當歸拈痛湯對類風濕關節(jié)炎大鼠滑膜細胞凋亡通路的影響

尚延春 申晟 柴巍巍 劉云龍

摘要目的：觀察當歸拈痛湯對類風濕關節(jié)炎大鼠足趾關節(jié)的改變情況及探討其對滑膜細胞凋亡通路的影響。方法：選取50只Wistar雄性大鼠，并隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組；除對照組外其余均建立膠原誘導的關節(jié)炎（Collagen Induced Arthritis，CIA）模型，在類風濕關節(jié)炎模型制備成功后開始給藥：對照組和模型組予以65 g/kg生理鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組均為當歸拈痛湯灌胃給藥，分別給予生藥65 g/kg，130 g/kg，195 g/kg。干預時間28 d。采用容積法測量雙后肢的足趾關節(jié)腫脹度；采用足趾關節(jié)蘇木精伊紅（HE）染色計算細胞凋亡數(shù)；采用免疫印跡法（Western Blotting，WB）檢測Bcl2、PI3K、Bax的蛋白表達情況。結果：對照組未見足趾腫脹情況，給藥1 d模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005），給藥7～28 d各劑量給藥組腫脹度均低于模型組（P<005），至14～28 d中、高劑量組的腫脹度顯著低于低劑量組（P<005），而28 d高劑量組的腫脹度又明顯低于中劑量組（P<005）。足趾關節(jié)HE染色中，對照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組中的細胞凋亡數(shù)呈逐漸上升的趨勢（P<005）。PI3K和Bcl2蛋白在模型組中表達上調，經(jīng)過給藥治療，隨著劑量的逐漸升高而下調（P<005）；而Bax蛋白的表達情況則與PI3K相反，隨著劑量的增加而上調（P<005）。結論：當歸拈痛湯能有效改善類風濕關節(jié)炎大鼠足趾關節(jié)腫脹度，促進滑膜細胞的細胞凋亡數(shù)進而抑制滑膜細胞增殖的進程，而PI3K通路對細胞凋亡的調控起到關鍵的作用。

關鍵詞滑膜；細胞凋亡；PI3K通路；當歸拈痛湯；類風濕關節(jié)炎；大鼠；足趾腫脹度

Experimental Study on Danggui Niantong Decoction in Treating Rheumatoid Arthritis Rats Based on the Apoptotic Pathway of Synovial Cells

Shang Yanchun， Shen Sheng， Chai Weiwei， Liu Yunlong

（Department of Knee Injury， Luoyang Zhenggu Hospital of Henan Province （Henan Orthopedic Hospital）， Zhengzhou 450000， China）

AbstractObjective：To observe the changes of the toe joint of the rats with rheumatoid arthritis （RA） and the effects on the expression of the apoptotic pathway of synovial cells.Methods：Except the control group， a total of 50 male Wistar rats were to establish collagen induced arthritis （collagen induced， arthritis， CIA） model， and randomly divided into model group， low dose group， middle dose group and high dose group； the medicine was given after rheumatoid arthritis model was successfully established.The control group and model group were given 65 g/kg normal saline， and low dose group， middle dose group and high dose group were given gavage Danggui Niantong Decoction of 65 13， 195， g/kg.The time of intervention was 28 days.The swelling degree of toe joints was measured by volumetric method， and the number of apoptotic cells was calculated by HE staining of toe joints， and the protein expression of Bcl2， PI3K and Bax was detected by Western blotting （WB）.Results：1）The control group had no toe swelling， compared with the drug 1 d model group， low dose group， middle dose group and high dose groups， there were without statistically significant difference （P>005）.The administration of the first 7 d28 d in each dosage group swelling degree was lower than the model group （P<005）.The swelling degree of the middle and high dose of 14 d28 d was significantly lower than that in low dose group （P<005）， and the high dose of 28 d group was higher than that of the swelling degree of the middle dose group （P<005）.2）In the HE staining of toe joints， the number of apoptotic cells in the control group， model group， low dose group， middle dose group and high dose group increased gradually （P<005）.3）WB detection showed that the expression of PI3K and Bcl2 in the model group was upregulated.After administration， the expression of Bax protein was decreased （P<005）， while the expression of Bax protein was opposite to that of PI3K， and increased with the increase of dose （P<005）.Conclusion：Danggui Niantong Decoction can effectively improve the joint swelling of rheumatoid arthritis rats， promote the apoptosis of synovial cells and inhibit the process of synovial cell proliferation， and the PI3K pathway plays a key role in the regulation of apoptosis.

