茅尾海無瓣海桑根際土壤細(xì)菌多樣性及抑菌活性分析

顏棟美　王偉　李蜜　江蕾　易湘茜　高程海

摘要：【目的】研究茅尾海無瓣海桑根際土壤細(xì)菌多樣性及抑菌活性，挖掘更多潛在新物種和高效活性物質(zhì)，為進(jìn)一步研究紅樹植物根際土壤中細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物及研發(fā)新型高效生物農(nóng)藥提供參考依據(jù)。【方法】從廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)采集無瓣海桑根際土壤，采用6種分離培養(yǎng)基分離可培養(yǎng)細(xì)菌；通過16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析其物種多樣性，并采用牛津杯法考察根際細(xì)菌對甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性。【結(jié)果】從無瓣海桑根際中分離得到可培養(yǎng)細(xì)菌97株，通過16S rRNA序列比對排重后，從中獲得57株不同細(xì)菌，可歸為4門5綱9目15科21屬，有1株Cellvibrio sp.的潛在新種。其中29株細(xì)菌能夠抑制甘蔗鞭黑粉菌活性，分別有12、14和14株細(xì)菌對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長、“+”擔(dān)孢子增殖和“-”擔(dān)孢子增殖表現(xiàn)出抑制活性，抑菌圈直徑范圍為7.54～21.81 mm，其中有9株細(xì)菌能夠抑制2～3種甘蔗鞭黑粉菌的形態(tài)?！窘Y(jié)論】廣西茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)中無瓣海桑根際細(xì)菌具有較高的物種多樣性，蘊藏著潛在新物種資源，且富含抑菌活性菌株。

關(guān)鍵詞： 無瓣海桑根際；細(xì)菌多樣性；甘蔗鞭黑粉菌；抑菌活性；茅尾海紅樹林

中圖分類號： S482.292；Q939.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）06-1095-07

Abstract：【Objective】Diversity and inhibition activity of rhizospheric bacteria which came from Sonneratia apetala in Maowei Sea were studied to find out more potential new species and high-efficiency active materials， and provided re-ference for the further research on secondary metabolites of the rhizospheric bacteria of mangrove plant and the further development of new and efficient biological pesticides. 【Method】The rhizosphere soil of S. apetala were collected from Maowei Sea mangrove reserve in Qinzhou， Guangxi. Six different media were employed to isolate the cultured bacteria. The species diversity was revealed through phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence， and Oxford cup method was used to investigate the inhibitory activity of the rhizosphere bacteria against Sporisorium scitamineum. 【Result】The 97 strains of culturable bacteria were isolated from the rhizosphere of S. apetala.After comparing the 16S rRNA sequence alignments， 57 different strains of bacteria were obtained， which could be classified into 21 genera， 15 families， 9 orders， 5 classes and 4 phyla. There was also a potential new species of Cellvibrio sp. The 29 strains could inhibit the activity of S. scitamineum. That there were 12， 14 and 14 strains of bacteria exhibited inhibitory activity against mycelium growth， proliferation of “+” spores， and proliferation of “-” spores of S. scitamineum respectively. The diameter of inhibition zone was between 7.54 and 21.81，and 9 strains of which could inhibit the morphology of 2 to 3 species of S. scitamineum. 【Conclusion】The rhizospheric bacteria of S. apetala which come from Maowei Sea mangrove reserve in Qinzhou， Guangxi have high species diversity， contain potential new species resources， and are rich in antibacterial activity strains.

Key words： Sonneratia apetala； bacterial diversity； Sporisorium scitamineum； antibacterial activity；Maowei Sea mangrove

