基于SSR熒光標(biāo)記的MCID快速鑒定13個(gè)湖北茶樹(shù)品種

黃丹娟　馬建強(qiáng)　馬春雷　王松琳　陳亮　毛迎新　陳勛

摘要：【目的】通過(guò)人工繪制品種鑒別圖（Manual cultivar identification diagram，MCID）快速區(qū)分鑒別湖北茶樹(shù)品種，為湖北茶樹(shù)種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、品種保護(hù)及苗木純度早期鑒定提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳院笔?3個(gè)優(yōu)良茶樹(shù)品種為材料，利用30對(duì)均勻分布于遺傳連鎖圖譜上的SSR熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物以篩選出核心引物，利用MCID法構(gòu)建CID圖譜?！窘Y(jié)果】30對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出145個(gè)等位基因，各引物等位基因數(shù)為3～9個(gè)，平均每對(duì)引物為4.83個(gè)；共檢測(cè)到194個(gè)基因型，各引物檢測(cè)出的基因型為3～12個(gè)，平均每對(duì)引物6.47個(gè)；多態(tài)性信息量（PIC）為0.29～0.85，平均為0.58。13個(gè)茶樹(shù)品種的Neis遺傳距離為0.19～0.44?；贜eis遺傳距離，采用Neighbor-Joining（NJ）法可將13個(gè)品種分為三大類(lèi)（Neis遺傳距離為0.16），結(jié)果表明地理來(lái)源相同的品種可能因?yàn)榫哂邢嗨频倪z傳背景而聚在一起，也可能因?yàn)橛H本來(lái)源不同而存在明顯的遺傳差異。利用篩選出的3對(duì)核心引物（TM547、TM552和TM107）可快速鑒別所有參試品種，通過(guò)MCID法構(gòu)建的CID圖譜可直觀看出各參試茶樹(shù)品種鑒定所需要的引物及其對(duì)應(yīng)的基因型?！窘Y(jié)論】基于SSR熒光標(biāo)記的茶樹(shù)品種MCID鑒定方法具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，可用于湖北茶樹(shù)良種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、苗期鑒定及品種區(qū)分。

關(guān)鍵詞： 茶樹(shù)；品種鑒定；SSR熒光標(biāo)記；人工繪制品種鑒別圖（MCID）；湖北

中圖分類(lèi)號(hào)： S571.103.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）06-1045-08

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for the evaluation of Hubei tea germplasm resources， protection of varieties and early identification of the purity of seedlings， manual cultivar identification diagram （MCID） was constructed to quickly distinguish and identify Hubei tea cultivars. 【Method】Thirty pairs of fluorescent SSR markers distributed evenly on the genetic linkage group were used to carried out PCR amplification of thirteen Hubei fine tea cultivars. Fluorescence labeled capillary electrophoresis was used to detect the amplification products and screen the core pri-mers. The cultivar identification diagram（CID） was drawn by MCID method. 【Result】Thirty pairs of SSR primers amplified 145 alleles， ranging from 3 to 9 alleles for each primer， with an average of 4.83. A total of 194 genotypes were detec-ted， and the genotypes detected by each primer were 3 to 12 with an average of 6.47. The range of polymorphism information content（PIC） was 0.29-0.85 with an average of 0.58. Relationship analysis showed that Neis genetic distance of the 13 tea cultivars was 0.19-0.44，and were classified into three groups by Neighbor-Joining（NJ） method based on Neis genetic distance（Neis genetic distance was 0.16）. It indicated that cultivars with the same geographical origin may grouped due to similar genetic backgrounds， or may also show great differences because of their different parental origin. Three pairs of SSR primers， TM547， TM552 and TM107， could rapidly identify all the tested cultivars. According to the CID map constructed by MCID method， the primers needed for the identification of various tea cultivars and their correspon-ding genotypes could be seen directly. 【Conclusion】The MCID method based on fluorescent SSR markers is rapid， accurate and efficient in identification of tea cultivars. It can support the intellectual property protection， seedling appraisal and variety identification of Hubei fine tea cultivars.