Key WordsSynovial membrane； Apoptosis； PI3K pathway； Danggui Niantong Decoction； Rheumatoid arthritis； Rats； HE staining； Toe swelling degree

中圖分類號：R2894；R5932文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.039

類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是臨床常見的自身免疫性疾病，滑膜組織炎癥反應及關節(jié)破壞、畸形及功能喪失是其主要病理改變，給患者日常生活及工作造成嚴重影響[13]。目前現(xiàn)代醫(yī)學并無特異性藥物對其進行治療，多數(shù)靶向治療藥物雖可在一定程度改善RA臨床癥狀，但費用高或不良反應多嚴重影響治療依從性。RA屬于中醫(yī)學“痹證”條目，歷代醫(yī)家均對痹證進行大量條目的論述，風濕熱痹是痹證的主要證候，素體脾胃虧虛致氣血不足，風濕之邪乘虛而入蟄伏體內，郁久化熱，濕熱交織壅堵骨節(jié)經(jīng)脈而發(fā)此病，故健脾益氣、祛風清熱除濕是治療本病的關鍵[4]。當歸拈痛湯首載于金代醫(yī)學家張元素的《醫(yī)學啟源》，是治療濕熱致痛的經(jīng)典名方，其在治療類風濕性關節(jié)炎亦兼顧了病機，臨床不乏其療效的臨床報道[57]，但其作用機制目前尚無統(tǒng)一定論，我們制備RA模型大鼠，利用當歸拈痛湯梯度干預，觀察療效差異及作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1材料與方法

11材料

111動物選取50只的潔級雄性Wistar大鼠（由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體重為（100±20）g，飼養(yǎng)條件室溫20 ℃、自由飲水飲食、通風良好。

112藥物當歸拈痛湯（當歸15 g、羌活10 g、防風10 g、升麻5 g、豬苓12 g、澤瀉10 g、茵陳10 g、陳皮10 g、黃芩10 g、葛根15 g、蒼術15 g、白術15 g、苦參10 g、知母10 g、甘草5 g、全蝎5 g、地龍15 g、黑豆15 g），所有中藥飲片由本院中藥房提供，經(jīng)過煎藥室水煎、抽濾、濃縮制作成200%的濃縮水煎藥液（1 mL約含164 g生藥）。

113試劑與儀器1）類風濕關節(jié)炎造模試劑，產品：雞Ⅱ型膠原（CC II）和完全弗氏佐劑（CFA）均購于Sigma公司。2）免疫印跡法（Western blotting，WB）試劑，產品：Bcl2鼠抗鼠單克隆抗體、PI3K鼠抗鼠單克隆抗體、堿性磷酸酶標記的羊抗兔及羊抗鼠抗體均購自Cell Signaling公司；而Bax、βactin兔抗鼠單克隆抗體則為福州沃森生物科技有限公司產品。3）凝膠成像系統(tǒng)SYSTEM GelDoc XR+（型號：1708195，中國BioRad公司）。

12方法

121分組與模型制備適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為5組即對照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，除對照組，其余均建立在膠原誘導的關節(jié)炎（Collagen Induced Arthritis，CIA）大鼠模型上。CIA模型的建立：將CC Ⅱ溶解于01 mol/L冰醋酸中，并加入等體積的CFA充分乳化，最終配制出終濃度為05 mg/mL的乳劑，即Ⅱ型膠原溶液。根據(jù)03 mL/100 g的用量以10%水合氯醛麻醉大鼠后，將總量為1 mL的Ⅱ型膠原溶液皮下注射于大鼠背部及鼠尾根部多點，1周后上述方法、相同劑量再次皮下注射；對照組僅采用等體積的生理鹽水于相同位置皮下注射。

122干預方法在類風濕關節(jié)炎模型制備成功后開始給藥：對照組和模型組給予65 g/kg生理鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組均為當歸拈痛湯灌胃給藥，分別給予生藥65，130，195 g/kg。干預時間28 d。

123檢測指標與方法

1231足趾關節(jié)腫脹度容積法測量雙后肢的足腫脹度：計分法評價四肢足腫脹度：正常的足趾記為0分；僅有1個足趾關節(jié)腫脹記為1分；2個或超過2個足趾腫脹或1個踝關節(jié)腫脹變形記為2分；全部四肢的足趾關節(jié)腫脹記為3分。每只大鼠總記分0～12分。

