。本研究結(jié)果顯示，HQGP可顯著降低模型小鼠的肺系數(shù)，進(jìn)一步證明HQGP可改善小鼠PF的發(fā)病程度。

Hyp作為膠原纖維蛋白中主要的組成成分，可準(zhǔn)確地間接反映膠原纖維蛋白的水平。研究表明TGF-β1是細(xì)胞外基質(zhì)沉積最強(qiáng)的促進(jìn)劑，還能抑制膠原的降解，在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用顯著[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HQGP能顯著降低肺纖維化小鼠肺組織中Hyp、TGF-β1的表達(dá)，提示HQGP可減輕膠原在肺間質(zhì)得沉積，從而起到減輕PF的作用。

肺纖維化是一個復(fù)雜的病理生理過程，盡管發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但氧化應(yīng)激在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用[12]。SOD是體內(nèi)重要的清除氧自由基的酶，肺組織中SOD的水平可以間接反映機(jī)體肺清除氧自由基的能力[13]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可以反映機(jī)體過氧化的程度，也可以破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HQGP可降低肺纖維化小鼠肺組織內(nèi)MDA水平，上調(diào)SOD的水平，表明HQGP可能通過調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡、降低氧化應(yīng)激損傷達(dá)到減輕PF的目的。

綜上所述，HQGP可能通過降低HYP、TGF-β1的表達(dá)，升高肺組織SOD和降低MDA表達(dá)，提高機(jī)體抗氧化能力，減輕肺組織炎性反應(yīng)損傷和改善纖維化程度，抑制ECM的沉積，保持肺組織結(jié)構(gòu)的完整，從而起到防治PF的作用，這些作用機(jī)制的揭示為指導(dǎo)HQGP的開發(fā)及臨床用藥提供了可靠的藥理學(xué)依據(jù)。

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（2017-07-02收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）