新型雞糞發(fā)酵提取液對番茄生長及根結(jié)線蟲病的影響

王虹云　李濤　姚建剛　張麗莉　周楊　董泰麗　付傳翠　夏秀波　曹守軍

摘要：【目的】研究雞糞發(fā)酵提取液對番茄生長及根結(jié)線蟲病防治效果的影響，為科學(xué)利用雞糞防治作物根結(jié)線蟲病提供參考?！痉椒ā吭O(shè)5、10、25、50、100、300、500和1000倍8個稀釋倍數(shù)的雞糞發(fā)酵提取液處理，以清水為對照，通過澆灌已接種南方根結(jié)線蟲的盆栽番茄，研究其對番茄植株生長及根結(jié)線蟲病防治效果的影響；通過室內(nèi)培養(yǎng)2齡根結(jié)線蟲和根結(jié)線蟲卵，研究不同稀釋倍數(shù)的雞糞發(fā)酵提取液對根結(jié)線蟲致死和根結(jié)線蟲卵孵化的影響?！窘Y(jié)果】50、100和300倍雞糞發(fā)酵稀釋液更有利于番茄植株前期生長；5、10和25倍雞糞發(fā)酵稀釋液更有利于番茄植株后期生長，且能顯著降低根結(jié)線蟲發(fā)病率，最高防效達(dá)72.7%。培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，5、10和25倍雞糞發(fā)酵稀釋液能顯著抑制根結(jié)線蟲卵孵化，抑制率在70.0%以上；5和10倍雞糞發(fā)酵稀釋液對根結(jié)線蟲的致死作用明顯，處理后24 h即達(dá)到100.0%的致死效果。【結(jié)論】5～10倍稀釋的新型雞糞發(fā)酵提取液能促進(jìn)番茄植株生長，顯著抑制根結(jié)線蟲卵的孵化，殺死2齡線蟲，減少根結(jié)線蟲病的發(fā)生，是一種操作簡便且環(huán)保安全的根結(jié)線蟲病防治方法。

關(guān)鍵詞： 雞糞發(fā)酵液；番茄；根結(jié)線蟲；生長；防治效果

中圖分類號： S432.45 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1130-09

Abstract：【Objective】The effects of chicken manure fermented extract on the tomato growth and control efficiency of root knot nematode were studied to provide reference for scientific use of chicken manure to control root knot nematode. 【Method】Eight diluted multiples（5， 10， 25， 50， 100， 300， 500 and 1000 times） of chicken manure fermented extract were used. Clear water was taken as control. Their effects on growth of tomato plants and the control efficiency of root knot nematode were studied by irrigation of the potted tomatoes inoculated with root knot nematodes. The second instar root knot nematode and root knot nematode eggs were cultured indoor to study the effects of different dilutions of chicken manure fermented extract on lethality of root knot nematode and hatching of its eggs. 【Result】The pot experiment results showed that 50， 100 and 300 times of chicken manure fermented liquid could promote the growth of tomato plants at early stage. High concentration（diluted 5， 10 and 25 times） of chicken manure fermented liquid could enhance the growth of plants at late stage and decrease incidence of root knot nematode with the highest control efficiency of 72.7%. The culture experiment results showed that high concentration（diluted 5， 10 and 25 times） of chicken manure fermented diluent could significantly reduce the hatchability of root knot nematode eggs with inhibition rate of 70.0%. Above all， 5 and 10 times dilution of chicken manure fermented extract caused obvious lethality to root knot nematodes， with a lethal effect of 100.0% 24 h after treatment. 【Conclusion】5-10 times of chicken manure fermented diluent can promote the growth of the tomato plant， plays an important role in inhibiting the hatching of the eggs and killing the second instar juvenile and reduce the incidence of root knot nematode. It is a simple and safe method to prevent and control root knot nematode disease.

Key words： chicken manure fermented extract； tomato； root knot nematode； growth； control efficiency

