翹芩清肺劑對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路的影響

張秋玲 韓超 徐俊 楊柳 梁慧玲 楊潔穎

摘要目的：探討翹芩清肺劑在改善哮喘氣道炎癥及其可能的作用機(jī)制。方法：選取雌性SD大鼠50只，制備哮喘大鼠模型并隨機(jī)分成5組，即正常組、模型組、地塞米松組和翹芩清肺劑低、高劑量組。分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞介素1（IL1）、IL5及干擾素γ（IFNγ）的含量，并觀察肺組織病理學(xué)改變；用免疫組織化學(xué)染色法觀察細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）在肺組織內(nèi)的表達(dá)，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β1在支氣管組織內(nèi)的表達(dá)；用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（Realtime PCR）測定氣道平滑肌組織中ERK mRNA含量。結(jié)果：模型組中ERK蛋白含量及mRNA水平，TGFβ1蛋白表達(dá)較正常組有顯著增加（P<005）；與模型組比較，各干預(yù)組均能明顯降低ERK mRNA及TGFβ1蛋白水平（P<005）。結(jié)論：翹芩清肺劑可明顯改善哮喘大鼠的呼吸道癥狀，對氣道具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)IL4/IFNγ平衡失調(diào)、抑制ERK通路的磷酸化，減輕氣道炎癥有關(guān)。

關(guān)鍵詞翹芩清肺劑；氣道炎癥；ERK信號通路；轉(zhuǎn)化生長因子β1

Study on Effects of Qiaoqin Qingfei Formula on ERK Pathway in Airway Smooth Muscle Cell of Asthmatic Rat

Zhang Qiuling1， Han Chao1， Xu Jun2， Yang Liu2， Liang Huiling1， Yang Jieying1

（1 Guangzhou Hospital of Chinese Medicine， Guangzhou 510130， China； 2 School of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AbstractObjective：To investigate the Qiaoqin Qingfei Formula in improving airway inflammation and its possible mechanism. Methods：Fifty female SD rats with asthma were randomly divided into 5 groups：normal group， model group， dexamethasone group and， low and high dose group of Qiaoqin Qingfei Formula. The contents of interleukin1 （IL1）， interleukin5 （IL5） and interferon gamma （IFNγ） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected with ELISA method after administration. The proteins expression of the Erk1/2 of the lung tissues and the TGFβ1 of the bronchial tissues were analyzed by Western blot method and the mRNA expression of ERK1/2 of the bronchial tissues were analyzed by Realtime PCR. Results：Compared with normal group， the mRNA expression of ERK and the protein expression of TGFβ1 were significantly increased （P<001）. Compared with the model group， all the treatment groups significantly decreased the expression of the ERK mRNA and the protein of TGFβ1 （P<005001）. Conclusion：Qiaoqin Qingfei Formula can significantly improve the symptoms of respiratory tract which has a protective effect on asthmatic rats. Its mechanism may be related to the inhibition of the phosphorylation of ERK signaling pathway， regulation of IL4/IFNγimbalance and reduction of inflammatory cell infiltration.

Key WordsQiaoqin Qingfei Formula； Airway inflammation； ERK signal pathways； TGFβ

中圖分類號：R2895文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.037

支氣管哮喘（哮喘）是由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎性反應(yīng)細(xì)胞參與的以慢性氣道炎性反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性為特征的慢性呼吸道系統(tǒng)疾病。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellularsignal Regulated Kinase，ERK）是絲裂原活化激酶（MAPKs）家族中的重要成員之一，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生理病理過程，作為一個重要的第二信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了哮喘氣道慢性炎性反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性（AHR）和氣道平滑肌的增殖等多種病理生理過程[12]。近年來國內(nèi)外有關(guān)ERK通路在哮喘發(fā)病機(jī)制中作用已成為研究熱點(diǎn)之一。翹芩清肺劑為我院呼吸內(nèi)科總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所擬的驗(yàn)方，并制成院內(nèi)制劑臨床使用20余年，治療急慢性支氣管炎臨床療效顯著，深受廣大病患?xì)g迎。研究發(fā)現(xiàn)，其在防治哮喘方面也有良好效果。本研究擬通過卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)大鼠制備哮喘的動物病理模型，觀察翹芩清肺劑對大鼠氣道炎癥的影響及初步探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