0 引言

【研究意義】近年來，人們對生態(tài)環(huán)境和食品安全的要求日益提高，生物農(nóng)藥因其高效、低毒、低殘留和低制備成本等特點而備受關(guān)注，尋找高效、新型的生物農(nóng)藥已成為植保領(lǐng)域研究熱點。紅樹林是陸地向海洋過度的特殊生態(tài)系統(tǒng)，兼?zhèn)潢懙睾秃Ｑ蟮奶刭|(zhì)，具有強還原性、強酸性、高水分、高含鹽量、營養(yǎng)豐富及氧氣缺乏等特征，因而紅樹植物根際土壤微生物能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、活性突出的次級代謝產(chǎn)物（張偲等，2010），同時包括許多具有顯著活性的新菌（孫靜等，2014；吳家法等，2017）。因此，研究紅樹根際土壤細(xì)菌，挖掘其潛在的生物活性，成為研發(fā)低毒、高效及環(huán)境友好型生物農(nóng)藥的重要途徑之一。【前人研究進(jìn)展】目前，已知紅樹植物根際土壤微生物能夠產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次級代謝產(chǎn)物，且具有抗腫瘤（繆承杜等，2008）、胞外酶（李倩茹和符夏梨，2009）、抗病毒（李逾，2012）和抗菌（李小群等，2017）等生物活性。梁碧怡等（2012）從紅樹植物根部土壤中分離出44株具有抑制天然耐藥性恥垢分歧桿菌，其中從老鼠簕根際土壤中分離得到的放線菌數(shù)量和抗菌活性菌株數(shù)量最多；夏麗娟等（2014）從桐花、秋茄、白蓮、木欖和老鼠簕等5種紅樹植物中分離出50株真菌，其中16株真菌對多種球菌有抑菌活性；李小群等（2017）從海芒果及其根際土壤中分離出15株細(xì)菌，均對哈維氏弧菌、副溶血弧菌及溶藻弧菌具有抑制活性?！颈狙芯壳腥朦c】茅尾海紅樹林自然保護(hù)區(qū)為熱帶海洋性季風(fēng)氣候，海陸交匯使其物質(zhì)積累豐富，蘊育著豐富的生物多樣性，保護(hù)區(qū)內(nèi)含有豐富紅樹植物（常濤等，2015）。但目前有關(guān)該保護(hù)區(qū)內(nèi)紅樹植物根際土壤細(xì)菌多樣性及其對全球危害性病菌——甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）的研究均鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以廣西茅尾海紅樹無瓣海桑根際為研究對象，通過傳統(tǒng)分離技術(shù)，分析可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性及可培養(yǎng)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用，以期獲得更多紅樹林特有的微生物信息和高活性菌株，為進(jìn)一步研究紅樹植物根際土壤中細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物及研發(fā)新型高效生物農(nóng)藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

無瓣海桑根際采集自廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)（東經(jīng)108°36′14″、北緯21°44′53″），裝于自封袋內(nèi)帶回實驗室，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。甘蔗黑粉菌冬孢子?016年9月初采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田，采集新鮮黑穗病鞭子（冬孢子），輕輕敲打鞭子上的冬孢子，裝于封口袋中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?種分離培養(yǎng)基（AGG、M5、M6、M7、M9和2216E）。ISP2液體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基和YEPS液體培養(yǎng)基參照李菲等（2018）的試驗配方進(jìn)行配制。培養(yǎng)基原料、2×Easy Taq Master Mix、DNA Marker、TAE緩沖液、引物（27F和1492R）和GoldView核酸染料均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Chelex-100樹脂購自美國Bio-Rad公司，其他有機試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 根際細(xì)菌分離純化 收集紅樹無瓣海桑根須表面附著的土壤（距離根須5 mm以內(nèi)），稱取2.0 g土壤樣品置于裝有20 mL無菌水（內(nèi)有玻璃珠）的錐形瓶中，手動搖勻；依次制成10-2和10-3稀釋度樣液，分別取200 μL樣液置于6種分離培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，觀察菌落形態(tài)特征，挑取菌落進(jìn)行純化。純化后的菌株置于20%（v/v）甘油中，-80 ℃冷凍保藏。

1. 2. 2 PCR擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用Chelex-100提取菌株DNA（周雙清等，2010），進(jìn)行PCR擴增（李菲等，2018）。擴增和測序引物為細(xì)菌通用引物27F和1492R。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司進(jìn)行測序。其中1個潛在新物種的PCR擴增產(chǎn)物條帶切膠回收，連接pUC-T克隆載體后，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆子，采用PCR擴增驗證克隆的片段長度并測序。測序結(jié)果利用EzTa-xon服務(wù)器（http：//www.eztaxon.org/）進(jìn)行在線比對分析；選取同源性最高菌株作參比對象，運用MEGA 5.0，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura two parameter模型評估，Boostrap 1000次檢測各分支的置信值，評估進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（Tamura et al.，2011）。