Key words： tea； cultivar identification； fluorescent SSR markers； manual cultivar identification diagram（MCID）； Hubei

0 引言

【研究意義】茶樹(shù)[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]為山茶科山茶屬灌木或小喬木，經(jīng)長(zhǎng)期人工和自然選擇形成了具有穩(wěn)定及遺傳特性豐富多樣的品種資源。湖北省種茶歷史悠久，自然條件優(yōu)越，茶產(chǎn)業(yè)已成為宜昌、恩施等山地丘陵地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。目前，湖北省通過(guò)國(guó)家級(jí)審（認(rèn)、鑒）定的茶樹(shù)品種有4個(gè)，通過(guò)省級(jí)審（認(rèn)、鑒）定的茶樹(shù)品種有14個(gè)，其中1個(gè)獲得植物新品種權(quán)。隨著湖北省茶樹(shù)栽培面積的不斷擴(kuò)大，越來(lái)越多的省內(nèi)優(yōu)良品種應(yīng)用于茶樹(shù)生產(chǎn)（陳勛和龔自明，2017）。由于茶樹(shù)幼苗主要通過(guò)無(wú)性繁殖獲得，在母本枝條扦插、轉(zhuǎn)移、運(yùn)輸和種植過(guò)程中極易造成品種混亂。因此，建立湖北省茶樹(shù)品種快速可靠的鑒定技術(shù)對(duì)茶樹(shù)良種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)、苗期鑒定、品種區(qū)分及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)品種鑒定法難以鑒別遺傳背景相似、親緣關(guān)系較近的植物品種。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了從DNA分子水平上穩(wěn)定可靠地鑒定植物品種（Mukhopadhyay et al.，2016；張洪源等，2017）。其中，SSR標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、數(shù)量豐富、呈共顯性且廣泛分布于基因組等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定及系譜分析（Yao et al.，2012；黃丹娟等，2016；Chang et al.，2017），也是目前分子指紋圖譜研究中應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記（賀爾奇等，2016）。劉本英等（2012）利用22個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)28份云南無(wú)性系茶樹(shù)品種進(jìn)行了DNA指紋圖譜分析，通過(guò)不同基因型組合，各品種均獲得一個(gè)22位數(shù)的指紋圖譜編號(hào)，可將不同品種或無(wú)性系完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。章志芳和馬建強(qiáng)（2012）采用EST-SSR標(biāo)記對(duì)14個(gè)來(lái)自不同省份的茶樹(shù)品種進(jìn)行DNA指紋鑒定，將4個(gè)核心標(biāo)記擴(kuò)增的等位基因譜帶組合轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)化的數(shù)字編號(hào)，繪制成可視化條形碼，結(jié)果顯示各品種均有唯一的指紋圖譜，可快速地鑒定參試品種。郭燕等（2016）利用篩選出的4對(duì)核心標(biāo)記，構(gòu)建了貴州古茶樹(shù)種質(zhì)資源的分子指紋圖譜，各種質(zhì)均獲得一個(gè)18位數(shù)的指紋圖譜編號(hào)，可用于貴州古茶樹(shù)資源的保護(hù)及開(kāi)發(fā)利用研究。Wang等（2016）利用SSR熒光標(biāo)記電泳檢測(cè)技術(shù)，從33對(duì)SSR引物中篩選出6對(duì)核心引物，通過(guò)人工繪制品種鑒別示意圖（MCID）構(gòu)建了66個(gè)來(lái)自不同省份的茶樹(shù)品種鑒別圖（CID），從中可直觀地看出鑒定各品種所需要的SSR引物及其基因型。陳志輝等（2017）從38對(duì)SSR引物中篩選出7對(duì)擴(kuò)增條帶少、多態(tài)性高的引物，利用其構(gòu)建了43個(gè)福建茶樹(shù)品種的DNA指紋圖譜，可清楚地區(qū)分各參試品種。王松琳等（2018）從62對(duì)SSR引物中篩選出3對(duì)核心引物，利用其構(gòu)建了16個(gè)白化、黃化茶樹(shù)品種的DNA指紋圖譜，結(jié)果表明，SSR標(biāo)記在白化、黃化茶樹(shù)品種的鑒定方面具有很好的適用性。綜上所述，大多數(shù)研究均基于SSR引物的擴(kuò)增譜帶轉(zhuǎn)化成DNA指紋圖譜而實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量茶樹(shù)品種進(jìn)行鑒定，但其缺點(diǎn)是無(wú)法直觀顯示鑒別過(guò)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)MCID可直觀顯示鑒別過(guò)程，找出各參試茶樹(shù)品種鑒定所需要的引物及其對(duì)應(yīng)的基因型，從而快速鑒定出茶樹(shù)品種（Wang et al.，2011；許園園等，2016）。但目前鮮見(jiàn)基于SSR熒光標(biāo)記的MCID快速鑒定湖北茶樹(shù)品種的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用30對(duì)均勻分布于茶樹(shù)遺傳連鎖圖譜上的SSR熒光標(biāo)記引物，對(duì)13個(gè)湖北茶樹(shù)優(yōu)良品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，從中篩選出核心引物，并利用MCID構(gòu)建CID圖譜，以期對(duì)13個(gè)茶樹(shù)品種在分子水平上進(jìn)行快速準(zhǔn)確區(qū)分，為湖北茶樹(shù)種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、品種保護(hù)和苗木純度早期鑒定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

