mmiR936對人喉癌細(xì)胞株Hep2增殖、遷移、侵襲和藥物敏感性的影響

王海峰 李培 王志遠(yuǎn) 林惜君 郭程 葉進(jìn)

【摘要】目的探討微小RNA936（miR936）對人類喉癌細(xì)胞株Hep2增殖、遷移、侵襲和藥物敏感性的影響。方法通過慢病毒感染構(gòu)建miR936過表達(dá)的喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞系（miR936組）及空載對照組（Vector組）。熒光顯微鏡觀察病毒感染效率，實(shí)時熒光定量PCR檢測2組細(xì)胞miR936的表達(dá)量。MTT增殖實(shí)驗分析2組細(xì)胞增殖能力的變化。MTT藥敏實(shí)驗比較2組細(xì)胞藥物敏感性的變化。劃痕實(shí)驗和Transwell小室實(shí)驗分別檢測2組細(xì)胞遷移和侵襲能力，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞骨架變化。結(jié)果miR936組Hep2細(xì)胞的miR936mRNA表達(dá)水平高于Vector組（t=5600，P<005）。miR936組Hep2細(xì)胞增殖能力明顯低于Vector組。培養(yǎng)24h和48h時miR936組Hep2細(xì)胞的遷移能力均低于Vector組（P均<001）；miR936組細(xì)胞的侵襲能力低于Vector組（P<001）；此外，miR936過表達(dá)后Hep2細(xì)胞的微管微絲與Vector組相比減少。藥物敏感實(shí)驗結(jié)果顯示miR936組Hep2細(xì)胞對順鉑和阿霉素的敏感性較Vector組增加（均P<005）。結(jié)論miR936可以抑制Hep2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且能夠增加Hep2細(xì)胞對順鉑和阿霉素的敏感性。

【關(guān)鍵詞】喉腫瘤；微小RNA；增殖；遷移；侵襲；藥物敏感性

EffectsofmicroRNA936ontheproliferation，migration，invasionanddrugsensitivityofhumanlaryngealcancercelllineHep2WangHaifeng，LiPei，WangZhiyuan，LinXijun，GuoCheng，YeJinDepartmentofOtolaryngologyHeadNeckSurgery，theThirdAffiliatedHospitalofSunYatsenUniversity，Guangzhou510630，China

Correspondingauthor，YeJin，Email：yejin_sums@aliyuncom

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofmicroRNA936（miR936）ontheproliferation，migration，invasionanddrugsensitivityofhumanlaryngealcancercelllineHep2MethodsTheHep2celllineoverexpressingmiR936（miR936group）andtheemptyvectorcontrolgroup（vectorgroup）wereconstructedbylentivirusinfectionTheefficiencyofvirusinfectionwasobservedbyfluorescencemicroscopeTheexpressionofmiR936wasdetectedbyRTqPCRMTTproliferationassaywasusedtoanalyzethechangesofcellproliferationinbothgroupsMTTdrugsensitivityassaywasperformedtocomparethechangesofdrugsensitivityinbothgroupsCellmigrationandinvasionabilityintwogroupswasevaluatedbyTranswellchamberassayConfocalmicroscopewasadoptedtoobservethevariationsincellcytoskeletonResultsTheexpressionlevelofmiR936mRNAofHep2cellsinthemiR936groupwassignificantlyhigherthanthatinthevectorgroup（t=5600，P<005）InthemiR936group，theproliferationcapacityofHep2cellswassignificantlylowercomparedwiththatinthevectorgroupThemigrationabilityofHep2cellsinthemiR936groupwassignificantlylowerthanthatinthevectorgroupat24hand48hafterculture（bothP<001）ThecellinvasionabilityinthemiR936groupwasconsiderablylowerthanthatinthevectorgroup（P<001）ThequantityofmicrotubulesofHep2cellswassignificantlyreducedafteroverexpressionofmiR936comparedwiththatinthevectorgroupDrugsensitivitytestdemonstratedthatthesensitivityofHep2cellstocisplatinandadriamycinwassignificantlyincreasedinthemiR936groupcomparedwiththatinthevectorgroup（P<001）ConclusionmiR936caninhibittheproliferation，migrationandinvasionofHep2cells，andcanincreasethesensitivityofHep2cellstocisplatinandadriamycin