1. 2. 3 抑菌活性試驗

1. 2. 3. 1 粗提物制備 將對數(shù)期生長的菌株接種于ISP2液體培養(yǎng)基中，28 ℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)7 d。用細(xì)胞破碎儀處理整個培養(yǎng)液20 min，然后用1∶1（v/v）乙酸乙酯萃取培養(yǎng)液3次，每次20 min以上。濃縮干燥后，用二甲基亞砜（DMSO）配成濃度為10 mg/mL樣液，并用0.45 μm有機膜過濾樣液，置于 -20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3. 2 甘蔗鞭黑粉菌擔(dān)孢子制備 參照李菲等（2018）的方法，用無菌水將甘蔗鞭黑粉菌冬孢子梯度稀釋至10-5，在PDA固體培養(yǎng)基上分別用10-3、10-4和10-5 3個稀釋度的菌液涂布，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑選幾個表面光滑的菌落和邊緣鋸齒狀的菌落接入1 mL無菌水中，兩兩組合，在PDA固體培養(yǎng)基上點樣驗證。若菌落為絨毛狀，則為異型（+、-）組合；若菌落為酵母態(tài)，則為同型（+、+）或（-、-）組合。并進(jìn)一步推測出甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”擔(dān)孢子的編號，分別取甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”擔(dān)孢子接種至YEPS液體培養(yǎng)基中，28 ℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)36 h。用分光光度計檢測兩種擔(dān)孢子的濃度，無菌水稀釋，使其擔(dān)孢子數(shù)約為1×105 CFU/mL。

1. 2. 3. 3 含菌培養(yǎng)基制備 取10%（v/v）“+”擔(dān)孢子培養(yǎng)液或10%（v/v）“-”擔(dān)孢子培養(yǎng)液或5%“+”擔(dān)孢子與5%“-”擔(dān)孢子的混合培養(yǎng)液（1.2.3.2中含有1×105 CFU/mL個擔(dān)孢子數(shù)的YEPS培養(yǎng)液）與PDA固體培養(yǎng)基（47～50 ℃）混合均勻，分別倒培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后放牛津杯（已滅菌），并固定在培養(yǎng)基上。

1. 2. 3. 4 抑菌活性測定 采用牛津杯法測定分離獲得菌株對甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性。每杯添加100 μL樣液，以DMSO為陰性對照，含5 μg/mL啶酰菌胺的DMSO為陽性對照，28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察并記錄抑菌圈。

2 結(jié)果與分析

2. 1 無瓣海桑生境根標(biāo)土壤細(xì)菌多樣性

采用6種分離培養(yǎng)基從無瓣海桑生境根際中分離得到97株細(xì)菌，基于形態(tài)特征和16S rRNA基因序列分析排重，獲得57株不同細(xì)菌，隸屬于4門5綱9目15科21屬，詳見表1。其中，放線菌門包含20株，厚壁菌門包含19株，變形菌門包含15株（7株隸屬α-變形菌綱，8株隸屬γ-變形菌綱），擬桿菌門包含3株，分別占菌株總數(shù)（57株）的35.09%、33.33%、26.32%和5.26%。

基于16S rRNA基因序列比對分結(jié)果析（圖1）可知，從無瓣海桑根際中分離獲得的菌株BGMRC 0127（約1500 bp），與最接近菌種C. gandavensis R-4069T（AJ289162）的相似性為96.67%，基于16S rRNA基因序列鑒定新菌的原則（Keswani and Whitman，2001），確定BGMRC 0127為1株潛在的新菌。在與假單胞菌科中鄰近菌株構(gòu)建的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也發(fā)現(xiàn)，其與相似菌株在進(jìn)化樹上聚為一簇，且Maximum-likelihood和Maximum-parsimony法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也獲得相同結(jié)果。初步確定BGMRC 0127為假單胞菌科中1個潛在的新分類單元。進(jìn)一步確定菌株BGMRC 0127的分類學(xué)地位，還需對該株潛在新菌展開多相分類學(xué)研究。

2. 2 根際細(xì)菌在各分離培養(yǎng)基的分布情況

采用6種分離培養(yǎng)基從無瓣海桑根際中分離獲得97株細(xì)菌，不同培養(yǎng)基分離效果見圖2。6種分離培養(yǎng)基的分離效果顯示：M6（1/10的AGG培養(yǎng)基成分，寡營養(yǎng)）分離得到的物種最豐富，共有10個屬；而2216E（酵母提取粉為主要成分，營養(yǎng)較豐富）僅分離獲得4個屬，且芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬?？梢?，M6培養(yǎng)基上分離到細(xì)菌種類豐富，可作為分離紅樹林土壤中細(xì)菌的首選培養(yǎng)基。