采集中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃茶樹(shù)健康葉片，液氮冷凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參試的茶?shù)品種名稱(chēng)及遺傳背景見(jiàn)表1。SSR熒光引物由上海祥音生物科技有限公司合成。KAPA2G Fast Multiplex Mix購(gòu)自北京普凱瑞生物科技有限公司。主要設(shè)備儀器：PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad，美國(guó)）、高速大容量冷凍離心機(jī)（Beckman，美國(guó)）、ND-1000超微量分光光度計(jì)（Nanodrop，美國(guó)）和ABI 3730XL測(cè)序儀（ABI，美國(guó)）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采用改進(jìn)的CTAB法（馬建強(qiáng)，2013）提取樣品基因組DNA，并用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，用ND-1000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。

1. 2. 2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) 30對(duì)SSR熒光引物的相關(guān)信息參考Ma等（2014）的文獻(xiàn)報(bào)道。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：20 ng/μL DNA模板1.0 μL，KAPA2G Fast Multiplex Mix 12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃ 30 s，52～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ?xì)管電泳檢測(cè)參照黃丹娟（2016）的方法。

1. 2. 3 SSR引物多態(tài)性分析 采用PowerMarker統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物在13個(gè)茶樹(shù)品種中擴(kuò)增等位基因數(shù)（Na）、基因型數(shù)和多態(tài)性信息量（PIC）（Liu and Muse，2005）等，并計(jì)算各品種間的Neis遺傳距離?；贜eis遺傳距離進(jìn)行Neighbor-Joining聚類(lèi)分析。按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選茶樹(shù)品種鑒定的SSR核心引物：（1）3≤等位位點(diǎn)數(shù)≤5；（2）5≤基因型數(shù)≤10；（3）4≤重復(fù)堿基個(gè)數(shù)≤6；（4）PIC≥0.5（王讓劍等，2016）。

1. 2. 4 CID圖譜繪制 根據(jù)SSR擴(kuò)增圖譜，統(tǒng)計(jì)某一引物PCR擴(kuò)增的13個(gè)茶樹(shù)品種條帶大小和基因型，將相同擴(kuò)增譜帶的品種歸為一組，無(wú)此譜帶的歸為另一組。然后繼續(xù)添加引物逐步進(jìn)行鑒別，直至將所有參試品種均清晰地區(qū)分開(kāi)來(lái)。最后，根據(jù)每步完成的鑒別結(jié)果，人工繪制CID圖譜，將每一步所用的引物及多態(tài)性譜帶大?。╞p）同時(shí)標(biāo)到CID圖譜的相應(yīng)位置上。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SSR引物多態(tài)性分析結(jié)果