11材料

111動物選取SPF級SD大鼠50只，雌性，6～8周齡，體重150～180 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）20130002）。實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（粵）20122017。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)條件20～25 ℃室溫，自由飲食。

112藥物翹芩清肺劑（下簡稱翹芩，由廣州市中醫(yī)醫(yī)院制備，25 kg生藥量/L）；地塞米松（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：140692）。

113試劑與儀器Sigma卵清雞白蛋白（OVA）（USA，批號：A5253）；生理鹽水（常州蘭陵制藥有限公司，批號：H52020069）；氫氧化鋁干粉（廣州化學(xué)試劑廠，批號：201912012）；8%和10%免疫印跡預(yù)制膠（弗德生物有限公司，批號：20150501）；TGFβ抗體（Cell Signaling，批號：3711S）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0012S）；RIPA蛋白裂解液（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號：10C09A05）；IFNγ、IL4、IL5檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Western Blotting Luminol Reagent（PIERCE）；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker（Fermentas）；PrimeScriptR RT reagent Kit、SYBRR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）；PVDF膜（BioRad）；RNAiso Plus（Takara寶生物工程（大連）有限公司，批號：AA16071）；曝光膠片（富士）；蛋白酶抑制劑混合物（Cocktail，100×）；APS、TEMED（SigmaAldrich）；Tween20（Aresco）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純以上。

JJ12J型脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；402AI型超聲霧化器（魚躍股份有限公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；JBP5型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；KDP型組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；JBL5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；ISRDD3型恒溫振蕩器（美國Crystal Technology公司）；M114型顯微鏡（OPTIKA）；ST16R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Sorvall公司）；凝膠電泳、電轉(zhuǎn)儀（美國BioRAD公司）；PB602L型電子分析天平（瑞士METTLER公司）；UV7504型單光束紫外可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；Safire2型全波長多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

12方法

121分組與模型制備隨機(jī)選取50只大鼠，經(jīng)7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，采用文獻(xiàn)[34]方法制備哮喘模型。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按大鼠體重隨機(jī)分成5組：對照組、模型組、地塞米松組、翹芩高劑量組和低劑量組，每組10只。模型及藥物組大鼠在實(shí)驗(yàn)第1、8天分別腹腔注射10%卵清蛋白（OVA）混懸液1 mL致敏，正常組給予生理鹽水腹腔注射1 mL。從第15天起，將大鼠置于密閉有機(jī)玻璃箱中用超聲霧化器噴霧，任大鼠自行吸入，進(jìn)行激發(fā)造模。每次噴霧1% OVA混懸液（正常組用生理鹽水代替）。1次/d，30 min/次，連續(xù)2周。

122給藥方法自大鼠首次致敏第2天開始，各組動物均以相應(yīng)藥物灌胃。第15天開始在給藥30 min后進(jìn)行激發(fā)，（地塞米松組自第15天后，隔天給藥）；1次/d，共4周：正常組：生理鹽水5 mL/（kg·d）；模型組：生理鹽水5 mL/（kg·d）；地塞米松組：027 mg/（kg·d）；翹芩高劑量組：26 g/（kg·d）；翹芩低劑量：65 g/（kg·d）。

123標(biāo)本采集及相關(guān)檢測連續(xù)給藥2周后，于末次激發(fā)后24 h內(nèi)進(jìn)行腹腔麻醉（4%戊巴妥鈉，1 mL/kg體重）取材：1）肺泡灌洗液（BALF）：打開大鼠胸腔后，選取右肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗術(shù)，把09%氯化鈉注射液5 mL，以25 mL/次注入氣管內(nèi)，緩慢反復(fù)抽吸，將灌洗液留取3～4 mL，于4 ℃、2 000 r/min離心15 min，取上清液用于白細(xì)胞介素4（IL4）、白細(xì)胞介素5（IL5）及干擾素γ（IFNγ）的含量測定，具體步驟按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒說明操作。2）肺組織：迅速打開大鼠胸腔，分離肺組織，以10%甲醛固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片。3）氣道組織：打開頸部皮膚，分離氣管，切取氣管至支氣管段，冰凍切片，以10%甲醛內(nèi)固定24 h，常規(guī)石蠟切片。