2. 3 抑菌活性篩選結(jié)果

對57株細(xì)菌發(fā)酵液提取物進(jìn)行抗菌活性篩選，結(jié)果（圖3和表2）顯示，有29株細(xì)菌具有抑制甘蔗鞭黑粉菌活性，總陽性率為50.88%，抑菌圈直徑范圍為7.54～21.81 mm。其中， 12株細(xì)菌能抑制甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長，占活性菌株總數(shù)的41.38%，抑菌圈直徑范圍為7.54～16.85 mm；14株細(xì)菌能抑制甘蔗鞭黑粉菌“+”擔(dān)孢子增殖，占活性菌株總數(shù)的48.28%，抑菌圈直徑范圍為10.90～21.81 mm；14株細(xì)菌能抑制甘蔗鞭黑粉菌“-”擔(dān)孢子增殖，占活性菌株總數(shù)的48.28%，抑菌圈直徑范圍為10.35～18.50 mm。此外，有9株細(xì)菌能同時抑制2～3種甘蔗鞭黑粉菌的形態(tài)，即菌絲生長、“-”擔(dān)孢子增殖、“+”擔(dān)孢子增殖。以含5 μg/mL啶酰菌胺的DMSO為陽性對照，其抑菌圈直徑為17.50～23.00 mm；而以DMSO作陰性對照未出現(xiàn)抑菌圈。

3 討論

紅樹植物生長在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶上，海岸潮間帶具有高度鹽漬化、氧氣稀少、強光輻射及周期性海水浸泡等特征，為特色微生物資源提供了巨大的生存空間（Takahashi and Omura，2003）。大量研究報道指出，通過宏基因組技術(shù)分析，已獲取大量來源于紅樹林的微生物菌落結(jié)構(gòu)和生物功能信息，在實驗室分離培養(yǎng)紅樹植物中的微生物，僅獲得1%的可培養(yǎng)微生物（郭凱旋等，2012；盧乃會等，2013；Santoferrara et al.，2014；林巧玲等，2017）。就目前的技術(shù)而言，傳統(tǒng)分離方法是獲取微生物次級代謝產(chǎn)物及其生物合成途徑或代謝通路的關(guān)鍵（Zengler et al.，2002）。本研究選用廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)內(nèi)無瓣海桑根際作為研究對象，分離獲得57株細(xì)菌，隸屬于4門5綱9目15科21屬。李菲等（2016）從茅尾海無瓣海桑根部中分離得到12株內(nèi)生細(xì)菌，隸屬于7科9屬。從分離獲得的細(xì)菌數(shù)量和種類來看，根部土壤中分離獲得的細(xì)菌均遠(yuǎn)高于根部來源的內(nèi)生細(xì)菌，其可能原因是土壤環(huán)境受到植物生長的影響，使得土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生改變（殷萌清等，2017；張永夏等，2017），受植被影響的土壤環(huán)境中微生物群落多樣性比其他未受植被影響的土壤環(huán)境中微生物群落多樣性豐富。

從茅尾海無瓣海桑根際土壤中分離獲得1株Cellvibrio sp.的潛在新菌，其與最近菌株[C. gandavensis R-4069T（AJ289162）]的16S rRNA基因序列相似性低于97.00%?？咕钚詸z測結(jié)果顯示，有29株細(xì)菌具有抑制甘蔗鞭黑粉菌活性，總陽性率為50.88%。如BGMRC 0101、BGMRC 0143和BGMRC 0073均隸屬于Streptomyces sp.，對甘蔗鞭黑粉菌具有明顯活性，其中BGMRC 0101對甘蔗鞭黑粉菌菌絲和“-”擔(dān)孢子表現(xiàn)出抑制活性，BGMRC 0143對甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”擔(dān)孢子表現(xiàn)出抑制活性，BGMRC 0073對甘蔗鞭黑粉菌菌絲和“+”擔(dān)孢子表現(xiàn)出抑制活性?？梢姡钚跃昱c非活性菌株隸屬相同門級，相同科級，甚至是相同屬級，其抑菌效果也不完全相同。這種差異在一定程度上說明生存環(huán)境是自然選擇的一個動力，盡管生存環(huán)境相同，菌株也會因結(jié)構(gòu)和功能不同而產(chǎn)生代謝差異。因此，下一步需對潛在新菌開展多相分類鑒定，并對生物活性良好的菌株進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，研究其抑菌機理，以期為新型生物農(nóng)藥的研制提供更多參考依據(jù)。

4 結(jié)論

廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)內(nèi)無瓣海桑根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌具有豐富的物種多樣性，并從中挖掘出1株疑是Cellvibrio sp.的潛在新菌，同時挖掘出多株能抑制甘蔗鞭黑粉菌活性的菌株，為進(jìn)一步研究紅樹植物根際土壤中細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物及研發(fā)新型高效生物農(nóng)藥打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

常濤，吳志強，黃亮亮，耿俊杰，朱召軍，武文麗. 2015. 茅尾海紅樹林水域仔稚魚群落結(jié)構(gòu)及與主要環(huán)境因子關(guān)系[J]. 應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報，34（2）：219-226. [Chang T，Wu Z Q，Huang L L，Geng J J，Zhu Z J，Wu W L. 2015. Community structures of fish larvae and its relation with environmental factors in the mangrove of Maoweihai Bay[J]. Journal of Applied Oceanography，34（2）：219-226.]