0 引言

【研究意義】根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）可寄生于多種農(nóng)作物的根系，其分布范圍廣，是嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一種土傳病害。該病害發(fā)生后，植物受害嚴(yán)重，一般減產(chǎn)10%左右，嚴(yán)重的高達(dá)75%以上，甚至絕產(chǎn)（Oka et al.， 2000）。目前根結(jié)線蟲的防治方法較多，主要包括物理方法、化學(xué)方法、生物方法及將幾種方法聯(lián)合起來的綜合防治策略。鑒于化學(xué)方法見效快，生產(chǎn)中歷來以化學(xué)殺線劑為主，但其對環(huán)境污染嚴(yán)重，破壞生態(tài)平衡，且農(nóng)藥殘留極大地降低了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，故研制開發(fā)環(huán)保安全型防治根結(jié)線蟲病的方法具有重要意義。另外，雞糞作為畜禽排泄廢棄物進(jìn)行發(fā)酵重復(fù)利用，可為禽糞的無害化應(yīng)用提供了有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于對蔬菜品質(zhì)、土壤生態(tài)系統(tǒng)及環(huán)境保護(hù)的日益重視，根結(jié)線蟲病逐步趨向于應(yīng)用非化學(xué)方法進(jìn)行治理。施入拮抗菌生物有機肥較無機肥能顯著降低植物根結(jié)線蟲病的發(fā)病率（陳芳等，2011；朱震等，2011）；馬玉琴等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，不同配比的交枝頂孢霉、木霉、淡紫擬青霉和芽孢桿菌通過菌株間的協(xié)同作用，能顯著減退根結(jié)線蟲的發(fā)生，減少根結(jié)的生成，促進(jìn)植株生長。但生防菌均存在防治效果不穩(wěn)定、成本價格較高等問題，且外源微生物及菌種的引入存在破壞土壤生態(tài)的危險。近年來，農(nóng)業(yè)防治根結(jié)線蟲病的方法被大量應(yīng)用。已有研究發(fā)現(xiàn)，與分蘗洋蔥（楊陽和吳鳳芝，2011）及禾本科植物（楊瑞娟等，2017）套作可降低作物植株根結(jié)線蟲病的病情指數(shù)，改善土壤微環(huán)境，提高產(chǎn)量；植物殘體如小麥秸稈（曹志平等，2010）、綠肥紫堇科植物（Naz et al.， 2015）及大蒜秸稈（鞏彪等，2016）的施入在一定程度上優(yōu)化了溫室連作土壤微生物環(huán)境，提高了微生物的數(shù)量及多樣性，從而控制了根結(jié)線蟲的繁殖；高淋淋等（2016）以水稻秸稈、香蕉莖葉和平菇培養(yǎng)肥料等為試材，研究不同堆肥提取液和發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)對番茄根結(jié)線蟲的防治效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各堆肥提取液和發(fā)酵液對番茄根結(jié)線蟲均有一定的防治作用，最高防效達(dá)74.19%。雞糞較其他畜禽糞便養(yǎng)分含量更豐富，生產(chǎn)中常用作有機肥（甘麗紅等，2016；劉術(shù)新等，2016）。郭玉蓮（2004）研究表明雞糞可明顯降低根結(jié)數(shù)，且隨雞糞處理時間的延長，抑制效果相應(yīng)提高。但不合理施用雞糞肥會直接影響植株的生長，包括植株心葉發(fā)黃、矮化、根系蜷縮畸形或無花無果，以及燒根、燒苗、熏棵、死株等，同時會引起病毒病、疫病、莖基腐病、根腐病和青枯病等病害（李國良等，2010）。雞糞經(jīng)無害化處理和腐熟發(fā)酵等過程后，可殺死大部分病原菌和蟲卵，減少燒根、爛苗等現(xiàn)象的發(fā)生?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)雞糞發(fā)酵液防治作物根結(jié)線蟲病的研究尚無文獻(xiàn)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用雞糞經(jīng)生物發(fā)酵工藝，通過U-NRO多級透析提純獲得穩(wěn)定的發(fā)酵液，研究其對番茄生長及根結(jié)線蟲病防治效果的影響，并探討其作用方式，旨在為科學(xué)利用雞糞防治作物根結(jié)線蟲病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗于2017年在煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜溫室內(nèi)進(jìn)行，3月8日育苗，4月19日盆栽定植，4月24日接種線蟲，6月24日結(jié)束試驗。

供試番茄（Solanum lycopersicum）品種為煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所選育的煙粉207。供試根結(jié)線蟲2齡幼蟲的獲得：挑選溫室大棚內(nèi)受根結(jié)線蟲為害嚴(yán)重的番茄植株，取發(fā)病重根系，以自來水洗凈，用鑷子挑取根系上附著的卵塊，用1% NaClO表面消解1 min，無菌水沖洗5～6次，置于鋪有紗網(wǎng)的培養(yǎng)皿中，加水置于25 ℃培養(yǎng)箱，7 d左右取紗網(wǎng)下層的J2懸浮液，約6000條/mL，經(jīng)鑒定為南方根結(jié)線蟲，用于接種試驗。供試根結(jié)線蟲卵的獲?。郝褖K的獲取同上，輕輕研磨后，配制成卵懸液，約5000個/mL，用于卵孵化試驗。雞糞發(fā)酵提取液由山東民和生物科技股份有限公司提供，是雞糞經(jīng)生物發(fā)酵工藝并通過U-NRO多級透析提純獲得的穩(wěn)定發(fā)酵液。