1232足趾關節(jié)蘇木精伊紅（HE）染色治療28 d后，麻醉猝死大鼠后取其左前肢和右后肢近端第3足趾關節(jié)進行固定，包埋切片后常規(guī)HE染色，在顯微鏡下凋亡細胞核于滑膜組織中呈深藍或青紫色，在400倍視野中計算每張切片的滑膜組織帶的細胞凋亡數(shù)，計數(shù)5～10個視野，取每個視野平均細胞凋亡數(shù)進行統(tǒng)計分析。

1233免疫印跡法（Western blotting，WB）檢測治療28 d后麻醉猝死大鼠，取其后肢滑膜組織凍存-80 ℃保存，將剪碎滑膜組織加入蛋白裂解緩沖液中裂解，將堿性酮液及酚試劑加入所取上清液，根據(jù)BCA試劑盒說明書，測樣品濃度，并將樣品取等量上樣于濃縮膠中，經(jīng)十二烷基磺酸納聚丙烯酰胺凝膠

（SDSPAGE）電泳、聚偏氟乙烯（PVDF）膜進行轉膜、5%脫脂奶粉封閉2 h后，一抗4 ℃孵育過夜[羊抗鼠Bcl2、PI3K及兔抗鼠Bax抗體（1∶200）、13actin鼠抗鼠抗體（1∶400）]，經(jīng)過3次磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗膜后，室溫孵育相應堿性磷酸酶標記的二抗2 h，ECL堿性磷酸酶顯色，于凝膠自動成像分析系統(tǒng)下成像，對產物進行半定量分析。進行組間比較時則設對照組相對值為1。

13統(tǒng)計學方法采用SPSS 200統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊選擇LSDt或方差不齊選擇Tamhane ′s檢驗，以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

215組足趾腫脹度比較

對照組未見足趾腫脹情況，給藥1 d模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005），給藥7～28 d各劑量給藥組腫脹度均低于模型組（P<005），至14～28 d中、高劑量組的腫脹度顯著低于低劑量組（P<005），而給藥28 d高劑量組的腫脹度又明顯低于中劑量組（P<005）。

225組足趾關節(jié)HE染色比較

足趾關節(jié)HE染色中，對照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組中的細胞凋亡數(shù)呈逐漸上升的趨勢（P<005）。見圖1。

23當歸拈痛湯抑制滑膜細胞凋亡通路

WB檢測中顯示PI3K通路在模型組中表達上調，經(jīng)過給藥治療，隨著劑量的逐漸升高而下調（P<005）；Bcl2蛋白的改變情況同PI3K一致（P<005），而Bax蛋白的表達情況則與PI3K相反，隨著劑量的增加而上調（P<005）。見圖2。

而Bcl2/Bax的比值中，假設對照組為1，則模型組比值最高，其次分別是低劑量組、中劑量組、高劑量組（P<005）。見表2。

3討論

RA以關節(jié)腫脹疼痛、活動不利、晨僵為主要臨床特征，是病因復雜的自身免疫性疾病，具有易復發(fā)、病情纏綿難愈的特點，嚴重影響患者的生命質量及日常工作。非甾體抗炎藥、糖皮質激素、免疫抑制劑是目前臨床治療RA的主要藥物種類，雖可在一定程度上緩解病情，但耐受性差、不良反應明顯，限制了患者的依從性，故探尋新的用藥方案具有重要價值。近年來，中草藥以其毒性低、療效顯著等特點被諸多醫(yī)學科研工作者納入研究。目前有多種類風濕性關節(jié)炎的動物模型，本研究采用膠原誘導的關節(jié)炎模型制備方法，經(jīng)過數(shù)十年的不斷驗證已然成為研究類風濕性關節(jié)炎最重要的動物模型之一，本研究研究顯示此方法制備而成的RA大鼠模型其足趾病理學表現(xiàn)及滑膜病理HE染色結果均與國內外諸多文獻[810]結果相一致，這提示本研究的模型可行且造模成功。

