麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞IL—4/STAT6的研究

紀雯婷　胡京紅　于雪　范盎然　任紅　張?zhí)m蘭　劉敏

摘要 目的：研究麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞24 h后，樹突狀細胞STAT6磷酸化程度（pSTAT6）及其STAT6 mRNA、IL-4 mRNA、IFN-γ mRNA表達的影響。方法：體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的樹突狀細胞，7 d后收集細胞，用麻黃細辛附子湯干預(yù)24 h，收集細胞，檢測IL-4、IL-5和IL-13的含量，pSTAT6的表達、檢測IL-4 mRNA、STAT6 mRNA、GATA-3 mRNA的表達。結(jié)果：麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞后降低IL-4（P<0.05）、IL-13（P<0.01）的含量，對IL-5的分泌影響不大，pSTAT6的表達下降（P<0.01）；IL-4 mRNA、STAT6 mRNA，以及GATA-3 mRNA表達降低（P<0.01）結(jié)論：麻黃細辛附子湯能調(diào)控IL-4/STAT6通路，調(diào)節(jié)Th2調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，減輕了變應(yīng)性炎性反應(yīng)的發(fā)生，可對過敏性鼻炎發(fā)揮治療作用。

關(guān)鍵詞 樹突狀細胞；麻黃細辛附子湯；STAT6；Th1/Th2

Abstract Objective：To study the effects on phosphorylation （pSTAT6） level of signal transducer and activator of transcription 6 （STAT6） and the expressions of andSTAT6 mRNA，IL-4 mRNA，IFN-γ mRNA of dendritic cells （DCs） after the 24 h interference of Mahuang Xixin Fuzi Decoction on DCs.Methods：The dendritic cells deriving from mouse bone marrow after 7 days culture in vitro were collected，then the DCs for 24 h were interfered with Mahuang Xixin Fuzi Decoction.The cells were collected and the contents of IL-4，IL-5 and IL-13 and the expressions of pSTAT6，IL-4 mRNA，STAT6 mRNA，GATA-3 mRNA were detected.Results：The contents of IL-4 （P<0.05） and IL-13 （P<0.01） was reduced after intervention of Mahuang Xixin Fuzi Decoction.There was no significant difference in content of IL-5 compared with the blank control group.The expressions of pSTAT6 decreased （P<0.01） and the expression of IL-4 mRNA，STAT6 mRNA，GATA-3 mRNA was decreased （P<0.01）.Conclusion：Mahuang Xixin Fuzi Decoction could control the pathway of IL-4/STAT6 signal transduction and regulate the imbalance of Th1/Th2 and play a vital role in the treatment of allergic rhinitis.

Key Words Dendritic cells； Mahuang Xixin Fuzi Decoction； STAT6； Th1/Th2

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.043

麻黃細辛附子湯出自《傷寒論》，由麻黃、細辛、附子3味藥組成，臨床上常用于過敏性鼻炎、哮喘等疾病，收效顯著[1-3]。過敏性鼻炎為Th2優(yōu)勢免疫應(yīng)答的炎性反應(yīng)[4-6]，其發(fā)生與Th1/Th2的偏移密切相關(guān)。樹突狀細胞是重要的抗原提呈細胞，是免疫應(yīng)答的啟動者，對Th細胞的分化密切相關(guān)。本文通過麻黃細辛附子湯對體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的干預(yù)研究，探討麻黃細辛附子湯治療過敏性鼻炎可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 C57BL/6雄性小鼠6周齡（20±5）g購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，全部小鼠在實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心三級實驗室。實驗室溫度為（22±2）℃，濕度60%±5%，正常光照晝夜節(jié)律，維持安靜環(huán)境。

1.1.2 藥物 實驗選用的麻黃細辛附子湯出自《傷寒論》，麻黃、細辛、附子均購于北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。