1. 2 試驗方法

番茄種子正常催芽育苗，待長至3葉1心時移入裝有草炭土的試驗盆中（高15 cm×直徑18 cm），每盆1株，緩苗5 d后接種根結(jié)線蟲。參照徐小明等（2008）的方法接種線蟲，接種量為3000條/株，對照組以相同方式注入同體積的清水。接種完成后向土壤表面噴灑適量清水，以保持土壤濕潤。

接種線蟲3 d后進(jìn)行不同濃度雞糞發(fā)酵液對番茄生長的影響試驗。試驗設(shè)計：將雞糞發(fā)酵液分別稀釋5、10、25、50、100、300、500和1000倍，以接種線蟲、施清水為對照（CK），共9個處理，每處理5株番茄，3次重復(fù)。視情況每2 d澆一次水，每10 d澆一次雞糞發(fā)酵液（共澆6次），每次300 mL。

1. 3 測定指標(biāo)及方法

分別于處理后30（5月24日）和60 d（6月24日），采用常規(guī)方法測定番茄株高、莖粗、根長、根鮮重和地上部鮮重；氣孔導(dǎo)度（Gs）、凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）采用LI-6400XT便攜式光合儀（美國LI-COR公司）在晴天上午10：00左右選取番茄生長點向下第3片功能葉進(jìn)行測定。

1. 4 根結(jié)線蟲病害調(diào)查方法

分別于處理后30和60 d根據(jù)病害癥狀對各處理番茄的根部發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，記錄病情級別。根結(jié)分級標(biāo)準(zhǔn)參照馬玉琴等（2016），0 級：根系健康，無根結(jié)；1級：有極少量根結(jié)，根結(jié)數(shù)量占全根系的1%～20%；2級：有少量根結(jié)，根結(jié)數(shù)量占全根系的21%～40%；3級：根結(jié)量中等，根結(jié)數(shù)量占全根系的41%～60%；4級：根結(jié)量很多，根結(jié)數(shù)量占全根系的61%～80%；5級：根結(jié)量極多且大，根結(jié)數(shù)量占全根系的81%～100%。計算病情指數(shù)，確定防治效果。

病情指數(shù)（%）=[（各級病株數(shù)×相應(yīng)級別數(shù)）總株數(shù)×最高病情指數(shù)]

×100

防治效果（%）=[對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對照病情指數(shù)]

×100

1. 5 根結(jié)次氯酸鈉—酸性品紅染色

參照Fan等（2015）的方法，略有改動。將洗凈的番茄根系置于1.5%次氯酸鈉溶液中浸泡4 min，取出用自來水沖洗30 s后轉(zhuǎn)入蒸餾水中浸泡15 min以去除殘留的次氯酸鈉。將根系轉(zhuǎn)入3%酸性品紅溶液，煮沸1 min，冷卻后用自來水沖洗根系表面的殘留品紅，轉(zhuǎn)移酸性甘油（甘油中加2～3滴5 mol/L HCl）的燒杯中加熱褪色0.5～1.0 h，最后將根系轉(zhuǎn)入甘油∶乳酸∶蒸餾水（1∶1∶1）中，過夜后根褪色即可見根結(jié)處紅色較深，此時可對根上的根結(jié)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1. 6 雞糞發(fā)酵液對根結(jié)線蟲卵孵化率的影響

利用96孔板，每孔分別加入根結(jié)線蟲卵懸液40 μL（約200個）及不同體積雞糞發(fā)酵提取原液，用無菌水補充至總體積300 μL，使雞糞發(fā)酵液稀釋倍數(shù)分別為5、10、25、50、100、300、500和1000倍，以無菌水為對照（CK），置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d觀察蟲卵孵化狀況，記錄根結(jié)線蟲孵化數(shù)，計算蟲卵孵化率。每處理重復(fù)5次。由于高濃度發(fā)酵液（稀釋5、10和25倍）為灰黑色影響觀察，試驗取各孔內(nèi)15 μL混合物于載玻片上進(jìn)行顯微觀察，各孔重復(fù)3次。