【Keywords】Laryngealtumor；MicroRNA；Proliferation；Migration；Invasion；Drugsensitivity

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其中喉鱗狀細(xì)胞癌是其主要病理類型，占90%以上。雖然過去幾十年間喉癌的治療方式獲得了長足的進(jìn)展，但患者五年生存率卻沒有獲得提高，研究顯示1975年～2010年間美國喉癌患者的5年生存率從66%降到63%[12]。喉癌治療以外科手術(shù)為主，放化療是不可或缺的組成部分，近年來新型分子治療成為一種潛在選擇[1]。大量研究表明，諸多因子參與到的喉癌的腫瘤學(xué)進(jìn)程中，探明喉癌的分子機(jī)制對喉癌的早期診斷及研究新的分子靶標(biāo)至為重要[36]。微小RNA（miR）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，它們既可以作為促癌基因也可以作為抑癌基因[78]。近年來，miR在喉癌中的研究越來越多，各種研究表明在喉癌的早期診斷、治療和預(yù)后等方面具有潛在作用[5]。目前miR936偶見于其他腫瘤的報道中，但是尚未見miR936在喉癌中的研究報道，本文主要討論miR936對喉癌細(xì)胞株Hep2的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

Hep2細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100ng/ml）的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以025%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，每1～2d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。

二、質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝

通過將合成好的premiR936（F：CCGGTCAAGGCCACTGGGACAGTAGAGGGAGGAATCGCAGAAATCACTCCAGGAGCAACTGAGAGACCTTCTACTTTACCAGGTCCTGCTGGCCCAGATTTTTG；R：AATTCAAAAATCTGGGCCAGCAGGACCTGGTAAAGTAGAAGCAAGGTCTCTCAGTTGCTCCTGGAGTGATTTCTGCGATTCCTCCCTCTACTGTCCCAGTGGCCTTGA）克隆到慢病毒載體pLKO1GFP質(zhì)粒中，構(gòu)建了miR936慢病毒載體。將pLKO1GFPmiR936與psPAX和pMD2G共轉(zhuǎn)染HEK293T，分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h收集培養(yǎng)液上清。收集濃縮的培養(yǎng)液上清，用濃縮的慢病毒（LentimiR936）溶液感染Hep2細(xì)胞，之后用嘌呤霉素篩選建立Hep2的miR936穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株及對照組細(xì)胞株（pLKO1GFP空載包裝病毒并感染Hep2細(xì)胞），分別稱為miR936組及Vector組。

三、實(shí)時熒光定量PCR（RTqPCR）

采用HiPureTotalRNAMiniKit（Magen）從Hep2細(xì)胞中提取總RNA。采用HiFiscriptcDNAkit（Cwbio）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（miR936逆轉(zhuǎn)錄引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGCGA）。以上所有操作遵照產(chǎn)品說明書。SYBR熒光染料法RTqPCR檢測Hep2miR936穩(wěn)定株中miR936的表達(dá)量，U6作為內(nèi)參RTqPCR引物：miR936（F）：CACGCAACAGTAGAGGGA，miR936（R）：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA；U6（F）：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6（R）：GTGCAGGGTCCGAGGT。反應(yīng)條件：95℃10s；95℃30s，60℃20s（共40個循環(huán)），所有反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔，記錄系統(tǒng)返回的CT值，采用獲得相對定量結(jié)果。引物由SangonBiotech訂購。

四、MTT實(shí)驗

將Hep2細(xì)胞以05×104～1×104/孔的密度接種到96孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，在增殖實(shí)驗中分別在種板4h、24h、48h、72h、96h后加入3（4，5dimethylthiazolyl2）2，5diphenyltetrazoliumbromideMTT（每孔終濃度05mg/ml），培養(yǎng)4h，吸去培養(yǎng)液，加入100μlDMSO。在λ=570nm處測定吸光度。