RA屬于中醫(yī)“痹證”“歷節(jié)風”范疇，歷代醫(yī)家對痹證”“歷節(jié)風”研究方興未艾[11]?！饵S帝內經(jīng)》認為“痹證”與風濕二邪的關系密切，當痹證日久不愈則化熱成瘀，瘀阻脈絡耗氣傷津。清代醫(yī)家林佩琴在其《類證治裁·痹證論治》一書中描述：“久痹不愈，必有濕痰敗血瘀滯經(jīng)絡”。故素體虧虛，風濕侵襲機體而成瘀阻，并貫穿本病發(fā)生發(fā)展過程，因此益氣活血，祛風化濕通絡是治療本病的關鍵。當歸拈痛湯源自《醫(yī)學啟源》，是治療濕熱致痛的經(jīng)典名方，方中重用羌活、茵陳，可祛風勝濕，清熱利濕，共為君藥。《本草拾遺》中寫到“茵陳可通關節(jié)，去滯熱”，故羌活、茵陳合用是疏風清熱、化濕止痛經(jīng)典組合。豬苓、澤瀉是利水滲濕的要藥，黃芩、苦參可清熱燥濕；防風、升麻及葛根解表疏風。上述幾味中藥分別從“濕”“風”“熱”方面進行治療。白術、蒼術為佐藥可燥濕健脾，運化水濕以祛邪。RA多以濕邪為勝，藥方中諸藥多以祛濕為主，藥性以苦燥為著，極易耗血傷陰，故加黨參、當歸以益氣生血，知母清熱養(yǎng)陰，達到祛邪不傷正的目的。方中甘草可調和諸藥藥性。縱觀整方藥物配伍，具有發(fā)散風濕與利濕清熱相配，表里共治；苦燥滲利兼顧益氣養(yǎng)血，祛邪而不傷正[1213]。本研究結果顯示加用當歸拈痛湯的大鼠不論是在改善足腫脹度方面還是病理學方面均明顯優(yōu)于模型組，這提示當歸拈痛湯確對RA有理想療效，并具有一定的劑量依賴性。

目前雖對RA的發(fā)病機制尚無統(tǒng)一定論，但有研究顯示RA化膜細胞以自分泌或旁分泌的形式分泌大量活性因子，各類活性因子間相互作用后形成復雜的生物網(wǎng)絡，介導滑膜細胞的增殖及凋亡過程，有研究人員指出，滑膜細胞增殖/凋亡過程的失衡是RA發(fā)生發(fā)展的重要機制，誘導其凋亡是控制病情的關鍵。由此我們考慮當歸拈痛湯可有效治療RA是否與介導滑膜細胞凋亡程序有關，并進一步研究。近年來隨著分子生物學研究不斷深入，各類細胞因子及其相關受體介導細胞增殖、生長、發(fā)育、凋亡等一系列過程已被不斷證實，其中PI3K/AKT通路與細胞凋亡的關系密切，成為研究重點。PI3K/AKT信號通路的異常激活是滑膜細胞凋亡失衡的機制之一[1415]，因此我們認為從PI3K/AKT信號通路研究當歸拈痛湯的作用機制具有理論可行性。于靜雅和陳勇[15]發(fā)現(xiàn)PI3K在RA滑膜細胞中具有高表達，活化的PI3K可激活AKT，從而介導多種下游蛋白的磷酸化，抑制細胞凋亡。PI3K可展現(xiàn)出絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，又具有磷脂酰肌醇激酶的活性，對G蛋白有活化效應，其水平上調后可活化下游因子AKT，抑制諸多凋亡基因的轉錄。本研究中當歸拈痛湯干預的大鼠滑膜組織PI3K水平下調，促進了凋亡程序的啟動。我們對Bcl2及Bax2個細胞因子進一步檢測，Bcl2家族是細胞凋亡程序的“開關分子”，Bcl2與Bax的水平變化決定著細胞的命運，Bcl2是抗細胞凋亡的重要因子，Bax水平上調是促進了細胞凋亡[1617]，Bcl2與Bax均在細胞核、內質網(wǎng)膜及線粒體膜有廣泛分布，當Bcl2表達下調或Bax水平增加時可改變線粒體的孔道形態(tài)，導致其通透性增加，促進了細胞凋亡，Bcl2與Bax表達改變誘導細胞凋亡被研究人員視為“內源性途徑”改變細胞命運[18]。本研究發(fā)現(xiàn)類風濕性關節(jié)炎大鼠Bcl2水平明顯上調，Bax表達被抑制，提示RA模型大鼠的滑膜組織中的滑膜細胞凋亡被抑制，從而導致其增殖能力凸顯，滑膜細胞的過度增殖導致了關節(jié)軟骨和骨組織浸潤生長，從而出現(xiàn)關節(jié)畸形功能下降。當歸拈痛湯干預后大鼠滑膜組織的Bcl2水平下調，Bax表達增加，可見該湯劑可有效誘導滑膜細胞凋亡，改善病情。

總之，我們證實了當歸拈痛湯確對RA有理想療效，其作用機制可能與促進滑膜細胞凋亡有關，從而抑制了滑膜細胞向關節(jié)軟骨和骨組織的過度增殖，改善了RA的病情。

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（2018-01-26收稿責任編輯：楊覺雄）