1.1.3 試劑與儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher scientific公司），離心機（Eppendorf公司），F(xiàn)CS、RPMI1640培養(yǎng)基為GBICO公司產(chǎn)品，GM-CSF、IL-4來自R&D公司，STAT6抗體購于Proteintech group公司，pSTAT6抗體來自abcam，Aimplex流式高通量檢測試劑盒（北京曠博生物技術(shù)股份有限公司），IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源樹突狀細胞的分離培養(yǎng) C57BL/6J小鼠分離培養(yǎng)方法參考文獻[7-8]具體過程為：無菌條件下將小鼠股骨與脛骨分離，用1 mL注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液從打孔處將骨髓沖入到干燥無菌培養(yǎng)皿中，收集骨髓細胞懸液，用紅細胞裂解液去除紅細胞后，將細胞重懸于含GM-CSF、IL-4的完全培養(yǎng)基中，密度為2×106個/mL，種于6孔板中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天半換液，第6天時收集細胞備用。

1.2.2 藥物制備與篩選

1.2.2.1 麻黃細辛附子湯水提液制備 麻黃細辛附子湯，常用量為麻黃6 g、附子9 g、細辛3 g，用超純水按比例煎煮藥物1 h，使藥物終濃度達1 g/mL。12 000 r/min高速離心2次，10 min/次，收集上清，用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌并分裝，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 麻黃細辛附子湯干預(yù)濃度的篩選 為了篩選適宜濃度的麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞，收集分選的樹突狀細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105，吹打均勻，加入96孔板，每孔100 μL，10倍稀釋等比例稀釋1 g/mL的麻黃附子細辛湯水提液，按順序加入96空中，每個濃度的水提液設(shè)6個復(fù)孔，把細胞培養(yǎng)板放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑，酶標儀測試1次/0.5 h，并記錄數(shù)據(jù)。調(diào)整水提液濃度，重復(fù)實驗，發(fā)現(xiàn)10 mg/mL以內(nèi)的麻黃細辛附子湯對樹突狀細胞的毒性很小，實驗選擇麻黃細辛附子湯干預(yù)濃度為2 mg/mL。

1.2.3 分組與給藥 本次實驗設(shè)計空白對照組（C組）與麻黃細辛附子湯干預(yù)組（M組）。其中，M組用麻黃細辛附子湯（2 mg/mL）干預(yù)24 h，C組用完全培養(yǎng)基對照培養(yǎng)24 h。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 樹突狀細胞IL-4、IL-5、IL-13的檢測 培養(yǎng)樹突狀細胞，按2×105種于24孔板，0.5 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后，收集各組細胞上清，按照Aimplex流式高通量多因子檢測技術(shù)檢測各組樹突狀細胞上清中IL-4、IL-13與IL-5的含量。

1.2.4.2 樹突狀細胞STAT6磷酸化的表達的檢測 培養(yǎng)樹突狀細胞，按5×106種于6孔板，2 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后，分別收集各組細胞，檢測STAT6與pSTAT6蛋白表達水平。

1.2.4.3 樹突狀細胞表達IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA 制備并分選樹突狀細胞，按2×105種于24孔板，0.5 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后，分別收集各組細胞，熒光定量PCR法檢測各組IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA表達。見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，各種計量資料以（±s）表示。多組采用單因素方差分析，SNK兩兩比較；2組比采用獨立t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GM-CSF、IL-4成功誘導(dǎo)單核骨髓細胞成為樹突狀細胞 小鼠骨髓單核細胞經(jīng)過細胞因子GM-CSF、IL-4的刺激下，成功誘導(dǎo)成為樹突狀細胞。顯微鏡下觀測可知，誘導(dǎo)的樹突狀細胞成葡萄串樣生長，細胞有毛刺樣突起。見圖1。

2.2 麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞分泌IL-4與IL-13減少，而IL-5的含量沒有明顯變化 IL-4，IL-5以及IL-13均是典型的Th2型細胞因子。麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞24 h后，樹突狀細胞分泌IL-4的含量減少（P<0.05），分泌IL-13的含量也顯著降低（P<0.01），而IL-5的的含量與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2，圖2?？梢?，麻黃細辛附子湯可直接選擇性降低Th2相關(guān)的細胞因子，起到抑制過敏性炎性反應(yīng)的作用。

2.3 麻黃細辛附子湯降低樹突狀細胞pSTAT6/STAT6比值 麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞24 h后，樹突狀細胞表達STAT6水平較空白對照組無差異，而pSTAT6的表達明顯降低（P<0.01），pSTAT6/STAT6比值降低（P<0.05）。見圖3、圖4?？梢娐辄S細辛附子湯能抑制STAT6磷酸化的水平從而阻止了T細胞Th2方向分化，起到調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡的作用。