郭凱旋. 2012. 紅樹植物內(nèi)生細(xì)菌的種群數(shù)量周年變化、鹽度適應(yīng)性及抗菌活性研究[D]. 湛江：廣東海洋大學(xué). [Guo K X. 2012. Annual variation in population densities，adaptability to salinity and antimicrobial activity of endophytic bacteria from mangrove plants[D]. Zhanjiang：Guangdong Ocean University.]

李菲，高程海，竺利波，余煉，覃媚，顏棟美. 2016. 茅尾海無瓣海桑內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其細(xì)胞毒活性[J]. 微生物學(xué)報，56（4）：689-697. [Li F，Gao C H，Zhu L B，Yu L，Qin M，Yan D M. 2016. Diversity and cytotoxic activity of endophytic bacteria isolated from Sonneratia apetala of Maowei Sea[J]. Acta Microbiologica Sinica，56（4）：689-697.]

李菲，黃庶識，王偉，江蕾，米順利，余煉. 2018. 海綿Pseudoceratina sp.共棲細(xì)菌多樣性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性研究[J]. 廣西科學(xué)，25（1）：87-93. [Li F，Huang S S，Wang W，Jiang L，Mi S L，Yu L. 2018. Diversity of sponge-derived bacteria isolated from Pseudoceratina sp. against Sporisorium scitamineum in vitro[J]. Guangxi Sciences，25（1）：87-93.]

李倩茹，符夏梨. 2009. 紅樹林土壤微生物與土壤酶活性分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，36（7）：93-96. [Li Q R， Fu X L. 2009. Soil microorganisms and activity of soil enzymes in mangrove[J]. Guangdong Agricultural Sciences，36（7）：93-96.]

李小群，李菲，李家怡，顏棟美，蘇志維，高程海. 2017. 海芒果可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定及其抑制海洋魚類致病菌活性研究[J]. 廣西科學(xué)院學(xué)報，33（2）：108-113. [Li X Q，Li F，Li J Y，Yan D M，Su Z W，Gao C H. 2017. Identification and inhibition activity inhibit fish pathogens of cultivated bacteria isolated from Cerbera manghas[J]. Journal of Guangxi Academy of Sciences，33（2）：108-113.]

李逾. 2012. 三種紅樹植物共附生放線菌的分離及其抗病毒活性菌株的篩選[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué). [Li Y. 2012. Isolation and screening anti-viral actinomycetes from three mangrove[D]. Haikou：Hainan University.]

梁碧怡，陸羽，王軍，周翔，劉嵐，林永成. 2012. 廣東沿海原生態(tài)紅樹林環(huán)境放線菌分離及抗分枝桿菌活性評價[J]. 海洋通報，31（3）：314-319. [Liang B Y，Lu Y，Wang J，Zhou X，Liu L，Lin Y C. 2012. Isolation and screening of actinomycetes aginst Mycobacterium in Guangdong intact mangrove[J]. Marine Science Bulletin，31（3）：314-319.]

林巧玲，嚴(yán)玉寧，何紅，孫興濤，楊定祥. 2017. 紅樹植物老鼠簕內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的時空動態(tài)變化[J]. 微生物學(xué)通報，44（9）：2037-2042. [Lin Q L，Yan Y N，He H，Sun X T，Yang D X. 2017. Spatiotemporal dynamic of endophytic bacteria numbers in Acanthus illicifolius[J]. Microbiology China，44（9）：2037-2042.]

盧乃會，嚴(yán)玉寧，何紅，盧仕嚴(yán)，黃勤知. 2013. 紅樹植物秋茄內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量時空變化動態(tài)初步研究[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，33（4）：7-10. [Lu N H，Yan Y N，He H，Lu S Y，Huang Q Z. 2013. Spatiotemporal dynamic of endophytic bacteria in Kandelia candel[J]. Journal of Guangdong Ocean University，33（4）：7-10.]