五、劃痕實(shí)驗

將Hep2細(xì)胞（5×105/孔）接種到六孔培養(yǎng)皿中，直到細(xì)胞80%～90%匯合，吸盡培養(yǎng)液，先在皿底用黑線標(biāo)記，用10μl移液槍吸頭在細(xì)胞單層上垂直于標(biāo)記線劃痕，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次。使細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中遷移24h和48h，分別觀察并拍攝劃痕，選取3張圖片進(jìn)行統(tǒng)計分析，遷移的距離從顯微照片中測量。

六、Transwell小室實(shí)驗

將Hep2細(xì)胞接種在改良的Boyden室（Corning）的上部隔室中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。下室含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中培養(yǎng)24h。擦去膜上表面的細(xì)胞，并將侵入底部的細(xì)胞用10%結(jié)晶紫染色，然后隨機(jī)選取3個不同的視野拍攝并計數(shù)。

七、鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）染色實(shí)驗

將細(xì)胞接種在玻璃蓋板上24h，然后用4%多聚甲醛固定20min，并用01%TritonX100在室溫下透化15min。將蓋玻片在黑暗中用100nM羅丹明鬼筆環(huán)肽在室溫下孵育30min。之后用100nMDAPI核復(fù)染。將蓋玻片在PBS中沖洗并倒置晾干。然后將這些載玻片用中性香脂密封，并在共聚焦顯微鏡下觀察。

八、藥敏實(shí)驗

將Hep2細(xì)胞以05×104～1×104個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育至其貼壁（一般4h），加入所屬濃度梯度的藥，繼續(xù)孵育72h，在光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞狀態(tài)。加入10μlMTT，而后繼續(xù)孵育4h，吸盡培養(yǎng)基，加入50μlDMSO，用搖床緩慢搖10min，待結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀在570nm處檢測其吸光值（OD570）。

九、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS200進(jìn)行分析，正態(tài)分布定量資料用±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、miR936過表達(dá)Hep2細(xì)胞株構(gòu)建

由于構(gòu)建的pLKO1GFPmiR936質(zhì)粒以及空載pLKO1GFP包含熒光基因GFP，成功感染的Hep2細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下能夠產(chǎn)生綠色熒光，未被感染的細(xì)胞則不能產(chǎn)生綠色熒光，因此比較同一光學(xué)顯微鏡視野下白光圖片及熒光圖片中細(xì)胞數(shù)量能夠判斷慢病毒感染效率，miR936組感染效率為92%（細(xì)胞數(shù)量比值，熒光/白光=720/780），Vector組感染效率為091（細(xì)胞數(shù)量比值，熒光/白光=510/560）（圖1A）。RTqPCR結(jié)果顯示，miR936組細(xì)胞的miR936mRNA表達(dá)水平高于Vector組（236±047vs100±010，t=5600，P﹤005），提示miR936過表達(dá)的Hep2穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功（圖1B）。

A：miR936組與Vector組熒光表達(dá)情況；B：miR936組與Vector組RTqPCR檢測miR936的表達(dá)；與Vector組比較，**P<001二、過表達(dá)miR936抑制Hep2細(xì)胞增殖能力

將miR936組和Vector組細(xì)胞等量接種于96孔板，2組細(xì)胞在每個時間點(diǎn)分別設(shè)置3個復(fù)孔，0、4h的MTT結(jié)果顯示2組接種量幾乎一致（t值分別為2451和0324，P均>005），而在48、72、96h，2組出現(xiàn)差異，miR936組細(xì)胞增殖速度低于Vector組（圖2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為4939、6154、3739，P均<005）。

三、miR936抑制Hep2細(xì)胞遷移能力

劃痕后細(xì)胞培養(yǎng)至24、48h，miR936組細(xì)胞的相對劃痕寬度均寬于Vector組（t值分別為8071、6318，P均﹤001），提示miR936過表達(dá)能夠減弱Hep2細(xì)胞的遷移能力，見圖3。