1231肺組織病理觀察左上葉肺組織切片，蘇木精伊紅（HE）染色后于鏡下觀察肺部病理變化。

1232免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肺中ERK1/2及氣道中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β蛋白的表達(dá)檢測步驟按說明書進(jìn)行，依次為肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，冷卻后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH74）洗滌，置于H2O2溶液（3%）中避光室溫孵育，用PBS洗滌以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片甩干，滴加牛血清白蛋白（BSA）（3%）后室溫封閉10 min，PBS洗滌，滴加一抗，孵育后再滴加二抗，PBS洗滌，洗滌，顯色，復(fù)染細(xì)胞核，DW洗滌后脫水封片。

1233氣道組織ERK1/2 mRNA表達(dá)的檢測用于實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列如下表1所示。

取樣品（剪取每組肺組織約30 mg）剪碎，冷凍研磨，用Trizol一步法提取總RNA，按相應(yīng)試劑盒操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（37 ℃，30 min）；令逆轉(zhuǎn)錄酶失活（85 ℃，10 s）；95 ℃，30 s（預(yù)變性）；PCR反應(yīng)（95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40個循環(huán)）；解離（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s）；溶解曲線（65 ℃下30 s）。

實(shí)時PCR擴(kuò)增后，確認(rèn)融解及擴(kuò)增曲線良好，運(yùn)用△△ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 130統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21翹芩清肺劑對氣道炎癥及肺部病理變化的影響模型組肺泡間質(zhì)明顯增厚并伴隨大量淋巴細(xì)胞浸潤，支氣管杯狀細(xì)胞明顯增殖，部分見脫落，固有層明顯增厚并淋巴浸潤明顯，黏膜層明顯增厚并纖維化，可見部分黏液腺增生；血管黏膜層纖維性增生；血管支氣管管腔中可見黏液滲出形成黏液栓。各藥物干預(yù)組固有層增厚程度較輕，黏膜層增厚較模型組減輕。其中，地塞米松組支氣管結(jié)構(gòu)完整，管徑正常，管壁細(xì)胞排列紊亂，管周有少量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞增殖減少；翹芩清肺劑組支氣管黏膜上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞的增殖減少，支氣管稍變形，炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤明顯減少，管壁及平滑肌厚度明顯減小，以上改變隨翹芩清肺劑劑量的加大而減輕。對照組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，氣管杯狀細(xì)胞無明顯增殖及脫落，血管結(jié)構(gòu)完整，周圍無明顯炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤。見圖1AE。

22翹芩清肺劑對支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL4、IL5及IFNγ水平的影響與對照組比較，模型組BALF中IL4、IL5的表達(dá)水平明顯增加，IFNγ表達(dá)水平明顯下降（P<005）。與模型組比較，經(jīng)藥物干預(yù)后，各藥物組均能顯著降低IL4的表達(dá)及IL4/IFNγ的比值（P<005）。其中，翹芩清肺劑降低IL4表達(dá)的作用隨著劑量加大而增強(qiáng)。翹芩清肺劑高劑量組及地塞米松組均可明顯降低IL5水平（P<005），IFNγ水平增加（P<005），但翹芩清肺劑低劑量組則對其無明顯影響（P>005）。見表2。

組織中的pERK1/2及氣道組織中TGFβ1的蛋白表達(dá)明顯增高（P<005）；地塞米松組相對于模型組肺組織中pERK1/2的蛋白表達(dá)顯著下降（P<0005）；翹芩組相對于模型組pERK1/2蛋白表達(dá)均有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。藥物組中的TGFβ1蛋白表達(dá)均有明顯降低（P<005）；翹芩組降低TGFβ1蛋白表達(dá)的作用略優(yōu)于地塞米松組，且隨劑量的增加作用有所增大，但藥物組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。見圖2、3（AE）、表3。

34翹芩清肺劑對氣道組織中ERK1/2 mRNA表達(dá)的影響與對照組比較，模型組的ERK1/2 mRNA含量顯著增多（P<005）；與模型組比較，各藥物組均能明顯降差異低ERK1/2 mRNA的表達(dá)（P<005）；其中以翹芩高劑量組作用為最優(yōu)，與翹芩低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見圖4。