由表2可知，30對(duì)SSR引物從13個(gè)茶樹(shù)品種中共擴(kuò)增出145個(gè)等位基因，各引物擴(kuò)增出的等位基因個(gè)數(shù)為3～9個(gè)，平均每對(duì)引物為4.83個(gè)；共檢測(cè)到194個(gè)基因型，各引物檢測(cè)出的基因型為3～12個(gè)，平均每對(duì)引物為6.47個(gè)；各引物擴(kuò)增的PIC為0.29～0.85，平均為0.58，其中多態(tài)性較低（PIC<0.25）的引物數(shù)量為0對(duì)，多態(tài)性適中（0.250.50）的引物數(shù)量24對(duì)（占所有引物總數(shù)的80%），尤其以TM400引物的PIC最高，為0.85，擴(kuò)增得到等位基因9個(gè)，基因型個(gè)數(shù)12個(gè)。可見(jiàn)，本研究選用的30對(duì)SSR引物多態(tài)性豐富，在品種鑒定方面具有較高的應(yīng)用潛力。以TM551為例，由圖1可知，TM551在鄂茶4號(hào)、鄂茶5號(hào)和鄂茶12號(hào)檢測(cè)出帶型分別為132 bp+138 bp、126 bp+132 bp和120 bp+126 bp，電泳結(jié)果清晰明確，可直觀地將3個(gè)品種區(qū)分開(kāi)。

2. 2 親緣關(guān)系分析結(jié)果

基于30對(duì)SSR多態(tài)性引物的擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算Neis遺傳距離，發(fā)現(xiàn)13個(gè)茶樹(shù)品種的Neis遺傳距離為0.19～0.44（表3）。其中，五峰310與五峰212遺傳距離最遠(yuǎn)，其原因是二者均由五峰當(dāng)?shù)厝后w種中選育而來(lái)，遺傳背景較近；鄂茶1號(hào)與鄂茶3號(hào)遺傳距離最遠(yuǎn)，其原因可能是鄂茶1號(hào)為父母本均為福建省選育的品種，而鄂茶3號(hào)是在湖北咸寧當(dāng)?shù)厝后w種中選育而來(lái)，地理來(lái)源較遠(yuǎn)。

基于Neis遺傳距離，對(duì)13個(gè)茶樹(shù)品種進(jìn)Neighbor-Joining聚類(lèi)分析。從圖2可看出，當(dāng)Neis遺傳距離為0.16時(shí)，13個(gè)茶樹(shù)品種聚為三大類(lèi)。第Ⅰ大類(lèi)包括鄂茶1號(hào)、鄂茶12號(hào)和鄂茶6號(hào)，均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所育成，其中鄂茶1號(hào)和鄂茶12號(hào)聚為同一個(gè)亞類(lèi)，親緣關(guān)系較近，其原因是二者均為福鼎大白茶的后代。第Ⅱ大類(lèi)包括鄂茶7號(hào)、鄂茶3號(hào)、鄂茶2號(hào)、五峰212、五峰310和金茗1號(hào)，主要是從咸寧和五峰當(dāng)?shù)厝后w種中選育而成，且地理來(lái)源相同的品種聚在同一個(gè)亞類(lèi)。第Ⅲ大類(lèi)包括鄂茶4號(hào)、鄂茶5號(hào)、鄂茶9號(hào)和鄂茶11號(hào)，其中鄂茶4號(hào)和鄂茶9號(hào)均從宜昌大葉種及其群體中選育而成，與由勁峰種自然雜交后代中選育而成的鄂茶5號(hào)聚在同一亞類(lèi)，從龍井43自然雜交后代中選育而成的鄂茶11號(hào)則單獨(dú)為一個(gè)亞類(lèi)?？梢?jiàn)，地理來(lái)源相同的品種可能因?yàn)榫哂邢嗨频倪z傳背景而聚在一起，也可能因?yàn)橛H本來(lái)源不同而存在較大的遺傳差異。