四、miR936抑制hep2細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室實(shí)驗結(jié)果（圖4）顯示，miR936組細(xì)胞的穿膜數(shù)量少于Vector組（t=8342，P<001），提示miR936過表達(dá)能夠減弱Hep2細(xì)胞的侵襲能力。

五、miR936抑制Hep2細(xì)胞表面微管微絲表達(dá)

鬼筆環(huán)肽染色顯示miR936組Hep2細(xì)胞表面

六、miR936增加Hep2細(xì)胞對順鉑和阿霉素的敏感性

與Vector組相比，miR936組Hep2細(xì)胞對順鉑和阿霉素的敏感性增加（圖6），DDP組0～100μm的t值分別為0000，-0456，3389，4057，6925，0826，-2782，2組在1、3、10μm處比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<005）；DOX組0～10μm的t值分別為0000，5181，5598，3112，1610，0437，0831，2組在003、01、03μm處比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<005）。

A：對順鉑的敏感性；B：對阿霉素的敏感性；*P<005，**P<001研究發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，miR936在子宮內(nèi)膜癌（EEC）和舌鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)[910]。在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移組織中也有報道m(xù)iR936呈現(xiàn)高表達(dá)[1112]。另有研究發(fā)現(xiàn)與正常人相比，miR936在肝細(xì)胞癌病人血液細(xì)胞微泡（Microvesicles）中高表達(dá)[1314]。而另一項研究顯示miR936在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（EPLC32M1、A549和801D）和人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系（MiaPaCa2、PANC1和Hs766T）中呈現(xiàn)低表達(dá)[1517]。由此可見，miR936在不同腫瘤及腫瘤細(xì)胞株中可能扮演著不同角色，而其在喉癌中扮演的角色及在喉癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的具體作用尚不可知。

本研究顯示，過表達(dá)的miR936組Hep2細(xì)胞對順鉑和阿霉素的敏感性明顯增加，具體機(jī)制尚不清楚。而Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物斑蝥素（Cantharidin）可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞MCF7中miR936的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)一種對腎細(xì)胞癌細(xì)胞有抑制作用的強(qiáng)心苷類藥物（Amantadig）能夠升高腎細(xì)胞癌細(xì)胞中miR936的表達(dá)[19]。這些研究提示miR936也可能作為抗腫瘤藥物的下游基因發(fā)揮抗腫瘤作用。因此miR936有可能既直接增加腫瘤細(xì)胞對于化療藥物的敏感性，同時也作為抗腫瘤藥物的下游基因發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了進(jìn)一步研究miR936對喉癌細(xì)胞的作用，我們分別進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗、劃痕實(shí)驗、Transwell侵襲實(shí)驗以及鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗。細(xì)胞增殖實(shí)驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR936明顯抑制了Hep2細(xì)胞的增殖能力（與Vector組相比較）。劃痕實(shí)驗和Transwell侵襲實(shí)驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR936能夠明顯抑制Hep2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且在鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)miR936組細(xì)胞表面微管微絲明顯減少。這些結(jié)果提示miR936能夠抑制喉癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，相對于N0期（無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）胃癌組織，miR936在N3期（超過7個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的胃癌組織中明顯低表達(dá)，提示miR936低表達(dá)可能和胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與本研究發(fā)現(xiàn)的miR936能夠抑制喉癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力的結(jié)果相一致。

綜上所述，miR936在不同腫瘤中可能有著不同的作用，本研究發(fā)現(xiàn)并初步驗證了miR936對于喉癌細(xì)胞系Hep2的抑制作用，并從多個方面驗證了miR936作為抑癌基因抑制喉癌細(xì)胞系Hep2的增殖、遷移和侵襲能力，并且增加其藥物敏感性，提示miR936在喉癌治療中可能有潛在的應(yīng)用價值。

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（收稿日期：20180108）