1. 7 雞糞發(fā)酵液對根結(jié)線蟲2齡幼蟲存活的影響

利用96孔板，每孔分別加入根結(jié)線蟲懸液20 μL（100條左右）及不同體積雞糞發(fā)酵提取原液，用無菌水補充至總體積300 μL，使雞糞發(fā)酵液稀釋倍數(shù)分別為5、10、25、50、100、300、500和1000倍，以無菌水為對照（CK），置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)后8、24和48 h分別觀察線蟲存活情況。每處理5個重復(fù)。高濃度觀察方法同上。記錄線蟲死亡數(shù)目（線蟲僵直，針刺不動視為死亡），計算2齡幼蟲死亡率。

1. 8 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，運用DPS 7.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 雞糞發(fā)酵提取液對番茄生長及光合作用的影響

由圖1和表1可知，經(jīng)不同稀釋倍數(shù)雞糞發(fā)酵提取液處理30 d后，5和10倍稀釋提取液處理的番茄植株葉片濃密深綠，株高和莖粗顯著低于對照（P<0.05，下同），根鮮重顯著高于對照，地上部鮮重與對照差異不顯著（P>0.05，下同），根冠比顯著高于其他處理，說明5和10倍稀釋液能顯著促進(jìn)番茄地下部根系生長；25、50、100和300倍稀釋處理，番茄的株高與對照差異不顯著，地上部及根鮮重顯著高于對照，植株長勢壯；500和1000倍稀釋處理番茄株高顯著高于其他處理，除500倍稀釋處理莖粗和根冠比顯著低于對照外，其他生長指標(biāo)與對照差異不顯著。處理60 d后，各處理番茄植株株高與對照差異不顯著，5、10和25倍稀釋處理植株長勢強，葉大、深綠，地上部鮮重與50倍稀釋處理差異不顯著，但顯著高于其他處理，根鮮重高于對照，根冠比減小，說明前期根系的良好生長促進(jìn)了后期地上部莖葉的生長。

由表2可看出，經(jīng)不同稀釋倍數(shù)雞糞發(fā)酵提取液處理30 d后，5、10和25倍稀釋處理的Pn較低，而50、100、300和500倍稀釋處理的番茄Pn較高，綜合比較，處理組各光合指標(biāo)與對照差異均不顯著。處理60 d后，5、10和25倍稀釋處理的Pn增強，高于其他各處理，且顯著高于對照。另外，除25倍及500倍稀釋處理的Gs、Tr和Ci顯著高于對照外，處理組各指標(biāo)與對照差異均不顯著。綜上所述，50～300倍稀釋液更有利于番茄植株前期的生長，隨植株營養(yǎng)需求量變大，后期5～25倍稀釋液更有利于番茄植株的生長。

2. 2 雞糞發(fā)酵提取液對番茄根結(jié)線蟲病的防治效果

處理30和60 d后，將各處理番茄根系用清水沖洗干凈，對根部發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，記錄病情級別。分析發(fā)現(xiàn)（表3），與對照相比，5～300倍稀釋液在一定程度上能減輕番茄植株根結(jié)線蟲病的發(fā)生，且隨雞糞發(fā)酵液濃度的增加，防治效果逐漸增強。其中，5和10倍雞糞發(fā)酵稀釋液能顯著降低根結(jié)線蟲的危害，前期（30 d）病情指數(shù)均為20.0%，防治效果為57.1%，60 d后病情指數(shù)分別為20.0%和26.7%，防治效果為72.7%和63.6%，有效減少了根結(jié)線蟲對番茄根系的侵染；25倍稀釋液在一定程度上也能減輕根結(jié)線蟲的發(fā)生，處理后30 d的病情指數(shù)為26.7%，防治效果為42.8%，60 d病情指數(shù)為46.7%，防治效果為36.4%；50～300倍稀釋處理的病情指數(shù)較高，防治效果低于30.0%；500和1000倍稀釋處理的病情指數(shù)均高于對照。

由圖2可看出，較對照組植株，5～300倍雞糞發(fā)酵稀釋液處理能顯著促進(jìn)番茄根系生長，須根明顯增多，根系發(fā)達(dá)。對根結(jié)的觀察發(fā)現(xiàn)，對照及低濃度雞糞發(fā)酵液處理的植株根系根結(jié)大且多成串狀，高濃度5和10倍稀釋處理的根系則恰好相反，根結(jié)小而少。