2. 3 SSR分子標(biāo)記鑒定及CID圖譜的構(gòu)建

綜合考慮30對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果，以雜峰少為基本原則，并結(jié)合PIC、等位基因和基因型個(gè)數(shù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，選取3對(duì)核心引物TM547、TM552和TM107，用于區(qū)分鑒別所有參試品種。根據(jù)3對(duì)核心引物擴(kuò)增出的相應(yīng)譜帶信息，構(gòu)建13個(gè)湖北茶樹(shù)品種的CID圖譜，如圖3所示。引物TM547擴(kuò)增的DNA電泳圖譜可將13個(gè)茶樹(shù)品種分為五組，第一組包括4個(gè)品種，帶型為110 bp，表明TM547在這4個(gè)品種擴(kuò)增出的等位基因均為純合；第二組和第四組均只有一個(gè)品種，分別為鄂茶6號(hào)和鄂茶2號(hào)，帶型為98 bp+116 bp和98 bp+104 bp，表明僅使用引物TM547即可將鄂茶6號(hào)和鄂茶2號(hào)鑒定出；第三組包括2個(gè)品種，帶型為110 bp+116 bp，第五組包括5個(gè)品種，帶型為104 bp+110 bp。即利用引物TM547尚無(wú)法鑒別出所有參試品種。利用TM552進(jìn)一步鑒定第一組、第三組和第五組的品種，結(jié)果顯示，第一組的4個(gè)品種可全部鑒定出，帶型分別為197 bp、192 bp+202 bp、187 bp+192 bp和187 bp+202 bp；第三組的2個(gè)品種也可鑒定出，帶型為192 bp+197 bp和187 bp+192 bp；第五組的5個(gè)品種中僅五峰310在192 bp處出現(xiàn)特征譜帶，可鑒定出，其余4個(gè)品種仍無(wú)法鑒定。最后，利用引物TM107鑒定第五組的4個(gè)品種，結(jié)果顯示，這4個(gè)品種在146 bp+156 bp、141 bp、141 bp+156 bp和156 bp處均出現(xiàn)特征譜帶，均可被鑒定出。綜上所述，根據(jù)構(gòu)建的CID圖譜可直觀看出各參試茶樹(shù)品種鑒定所需要的引物及其對(duì)應(yīng)的基因型，從而快速鑒定出茶樹(shù)品種。

3 討論

茶樹(shù)品種鑒定經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子標(biāo)記等發(fā)展過(guò)程。其中，分子標(biāo)記鑒定的準(zhǔn)確性高，實(shí)用性強(qiáng)，尤其是SSR標(biāo)記技術(shù)優(yōu)勢(shì)更突出，已廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域。長(zhǎng)期以來(lái)，SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)多采用聚丙烯酰氨凝膠電泳，但其存在較大缺陷，如無(wú)法顯示產(chǎn)物片段的具體大小，在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析中存在分析通量較低、數(shù)據(jù)記錄工作量過(guò)大等問(wèn)題（郝晨陽(yáng)等，2005）。為了避免這些缺陷對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)造成的誤差，本研究采用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)，與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，該技術(shù)能準(zhǔn)確獲取擴(kuò)增產(chǎn)物大小，并實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)收集和處理自動(dòng)化，具有高效、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)（高源等，2012）。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于茶樹(shù)DNA指紋圖譜的構(gòu)建（Tan et al.，2015；陳世軍等，2017；Liu et al.，2017），但其檢測(cè)成本較聚丙烯酰氨凝膠電泳高，尤其是當(dāng)試驗(yàn)材料數(shù)量較多時(shí)，需要合成大量的SSR熒光引物，消耗成本更大，因此，可根據(jù)實(shí)際情況，綜合考慮兩種檢測(cè)方法。