3討論

哮喘是由多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)和多種炎性反應(yīng)細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥，有研究者認(rèn)為，氣道重塑可能與氣道炎癥并存，并進(jìn)一步導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生和持續(xù)存在[5]，其中氣道平滑肌細(xì)胞增殖肥大占有重要地位。TGFβ1是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的促氣道纖維化因子，氣道平滑肌在TGFβ1的刺激下，可誘發(fā)細(xì)胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)高分泌及收縮蛋白合成增加等，進(jìn)而出現(xiàn)氣道重塑、氣道高反應(yīng)性等一系列表現(xiàn)[67]。在哮喘發(fā)病過程中，以TGFβ為代表的細(xì)胞因子表達(dá)紊亂，從而激活相關(guān)信號通路，影響細(xì)胞的屏障功能是哮喘重要的病理機(jī)制之一，也是導(dǎo)致隨后發(fā)生的氣道高反應(yīng)性、氣道重塑的一個重要環(huán)節(jié)。

目前發(fā)現(xiàn)ERK在氣道平滑肌上廣泛分布并主要以ERK1、ERK2 2種亞型存在。ERK1/2的磷酸化表示ERK信號通路被激活，其磷酸化的一系列底物可激活多種效應(yīng)蛋白，并廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生理病理過程。研究結(jié)果表明ERK通路與哮喘發(fā)病機(jī)制過程密切相關(guān)，并參與了哮喘氣道高反應(yīng)性、氣道慢性炎癥等的發(fā)生、發(fā)展[12]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)我們觀察了翹芩清肺劑對ERK通路的影響，以期探討翹芩清肺劑改善哮喘氣道炎性反應(yīng)可能的作用機(jī)制。

翹芩清肺劑為我院臨床應(yīng)用20余年的院內(nèi)純中藥復(fù)方制劑，療效確切，無明顯不良反應(yīng)。方中主要成分為連翹、黃芩、板藍(lán)根、荊芥、杏仁等，全方清肺化痰，疏風(fēng)清熱。目前我們研究已證實(shí)，翹芩清肺劑對OVA誘導(dǎo)的大鼠哮喘發(fā)作具有抑制作用，可與臨床療效相印證。研究結(jié)果顯示，翹芩清肺劑可明顯地改善氣道炎性反應(yīng)，減輕支氣管細(xì)胞增殖及平滑肌增厚，其作用機(jī)制可能與降低哮喘時過高的PAF與ET表達(dá)，糾正了Th1/Th2失衡有關(guān)[67]。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，相對于對照組，ERK1/2、TGFβ1蛋白的表達(dá)、BALF液中的IL4、IL5表達(dá)在模型組中顯著增高，IFNγ表達(dá)則明顯降低；用藥后，各藥物組均能明顯降低病鼠肺中ERK1/2 mRNA及氣道中TGFβ1的表達(dá)水平；其中翹芩清肺劑高劑量組、翹芩清肺劑低劑量組降低ERK1/2 mRNA及TGFβ1表達(dá)的作用與地塞米松組相當(dāng)；翹芩清肺劑低劑量組降低TGFβ1的蛋白表達(dá)效果與高劑量組相當(dāng)。各藥物組均能降低IL4的含量及IL4/IFNγ的比值。其中地塞米松組及翹芩清肺劑高劑量組可明顯降低IL5的表達(dá)，增加IFNγ的表達(dá)，而翹芩清肺劑低劑量組對其則無明顯作用。

其中，ERK的氣道表達(dá)的放免及PCR結(jié)果表明，翹芩清肺劑可明顯降低ERK mRNA的表達(dá)，而放免結(jié)果雖ERK的蛋白表達(dá)均有所下降，但比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推測，翹芩清肺劑可顯著抑制ERK1/2 mRNA復(fù)制和（或）DNA轉(zhuǎn)錄，而ERK的蛋白合成因遲于RNA和DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，故未見ERK蛋白表達(dá)的差異顯著性。由此說明，擬觀察翹芩清肺劑對哮喘ERK蛋白變化的影響，需要更長的時間。

綜上所述，我們認(rèn)為，翹芩清肺劑防治哮喘的作用可能是通過降低TGFβ1的表達(dá)，下調(diào)pERK1/2 mRNA水平，調(diào)節(jié)ERK信號通路的傳導(dǎo)，減輕氣道纖維化及氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，減緩炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展等而實(shí)現(xiàn)的。

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（2018-04-18收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）