繆承杜，莊令，林海鵬，洪葵. 2008. 海南文昌清瀾港紅樹林真菌抗B16腫瘤細(xì)胞活性菌株的篩選[J]. 生物工程學(xué)報，24（6）：975-979. [Miao C D，Zhuang L，Lin H P，Hong K. 2008. Screening of cytotoxic activity against B16 tumor cell of mangrove fungi isolate from Qinglan Harbor in Hainan[J]. Chinese Journal of Biotechnology，24（6）：975-979.]

孫靜，王素英，張德超. 2014. 海南紅樹林根系土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性分析[J]. 海洋科學(xué)，38（7）：27-33. [Sun J，Wang S Y，Zhang D C. 2014. Diversity of culturable bacteria from the soil of root system of mangrove forest of Beigang Island in Hainan Province[J]. Marine Sciences，38（7）：27-33.]

吳家法，吳思婷，李智鳴，肖尚榮，吳霜，張政，楊立芳，龍寒，禤金彩，姜明國. 2017. 茅尾海紅樹林土壤可培養(yǎng)放線菌多樣性及其抗尖孢鐮刀菌活性分析[J]. 中國抗生素雜志，42（4）：294-301. [Wu J F，Wu S T，Li Z M，Xiao S R，Wu S，Zhang Z，Yang L F，Long H，Xuan J C，Jiang M G. 2017. Biodiversity and screening of culturable actinobacteria against Fusarium oxysporum isolated from mangrove soil in Maowei sea[J]. Chinese Journal of Antibiotics，42（4）：294-301.]

夏麗娟，張焜，黃華容，張占生. 2014. 5種紅樹根際土壤真菌和內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，30（4）：259-263. [Xia L J，Zhang K，Huang H R，Zhang Z S. 2014. The antimicrobial activity of 5 kinds of mangrove fungi in Rhizosphere soil and endophytic fungi[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，30（4）：259-263.]

殷萌清，馮建祥，黃小芳，蔡中華，林光輝，周進(jìn). 2017. 天然及人工紅樹林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 生態(tài)科學(xué)，36（5）：1-10. [Yin M Q，F(xiàn)eng J X，Huang X F，Cai Z H，Lin G H，Zhou J. 2017. Soil microbial community structure in natural and transplanted mangrove（Kandelia obovata） forests[J]. Ecological Science，36（5）：1-10.]

張偲，張長生，田新朋，王發(fā)左，李杰. 2010. 中國海洋微生物多樣性研究[J]. 中國科學(xué)院院刊，25（6）：651-658. [Zhang S，Zhang C S，Tian X P，Wang F Z，Li J. 2010. The study of diversities of marine microbes in China[J]. Bulletin of the Chinese Academy of Sciences，25（6）：651-658.]

張永夏，王艷枝，王偉，李樂興，陳紅鋒. 2017. 東江虎門入?？诩t樹林的群落特征及生態(tài)恢復(fù)[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，29（2）：40-44. [Zhang Y X，Wang Y Z，Wang W，Li L X，Chen H F. 2017. Community characteristics and ecological restoration of mangrove at estuary of Dongjiang River in Humen[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，29（2）：40-44.]

周雙清，黃小龍，黃東益，胡新文，陳吉良. 2010. Chelex-100快速提取放線菌DNA作為PCR擴增模板[J]. 生物技術(shù)通報，26（2）：123-125. [Zhou S Q，Huang X L，Huang D Y，Hu X W，Chen J L. 2010. A rapid method for extrac-ting DNA from actinomycetes by Chelex-100[J]. Biotechnology Bulletin，26（2）：123-125.]

Keswani J，Whitman W B. 2001. Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology，51（2）：667-678.

Santoferrara L F，Grattepanche J D，Katz L A，Mcmanus G B. 2014. Pyrosequencing for assessing diversity of eukaryotic microbes： Analysis of data on marine planktonic ciliates and comparison with traditional methods[J]. Environmental Microbiology，16（9）：2752-2763.

Takahashi Y，Omura S. 2003. Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds[J]. Journal of General and Applied Microbiology，49（3）：141.

Tamura K，Peterson D，Peterson N，Stecher G，Nei M，Kumar S. 2011. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，28（10）：2731-2739.

Zengler K，Toledo G，Rappe M，Elkins J，Mathur E J，Short J M，Keller M. 2002. Cultivating the uncultured[J]. Procee-dings of the National Academy of Sciences of the United States of America，99（24）：15681-15686.

（責(zé)任編輯 羅 麗）