采用聚丙烯酰氨凝膠電泳和熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳進(jìn)行福建茶樹(shù)品種SSR鑒定，在篩選核心引物時(shí)均以等位基因少、條帶清晰、間隔明顯為原則，淘汰條帶多、密集、多態(tài)性豐富的引物（王讓劍等，2016；陳志輝等，2017）。本研究選用的30對(duì)SSR引物均具有豐富的多態(tài)性，從構(gòu)建的CID圖譜可看出，用其中3對(duì)SSR引物即可區(qū)分所有參試材料，效率較高，其原因是本研究采用的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法分辨率和靈敏度均較高，可檢測(cè)出僅相差1～2個(gè)堿基的等位基因。如果采用聚丙烯酰氨凝膠電泳，由于其分辨率較低，當(dāng)引物擴(kuò)增的等位基因條帶較多或參試品種較多時(shí)，統(tǒng)計(jì)難度較大，易造成誤差。為了將構(gòu)建的CID圖譜廣泛應(yīng)用于茶樹(shù)品種鑒定，本研究采用引物組合法，選擇TM547、TM552和TM107共3對(duì)核心引物進(jìn)行CID圖譜構(gòu)建，其原因是這3對(duì)引物的基序堿基數(shù)分別為6、5和5個(gè)，即使利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，也能得到較清晰易讀的條帶，減少由不同檢測(cè)方法帶來(lái)的等位基因大小和數(shù)量的判讀誤差。

目前，越來(lái)越多的茶樹(shù)優(yōu)良品種或品系來(lái)源于少數(shù)育種骨干親本，在性狀上表現(xiàn)出較高的相似性，僅使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)品種鑒定方法難以進(jìn)行有效區(qū)分（Chen et al.，2007）。此外，構(gòu)建聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖僅顯示品種或種質(zhì)材料間的遺傳關(guān)系，無(wú)法作為品種鑒定的根本依據(jù)。構(gòu)建DNA指紋圖譜可準(zhǔn)確鑒定大量茶樹(shù)品種，但無(wú)法直觀顯示鑒定過(guò)程。隨著品種鑒定方法的發(fā)展和完善，MCID較傳統(tǒng)鑒定方法有了較大突破，即根據(jù)引物擴(kuò)增結(jié)果，具有特異性譜帶的品種被單獨(dú)區(qū)分出來(lái)，其余品種根據(jù)譜帶表現(xiàn)進(jìn)行分組，再通過(guò)其他引物區(qū)別、分組，直到所有品種被鑒定出（張曉瑩等，2012）。Wang等（2016）從33對(duì)SSR引物中篩選出6對(duì)核心引物，構(gòu)建了66個(gè)茶樹(shù)品種的CID圖譜，該圖譜幾乎涵蓋了福建省所有無(wú)性系茶樹(shù)良種（53個(gè)）。本研究通過(guò)3對(duì)引物構(gòu)建了13個(gè)湖北茶樹(shù)品種的CID圖譜，可直觀顯示整個(gè)鑒別過(guò)程，快速找出各參試茶樹(shù)品種鑒定所需要的引物及其對(duì)應(yīng)的基因型。當(dāng)需要將新的茶樹(shù)品種添加到該CID圖譜時(shí)，可利用本研究所使用的3對(duì)引物對(duì)新品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)帶型將其標(biāo)注在CID圖譜的相應(yīng)位置上，以此獲得包括更多茶樹(shù)品種的CID圖譜。如果這30對(duì)引物無(wú)法鑒別新品種，則選用新引物再進(jìn)行區(qū)分。通過(guò)上述方法可快速鑒定不明確的品種，有效打擊茶苗繁殖市場(chǎng)品種假冒行為，保護(hù)育種工作者權(quán)益，對(duì)實(shí)現(xiàn)茶樹(shù)種質(zhì)資源管理、苗木早期純度鑒定及促進(jìn)茶樹(shù)品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)均具有重要意義。

4 結(jié)論

基于SSR熒光標(biāo)記的茶樹(shù)品種MCID鑒定方法具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，可用于湖北茶樹(shù)良種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、苗期鑒定及品種區(qū)分。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）