2. 3 雞糞發(fā)酵提取液對根結(jié)線蟲及其卵孵化的影響

進(jìn)一步研究雞糞發(fā)酵提取液對根結(jié)線蟲卵孵化的影響及對線蟲的致死效果。結(jié)果（圖3、圖4）發(fā)現(xiàn)，與對照相比，雞糞發(fā)酵提取液稀釋5、10和25倍處理能顯著抑制根結(jié)線蟲卵的孵化，抑制率在70.0%以上；稀釋50、100和300倍在處理前期能明顯抑制根結(jié)線蟲的孵化，且稀釋倍數(shù)越小，抑制效果越明顯，但這種抑制只是推遲其孵化時間，對最終線蟲的孵化率無明顯影響；對照根結(jié)線蟲孵化的倍數(shù)增長期出現(xiàn)在4～15 d，50、100和300倍稀釋處理的倍數(shù)增長期出現(xiàn)延遲，推遲至7 d后；500和1000倍稀釋處理對根結(jié)線蟲卵孵化的影響不顯著。

不同稀釋倍數(shù)雞糞發(fā)酵提取液對根結(jié)線蟲致死效果的試驗結(jié)果（圖5、圖6）表明，5和10倍雞糞發(fā)酵稀釋液對根結(jié)線蟲的致死作用明顯，24 h時均達(dá)到100.0%的致死效果；25倍稀釋液在處理48 h時致死效果也能達(dá)到70.0%以上，50倍稀釋液處理48 h時致死效果在20.0%左右。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，施用5～300倍雞糞發(fā)酵稀釋液后均能促進(jìn)番茄植株生長，其中50、100和300倍稀釋液能顯著提高番茄地上部及根鮮重，促進(jìn)番茄植株前期生長，植株長勢壯；5、10和25倍稀釋液對番茄植株前期地上部生長促進(jìn)效果不明顯，但能顯著促進(jìn)根系生長，使須根發(fā)生量增多，在番茄生長中后期作用效果開始顯現(xiàn)，植株P(guān)n顯著提高，生長勢增強，與雞糞發(fā)酵提取液施用后促進(jìn)根系生長，從而為中后期旺盛生長打下了基礎(chǔ)有關(guān)，與甘麗紅等（2016）的研究結(jié)果一致。

雞糞發(fā)酵提取液對根結(jié)線蟲病的抑制效果具有明顯的濃度效應(yīng)，稀釋倍數(shù)越小，效果越明顯。5和10倍稀釋液的施入能顯著降低番茄根結(jié)線蟲病的發(fā)生，但施用低濃度的雞糞發(fā)酵液（500和1000倍稀釋）根結(jié)線蟲病情指數(shù)較對照顯著升高，可能是由于低濃度的雞糞發(fā)酵液含有較少的線蟲毒害物質(zhì)，且該土壤環(huán)境更有利于線蟲的生長繁殖，從而導(dǎo)致病害的加重，具體原因尚需進(jìn)一步研究。因此，在實際生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制雞糞發(fā)酵液的施用濃度。

培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)5、10和25倍雞糞發(fā)酵稀釋液對根結(jié)線蟲均有一定的致死效果，且能顯著抑制根結(jié)線蟲卵的孵化，說明雞糞發(fā)酵液中含有導(dǎo)致根結(jié)線蟲死亡及抑制卵孵化的物質(zhì)。目前，從植物資源中分離殺線物質(zhì)防治根結(jié)線蟲的研究較廣泛，并取得了較好的效果，如從萬壽菊屬植物分離得到的三聯(lián)噻吩類化合物（Natarajan et al.， 2006），從苦楝中分離得到的苦楝素（Javed et al.， 2008），一些十字花科植物產(chǎn)生的葡糖異硫氰酸鹽化合物（Monfort et al.， 2007）等均對根結(jié)線蟲有較好的殺滅效果，但針對發(fā)酵有機肥中防治根結(jié)線蟲主要物質(zhì)的研究還較少。今后將進(jìn)一步研究雞糞發(fā)酵液的主要組成成分，確定殺線的有效物質(zhì)，以期為根結(jié)線蟲病的防治提供新的途徑。

4 結(jié)論

在番茄生長過程中施入5～10倍稀釋的新型雞糞發(fā)酵提取液能促進(jìn)番茄植株生長，顯著抑制根結(jié)線蟲卵孵化，殺死2齡線蟲，減少根結(jié)線蟲病的發(fā)生，最高防效可達(dá)72.7%，是一種操作簡便且環(huán)保安全的根結(jié)線蟲病防治方法。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）