2.4 麻黃細辛附子湯降低樹突狀細胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA的表達 IL-4/STAT6通路是經(jīng)典的Th2激活通路，通過細胞因子以及蛋白表達結(jié)果可知，麻黃細辛附子湯可降低IL-4水平，減少STAT6的磷酸化表達，我們進一步通過mRNA水平驗證麻黃細辛附子湯在樹突狀細胞上的抗炎機制。麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞24 h后，樹突狀細胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達均較空白對照組明顯降低（P<0.01）。見表3，圖5?？梢?，麻黃細辛附子湯可通過調(diào)控IL-4 mRNA，STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA發(fā)揮抗過敏的作用。

3 討論

過敏性鼻炎作為TH2優(yōu)勢免疫應(yīng)答的炎性反應(yīng)，其臨床特點為鼻癢、噴嚏、流涕、多遇寒而犯、遷延時長、反復(fù)發(fā)作，過敏性鼻炎貌似“外感”，實為“內(nèi)傷”，通過傳統(tǒng)中醫(yī)思維的辨證分析，可以看出氣虛陽衰而外感寒邪是過敏性鼻炎關(guān)鍵病機[9-10]。麻黃細辛附子湯配伍嚴謹，將扶陽，散陽，通陽3個方面結(jié)合在一起，能扶正祛表，表里兼治，具有治療過敏性鼻炎的理論基礎(chǔ)[11-12]。

樹突狀細胞是抗原提呈細胞中攝取提呈抗原能力最強的成員，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。樹突狀細胞能活化T細胞，分泌各種細胞因子，誘導(dǎo)并促進活化的T細胞分化，對Th分化起著重要的調(diào)控作用[13-14]。其中，樹突狀細胞分泌Th1型細胞因子如IL-12及IFN-γ等，誘導(dǎo)T細胞向T細胞向Th1方向分化[15]。同時，樹突狀細胞也可IL-4及IL-13等Th2型細胞因子，誘導(dǎo)T細胞向Th2方向偏移，造成過敏性疾病的發(fā)生[16]。麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞之后，引起IL-4與IL-13的分泌的減少，可起到調(diào)節(jié)Th2分化，改善過敏性疾病的潛質(zhì)。但麻黃細辛附子湯對IL-5的含量影響不大，說明麻黃細辛附子湯可選擇性的影響Th2型細胞因子，對細胞因子上游具有特殊的調(diào)節(jié)作用。

信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal Transducers and Activators of Transcription，STAT）是一類具有信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化的胞質(zhì)蛋白家族，其家庭成員包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6[17-18]。STAT6可被IL-4、IL-13激活，活化后的STAT6進一步誘導(dǎo)IL-4、IL-13等轉(zhuǎn)錄因子表達，促進IL-4、IL-13等TH2型細胞因子的分泌，加重了TH2型炎性反應(yīng)的發(fā)生[15-16，19-22]。因此，STAT6作為誘導(dǎo)Th2型變應(yīng)性炎性反應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，增加了變應(yīng)性炎性反應(yīng)的易感性，在許多過敏性疾病中都引起了研究者們重視。麻黃細辛附子湯干預(yù)樹突狀細胞后，STAT6磷酸化水平減少，從而阻止了T細胞Th2方向偏移，調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡，起到治療過敏性鼻炎的作用。

GATA-3 mRNA是Th2的特異性轉(zhuǎn)錄因子[23]，作為STAT6的上游[24]，激活后指導(dǎo)T細胞向Th2方向分化。麻黃細辛附子湯干預(yù)后樹突狀細胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達均下降，說明麻黃細辛附子湯對Th2經(jīng)典通路IL-4/STAT6具有調(diào)控作用，可發(fā)揮調(diào)節(jié)過敏性鼻炎的作用。

總之，麻黃細辛附子湯減少IL-4、IL-13分泌，降低pSTAT6水平，降低IL-4 mRNA、STAT6 mRNA及GATAT-3 mRNA含量，負反饋樹突狀細胞IL-4/STAT6通路，使樹突狀細胞抑制T細胞Th2方向分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，從而發(fā)揮治療過敏性鼻炎的作用。

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（2017-07-03收稿 責(zé)任編輯：王明）